杀菌性-通透性增加蛋白中和内毒素作用的体内外研究
作者:周红 袁建成 周立新 郑江 萧光夏
单位:400038 重庆,第三军医大学烧伤研究所
关键词:
中华医学杂志/990427 革兰阴性(G-)菌感染能导致机体严重的病理改变,而作为G-菌外膜中主要成分的内毒素(endotoxin, LPS)近年来被认为是导致G-菌脓毒症过程中最主要的介质。而存在于人中性粒细胞的杀菌性/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability increasing protein ,BPI)是一种既能杀灭G-菌、又能中和内毒素的蛋白质。为此,作者从猪中性粒细胞中提取纯化BPI,并对BPI的体内外作用进行研究,现将结果报道如下。
一、材料与方法
, 百拇医药
1.材料:LPS O111∶B4:Sigma产品;定量鲎基质显色法试剂盒为上海医用化学研究所产品;人TNF-α酶联检测试剂盒为中国人民解放军军事医学科学院产品;猪源BPI由我室按照Mannion等[1]的方法提取并纯化。
2.方法:(1) BPI结合内毒素能力的测定:将LPS 100 pg与梯度稀释的BPI加于去热原玻璃管中,37 ℃15分钟后,测定内毒素含量。(2) BPI对LPS诱导的肝枯否氏细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌抑制作用的测定:从正常Wistar大鼠中分离纯化肝枯否氏细胞,细胞中加入RPMI 1640和10%自身灭活血清,将一定浓度的细胞加于24孔细胞培养板中,LPS刺激细胞后加入BPI,置37 ℃、CO2孵箱中孵育2小时后取上清测定TNF-α含量。(3) BPI对内毒素血症大鼠的作用研究:健康Wistar大鼠84只,实验前12小时禁食不禁水,随机分为2组。单纯内毒素血症组,待动物麻醉后,尾静脉注射亚致死剂量LPS后,给予适量生理盐水;内毒素血症BPI治疗组在给予LPS后,再按2 mg*kg-1体重的剂量给予猪源BPI。分别于给药完毕后0、0.5、1、2、3、4、5小时活杀各组动物,每个时间点为6只,取血清,测定血清TNF-α、葡萄糖及乳酸浓度。(4)统计学处理:采用t检验进行均数比较。
, 百拇医药
二、结果
1.BPI结合内毒素能力的测定:猪源BPI具有强大的结合LPS的能力,结合力随浓度的增加而增加。当BPI为0.1 μg/mg时,其内毒素含量为(9.9±2.0) ng/ml,当BPI为10 μg/ml时,内毒素含量只有(1.0±0.1) ng/ml。
2.BPI抑制LPS诱导的TNF-α分泌作用:猪源BPI能阻断LPS 诱导的肝枯否氏细胞TNF-α分泌,并呈剂量效应依赖关系(表1)。
表1 BPI抑制LPS诱导的TNF-α释放作用(ng/ml,
±s) 组别
LPS剂量
1 000 ng/ml
, http://www.100md.com
100 ng/ml
10 ng/ml
对照组
910±20
630±70
51±6.9
多粘菌素B
1 μg/ml
563±78
101±45
21±1.5
2 μg/ml
, 百拇医药
502±60
89±38
0
BPI组
0.1 μg/ml
556±82
125±27
0
0.4 μg/ml
520±43
97±36
0
3.BPI对内毒素血症大鼠的作用:血清TNF-α浓度在注入LPS后很快升高,约在2小时达高峰,随后降低;而给予BPI的动物,血清TNF-α升高则不明显(P<0.01) (表2)。血清葡萄糖浓度则在1小时达高峰,随即大幅度下降;而BPI治疗组,葡萄糖水平达到峰值时间延迟至2小时,此后葡萄糖浓度维持在一较高水平(表3)。血清乳酸水平在LPS静脉注入后30分钟即可见到升高,3小时达高峰,而猪源BPI,可使3小时乳酸水平明显低于对照组(P<0.01)。表2 BPI对内毒素血症大鼠血清TNF-α
, 百拇医药
浓度的影响(ng/ml,
±s) 组别
鼠数
BPI注射后时间
0.5h
1h
2h
3h
4h
5h
治疗组
42
<2
, http://www.100md.com
45±13
51±15
52±12
49±12
47±10
对照组
42
<2
84±18
242±25
176±17
152±15
85±11
, 百拇医药
表3 BPI对内毒素血症大鼠血清葡萄糖浓度的
影响(mg/L,
±s)
组别
鼠数
BPI注射后时间
0h
0.5h
1h
2h
3h
4h
, 百拇医药 5h
治疗组
42
19.0
± 1.1
36
±13
37.4
± 5.4
32.1
± 4.1
16.4
± 1.0
, http://www.100md.com
18.2
± 1.2
19.7
± 1.7
对照组
42
19.0
± 1.1
20.7
± 2.0
26
± 5
39.4
, http://www.100md.com
± 3.9
36.7
± 2.5
39.8
± 2.6
35.0
± 3.1
三、讨论
内毒素近年来被认为是导致G-菌脓毒症过程中最主要的介质,它能激活单核—吞噬细胞系统产生一系列炎症因子,如TNF-α、IL-1、IL-6等[2],因此它在G-菌脓毒症过程中的作用越来越受到人们的重视。而BPI作为人体中性粒细胞中自然存在的防御武器,具有直接杀灭G-菌及中和内毒素的作用,其独特的作用及作用机制值得深入研究。
, http://www.100md.com
我们的实验结果表明BPI不仅具有直接结合内毒素的能力,而且可阻止肝枯否氏细胞LPS诱导的TNF-α的分泌,表明BPI可在体外阻断LPS引起的炎症因子的释放。体内实验同样表明BPI能降低LPS引起的TNF-α浓度的升高,减轻大白鼠内毒素血症中葡萄糖代谢的改变,这与文献报道相一致[3]。
由于内毒素血症的治疗在临床上尚无较好的方法,有文献报告使用多粘菌素B可达到部分中和内毒素的作用,但大剂量多粘菌素B毒副作用较大。为此我们比较了BPI与多粘菌素B中和内毒素的能力,结果表明BPI在比多粘菌素B浓度低5~10倍的情况下即可发挥与多粘菌素B类似的阻断TNF-α分泌的作用。
鉴于BPI的体内外作用,在对内毒素血症尚无良策的今天,BPI可能成为一种很有应用前景的蛋白质,值得进一步深入的研究。 参考文献
[1] Mannion BA, Kalatzis ES,Weiss J, et al. Preferential binding of the neutrophil granule derived bactericidal/permeability increasing protein to target bacteria. J Immunol,1989,142:2807-2812.
, 百拇医药
[2] Danner RL, Hosseini JM, Wesley RA, et al. Endotoxemia in human septic shock. Chest ,1991,99:169-175.
[3] Marra MN , Wilde CG ,Collins MS .et al. The role of bactericidal/permeability increasing protein as a natural inhibitor of bacterial endotoxin . J Immunol,1992,148:532-537.
(收稿:1998-06-23 修回:1998-12-16), 百拇医药
单位:400038 重庆,第三军医大学烧伤研究所
关键词:
中华医学杂志/990427 革兰阴性(G-)菌感染能导致机体严重的病理改变,而作为G-菌外膜中主要成分的内毒素(endotoxin, LPS)近年来被认为是导致G-菌脓毒症过程中最主要的介质。而存在于人中性粒细胞的杀菌性/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability increasing protein ,BPI)是一种既能杀灭G-菌、又能中和内毒素的蛋白质。为此,作者从猪中性粒细胞中提取纯化BPI,并对BPI的体内外作用进行研究,现将结果报道如下。
一、材料与方法
, 百拇医药
1.材料:LPS O111∶B4:Sigma产品;定量鲎基质显色法试剂盒为上海医用化学研究所产品;人TNF-α酶联检测试剂盒为中国人民解放军军事医学科学院产品;猪源BPI由我室按照Mannion等[1]的方法提取并纯化。
2.方法:(1) BPI结合内毒素能力的测定:将LPS 100 pg与梯度稀释的BPI加于去热原玻璃管中,37 ℃15分钟后,测定内毒素含量。(2) BPI对LPS诱导的肝枯否氏细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌抑制作用的测定:从正常Wistar大鼠中分离纯化肝枯否氏细胞,细胞中加入RPMI 1640和10%自身灭活血清,将一定浓度的细胞加于24孔细胞培养板中,LPS刺激细胞后加入BPI,置37 ℃、CO2孵箱中孵育2小时后取上清测定TNF-α含量。(3) BPI对内毒素血症大鼠的作用研究:健康Wistar大鼠84只,实验前12小时禁食不禁水,随机分为2组。单纯内毒素血症组,待动物麻醉后,尾静脉注射亚致死剂量LPS后,给予适量生理盐水;内毒素血症BPI治疗组在给予LPS后,再按2 mg*kg-1体重的剂量给予猪源BPI。分别于给药完毕后0、0.5、1、2、3、4、5小时活杀各组动物,每个时间点为6只,取血清,测定血清TNF-α、葡萄糖及乳酸浓度。(4)统计学处理:采用t检验进行均数比较。
, 百拇医药
二、结果
1.BPI结合内毒素能力的测定:猪源BPI具有强大的结合LPS的能力,结合力随浓度的增加而增加。当BPI为0.1 μg/mg时,其内毒素含量为(9.9±2.0) ng/ml,当BPI为10 μg/ml时,内毒素含量只有(1.0±0.1) ng/ml。
2.BPI抑制LPS诱导的TNF-α分泌作用:猪源BPI能阻断LPS 诱导的肝枯否氏细胞TNF-α分泌,并呈剂量效应依赖关系(表1)。
表1 BPI抑制LPS诱导的TNF-α释放作用(ng/ml,
LPS剂量
1 000 ng/ml
, http://www.100md.com
100 ng/ml
10 ng/ml
对照组
910±20
630±70
51±6.9
多粘菌素B
1 μg/ml
563±78
101±45
21±1.5
2 μg/ml
, 百拇医药
502±60
89±38
0
BPI组
0.1 μg/ml
556±82
125±27
0
0.4 μg/ml
520±43
97±36
0
3.BPI对内毒素血症大鼠的作用:血清TNF-α浓度在注入LPS后很快升高,约在2小时达高峰,随后降低;而给予BPI的动物,血清TNF-α升高则不明显(P<0.01) (表2)。血清葡萄糖浓度则在1小时达高峰,随即大幅度下降;而BPI治疗组,葡萄糖水平达到峰值时间延迟至2小时,此后葡萄糖浓度维持在一较高水平(表3)。血清乳酸水平在LPS静脉注入后30分钟即可见到升高,3小时达高峰,而猪源BPI,可使3小时乳酸水平明显低于对照组(P<0.01)。表2 BPI对内毒素血症大鼠血清TNF-α
, 百拇医药
浓度的影响(ng/ml,
鼠数
BPI注射后时间
0.5h
1h
2h
3h
4h
5h
治疗组
42
<2
, http://www.100md.com
45±13
51±15
52±12
49±12
47±10
对照组
42
<2
84±18
242±25
176±17
152±15
85±11
, 百拇医药
表3 BPI对内毒素血症大鼠血清葡萄糖浓度的
影响(mg/L,
组别
鼠数
BPI注射后时间
0h
0.5h
1h
2h
3h
4h
, 百拇医药 5h
治疗组
42
19.0
± 1.1
36
±13
37.4
± 5.4
32.1
± 4.1
16.4
± 1.0
, http://www.100md.com
18.2
± 1.2
19.7
± 1.7
对照组
42
19.0
± 1.1
20.7
± 2.0
26
± 5
39.4
, http://www.100md.com
± 3.9
36.7
± 2.5
39.8
± 2.6
35.0
± 3.1
三、讨论
内毒素近年来被认为是导致G-菌脓毒症过程中最主要的介质,它能激活单核—吞噬细胞系统产生一系列炎症因子,如TNF-α、IL-1、IL-6等[2],因此它在G-菌脓毒症过程中的作用越来越受到人们的重视。而BPI作为人体中性粒细胞中自然存在的防御武器,具有直接杀灭G-菌及中和内毒素的作用,其独特的作用及作用机制值得深入研究。
, http://www.100md.com
我们的实验结果表明BPI不仅具有直接结合内毒素的能力,而且可阻止肝枯否氏细胞LPS诱导的TNF-α的分泌,表明BPI可在体外阻断LPS引起的炎症因子的释放。体内实验同样表明BPI能降低LPS引起的TNF-α浓度的升高,减轻大白鼠内毒素血症中葡萄糖代谢的改变,这与文献报道相一致[3]。
由于内毒素血症的治疗在临床上尚无较好的方法,有文献报告使用多粘菌素B可达到部分中和内毒素的作用,但大剂量多粘菌素B毒副作用较大。为此我们比较了BPI与多粘菌素B中和内毒素的能力,结果表明BPI在比多粘菌素B浓度低5~10倍的情况下即可发挥与多粘菌素B类似的阻断TNF-α分泌的作用。
鉴于BPI的体内外作用,在对内毒素血症尚无良策的今天,BPI可能成为一种很有应用前景的蛋白质,值得进一步深入的研究。 参考文献
[1] Mannion BA, Kalatzis ES,Weiss J, et al. Preferential binding of the neutrophil granule derived bactericidal/permeability increasing protein to target bacteria. J Immunol,1989,142:2807-2812.
, 百拇医药
[2] Danner RL, Hosseini JM, Wesley RA, et al. Endotoxemia in human septic shock. Chest ,1991,99:169-175.
[3] Marra MN , Wilde CG ,Collins MS .et al. The role of bactericidal/permeability increasing protein as a natural inhibitor of bacterial endotoxin . J Immunol,1992,148:532-537.
(收稿:1998-06-23 修回:1998-12-16), 百拇医药