中性粒细胞粘附对烧伤大鼠肺微血管内皮细胞［Ca++］I的影响
作者：方勇 陈玉林 葛绳德 刘世康
单位：200433 上海，第二军医大学附属长海医院烧伤科
关键词：
中华医学杂志/990425 严重烧伤后早期肺组织微血管内有中性粒细胞的粘附贴壁现象，中性粒细胞对肺血管内皮细胞的粘附能使肺血管通透性增加，并依赖于粘附分子的介导[1]。血管通透性增加的机理主要为内皮细胞间隙增加，而这种改变则依赖于内皮细胞内钙离子浓度的增加。本研究则在上述研究的基础上，观察烧伤血清及烧伤后中性粒细胞(PMN)对培养肺微血管内皮细胞胞浆内游离钙浓度([Ca++]i)的影响，并探讨PMN粘附及其粘附分子CD11b/CD18在该影响中的介导作用。
一、材料和方法
1.实验动物：Wistar大鼠，雄性，体重200～220 g，由中国科学院上海分院动物所提供。用于外周血PMN的分离、肺微血管内皮细胞培养和正常或烧伤血清的制备。
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2.主要试剂及仪器：Dextran T500(Pharmacia公司)；Percoll细胞分离液(Pharmacia公司)；D-MEM培养基(GIBCO公司)；MRC-OX42(小鼠抗大鼠CD11b/CD18, 英国MRC公司提供)；Fura-2/AM(美国Sigma公司)；三乙三胺五醋酸(DTPA)Sigma公司；羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)Sigma公司；丙磺舒(上海集成制药厂)；Triton X-100(Sigma公司，上海生化试剂公司分装)；MnCl2(北京化工厂)。平衡液溶液(BSS)：NaCl 140 mmol/L, KCl 5 mmol/L，CaCl2 1.8 mmol/L，MgCl2 1.0 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，Probenecid 1.0 mmol/L，DTPA 40 μmol/L，HEPES 20 mmol/L，pH7.4。荧光分光光度计(日立850型)。
3.实验方法：大鼠PMN的分离、PMEC培养方法见参考文献[1]。PMEC[Ca++]i的具体测定方法见参考文献[2]。
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4.实验分组及设计：实验分为6组，每组大鼠8只。A组：为正常血清组，取已负载Fura-2/AM的肺微血管内皮细胞悬液(106/ml)0.5 ml，加入正常大鼠血清0.5 ml，在37 ℃、5% CO2下孵育0.5小时测定F值，加入Triton X-100，测定Fmax，加入MnCl2后测定FMn。根据公式：Fmin＝FMn+1/6(Fmax-FMn)和[Ca++]i＝Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)计算[Ca++]i。(Kd为Fura-2与钙结合反应的解离常数，37℃时其值为224 nm)。B组：烧伤大鼠血清组，用烧伤大鼠血清(30%TBSA Ⅲ度，烧伤后6小时)替代正常大鼠血清，余同A组。C组：正常PMN组，取正常大鼠外周血PMN，用BSS悬浮成5× 106/ml，取0.5 ml PMN悬液，加入到已用Fura-2/AM负载的肺微血管内皮细胞悬液，在37 ℃、(含体积百分数)5% CO2下孵育0.5小时，测定[Ca++]i。D组：烧伤PMN组，取烧伤大鼠外周血PMN，用BSS悬浮成5× 106/ml，取0.5 mlPMN悬液，加入到已用Fura-2/AM负载的肺微血管内皮细胞悬液，在37 ℃、5% CO2下孵育0.5小时，测定[Ca++]i。E组：正常PMN单抗封闭组，正常大鼠外周血PMN，加单抗OX42(1∶100稀释，20 μl/106PMN)30分钟，再用BSS悬浮成5×106/ml，余同C组。F组：烧伤PMN单抗封闭组，烧伤大鼠外周血PMN，加单抗OX42，余同E组。
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5.统计学分析：所有数据均用
±s表示，作t检验。
二、结果
PMEC与正常大鼠血清孵育后(A组)，[Ca++]i为120±22 nmol/L，与正常PMEC [Ca++]i值相近; 烧伤血清(B组)能使PMEC[Ca++]i明显增高(P<0.01)；用正常大鼠PMN(C组)不能使PMEC[Ca++]i增高；烧伤后PMN(D组)使PMEC增加最为明显，甚至比烧伤血清组明显增高；正常PMN用单抗封闭CD11b/CD18后(E组)对PMEC[Ca++]i的影响并不明显，但用单抗封闭烧伤后PMN粘附分子CD11b/CD18后(F组)，PMEC[Ca++]i的增加得到明显抑制，虽高于正常大鼠血清组和正常大鼠PMN组(A和C组)，但已明显低于烧伤后PMN组。见表1。
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表1 各组大鼠肺微血管内皮细胞[Ca++]i
的变化(nmol/L，±s) 组别
鼠数
[Ca++]i
正常血清组(A)
8
120±22
烧伤血清组(B)
8
195±30*
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正常PMN组(C)
8
117±19
烧伤PMN组(D)
8
326±33*
正常PMN单抗组(E)
8
127±33
烧伤PMN单抗组(F)
8
148±24△
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注：B、D组与A、C组相比*P<0.01；F组与D组相比△ P<0.01
三、讨论
胞浆内游离钙作为第二信使，对细胞的结构功能具有重要的调控作用,很多因素如组胺、缓激肽和IL-1等物质均能使EC[Ca++]i增高。EC[Ca++]i增高时，Ca++与钙调蛋白结合形成Ca++-CaM复合物,后者可激活肌球蛋白轻链激酶，使肌球蛋白轻链磷酸化，细胞骨架变化，微丝微管解聚，导致细胞变形回缩，细胞间隙增加。EC胞浆内钙还是许多分子如一氧化氮合酶(NOS)、内皮素(ET)和IL-8等合成表达的重要调控物质[3]。
本研究结果表明，烧伤血清及烧伤后PMN均能使培养的PMEC [Ca++]i增高，而以后者对[Ca++]i的影响更为明显。当烧伤后PMN被单抗封闭其膜上的粘附分子CD11b/CD18后，[Ca++]i的增加则得到明显的抑制。CD11b/CD18单抗明显抑制烧伤后激活的PMN引起的PMEC [Ca++]i增加，有2种可能性：(1)CD11b/CD18阻断了烧伤后PMN与EC的粘附，从而阻断了粘附本身对EC [Ca++]i的调控。(2)PMN膜上粘附分子CD11b/CD18本身具有对EC [Ca+++]i的调控作用。
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有文献报道CD11b/CD18确实具有对其对应受体细胞粘附分子1(ICAM-1)的激活作用[4]。EC膜上ICAM-1(细胞间粘附分子)属免疫球蛋白家族，与胞浆内的细胞骨架相连接。激活的ICAM-1作为信使物质能使EC钙通道开放，[Ca++]i增高。从而进一步使PMEC的结构功能改变，细胞回缩，细胞间隙增加。Fujita用单抗阻断PMN的CD11b/CD18或CD11a/CD18或EC上的ICAM-1,均能使EC内H2O2维持在基本正常水平[5]。说明,粘附分子的结合在内皮细胞损伤过程中起到了重要的作用。可能粘附分子本身作为信使物质参与了对细胞的调控。
我们认为，烧伤后PMN使PMEC [Ca++]i增加的意义至少有两点：(1)增加了血管通透性;(2)肺微血管内皮细胞[Ca++]i的增高，使EC 间隙增加，为PMN由血管内向血管外的迁移作好了最为基本的准备。
, 百拇医药
参考文献
[1] 方勇，陈玉林，葛绳得，等. 烧伤后CD11b/CD18介导的中性粒细胞粘附对肺微血管内皮细胞单层通透性的影响 . 中华医学杂志，1998，78：746-748.
[2] 胡清华, 金咸榕, 王迪浔. 应用Fura-2测定猪肺动脉内皮细胞游离钙浓度. 中国病理生理杂志，1992，8：447-449.
[3] 丁自强,李少华. 内皮细胞骨架在血管通透性调节中的作用. 生理科学进展, 1991，22: 212-214.
[4] Vogetseder W, Dierich MP. Intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) is associated with actin filaments . Immunobiology, 1991，182:143-151.
[5] Fujita H, Morita I, Murota S. A possible mechanism for vascular endothelial cell injury elicited by activated leukocytes. A significant involvement of adhesion molecules, CD11/CD18, and ICAM-1. Arch Bioche Biophy, 1994，309:62-69.
(收稿：1998-03-24 修回：1998-12-23), 百拇医药
单位：200433 上海，第二军医大学附属长海医院烧伤科
关键词：
中华医学杂志/990425 严重烧伤后早期肺组织微血管内有中性粒细胞的粘附贴壁现象，中性粒细胞对肺血管内皮细胞的粘附能使肺血管通透性增加，并依赖于粘附分子的介导[1]。血管通透性增加的机理主要为内皮细胞间隙增加，而这种改变则依赖于内皮细胞内钙离子浓度的增加。本研究则在上述研究的基础上，观察烧伤血清及烧伤后中性粒细胞(PMN)对培养肺微血管内皮细胞胞浆内游离钙浓度([Ca++]i)的影响，并探讨PMN粘附及其粘附分子CD11b/CD18在该影响中的介导作用。
一、材料和方法
1.实验动物：Wistar大鼠，雄性，体重200～220 g，由中国科学院上海分院动物所提供。用于外周血PMN的分离、肺微血管内皮细胞培养和正常或烧伤血清的制备。
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2.主要试剂及仪器：Dextran T500(Pharmacia公司)；Percoll细胞分离液(Pharmacia公司)；D-MEM培养基(GIBCO公司)；MRC-OX42(小鼠抗大鼠CD11b/CD18, 英国MRC公司提供)；Fura-2/AM(美国Sigma公司)；三乙三胺五醋酸(DTPA)Sigma公司；羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)Sigma公司；丙磺舒(上海集成制药厂)；Triton X-100(Sigma公司，上海生化试剂公司分装)；MnCl2(北京化工厂)。平衡液溶液(BSS)：NaCl 140 mmol/L, KCl 5 mmol/L，CaCl2 1.8 mmol/L，MgCl2 1.0 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，Probenecid 1.0 mmol/L，DTPA 40 μmol/L，HEPES 20 mmol/L，pH7.4。荧光分光光度计(日立850型)。
3.实验方法：大鼠PMN的分离、PMEC培养方法见参考文献[1]。PMEC[Ca++]i的具体测定方法见参考文献[2]。
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4.实验分组及设计：实验分为6组，每组大鼠8只。A组：为正常血清组，取已负载Fura-2/AM的肺微血管内皮细胞悬液(106/ml)0.5 ml，加入正常大鼠血清0.5 ml，在37 ℃、5% CO2下孵育0.5小时测定F值，加入Triton X-100，测定Fmax，加入MnCl2后测定FMn。根据公式：Fmin＝FMn+1/6(Fmax-FMn)和[Ca++]i＝Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)计算[Ca++]i。(Kd为Fura-2与钙结合反应的解离常数，37℃时其值为224 nm)。B组：烧伤大鼠血清组，用烧伤大鼠血清(30%TBSA Ⅲ度，烧伤后6小时)替代正常大鼠血清，余同A组。C组：正常PMN组，取正常大鼠外周血PMN，用BSS悬浮成5× 106/ml，取0.5 ml PMN悬液，加入到已用Fura-2/AM负载的肺微血管内皮细胞悬液，在37 ℃、(含体积百分数)5% CO2下孵育0.5小时，测定[Ca++]i。D组：烧伤PMN组，取烧伤大鼠外周血PMN，用BSS悬浮成5× 106/ml，取0.5 mlPMN悬液，加入到已用Fura-2/AM负载的肺微血管内皮细胞悬液，在37 ℃、5% CO2下孵育0.5小时，测定[Ca++]i。E组：正常PMN单抗封闭组，正常大鼠外周血PMN，加单抗OX42(1∶100稀释，20 μl/106PMN)30分钟，再用BSS悬浮成5×106/ml，余同C组。F组：烧伤PMN单抗封闭组，烧伤大鼠外周血PMN，加单抗OX42，余同E组。
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5.统计学分析：所有数据均用
±s表示，作t检验。二、结果
PMEC与正常大鼠血清孵育后(A组)，[Ca++]i为120±22 nmol/L，与正常PMEC [Ca++]i值相近; 烧伤血清(B组)能使PMEC[Ca++]i明显增高(P<0.01)；用正常大鼠PMN(C组)不能使PMEC[Ca++]i增高；烧伤后PMN(D组)使PMEC增加最为明显，甚至比烧伤血清组明显增高；正常PMN用单抗封闭CD11b/CD18后(E组)对PMEC[Ca++]i的影响并不明显，但用单抗封闭烧伤后PMN粘附分子CD11b/CD18后(F组)，PMEC[Ca++]i的增加得到明显抑制，虽高于正常大鼠血清组和正常大鼠PMN组(A和C组)，但已明显低于烧伤后PMN组。见表1。
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表1 各组大鼠肺微血管内皮细胞[Ca++]i
的变化(nmol/L，
±s) 组别鼠数
[Ca++]i
正常血清组(A)
8
120±22
烧伤血清组(B)
8
195±30*
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正常PMN组(C)
8
117±19
烧伤PMN组(D)
8
326±33*
正常PMN单抗组(E)
8
127±33
烧伤PMN单抗组(F)
8
148±24△
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注：B、D组与A、C组相比*P<0.01；F组与D组相比△ P<0.01
三、讨论
胞浆内游离钙作为第二信使，对细胞的结构功能具有重要的调控作用,很多因素如组胺、缓激肽和IL-1等物质均能使EC[Ca++]i增高。EC[Ca++]i增高时，Ca++与钙调蛋白结合形成Ca++-CaM复合物,后者可激活肌球蛋白轻链激酶，使肌球蛋白轻链磷酸化，细胞骨架变化，微丝微管解聚，导致细胞变形回缩，细胞间隙增加。EC胞浆内钙还是许多分子如一氧化氮合酶(NOS)、内皮素(ET)和IL-8等合成表达的重要调控物质[3]。
本研究结果表明，烧伤血清及烧伤后PMN均能使培养的PMEC [Ca++]i增高，而以后者对[Ca++]i的影响更为明显。当烧伤后PMN被单抗封闭其膜上的粘附分子CD11b/CD18后，[Ca++]i的增加则得到明显的抑制。CD11b/CD18单抗明显抑制烧伤后激活的PMN引起的PMEC [Ca++]i增加，有2种可能性：(1)CD11b/CD18阻断了烧伤后PMN与EC的粘附，从而阻断了粘附本身对EC [Ca++]i的调控。(2)PMN膜上粘附分子CD11b/CD18本身具有对EC [Ca+++]i的调控作用。
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有文献报道CD11b/CD18确实具有对其对应受体细胞粘附分子1(ICAM-1)的激活作用[4]。EC膜上ICAM-1(细胞间粘附分子)属免疫球蛋白家族，与胞浆内的细胞骨架相连接。激活的ICAM-1作为信使物质能使EC钙通道开放，[Ca++]i增高。从而进一步使PMEC的结构功能改变，细胞回缩，细胞间隙增加。Fujita用单抗阻断PMN的CD11b/CD18或CD11a/CD18或EC上的ICAM-1,均能使EC内H2O2维持在基本正常水平[5]。说明,粘附分子的结合在内皮细胞损伤过程中起到了重要的作用。可能粘附分子本身作为信使物质参与了对细胞的调控。
我们认为，烧伤后PMN使PMEC [Ca++]i增加的意义至少有两点：(1)增加了血管通透性;(2)肺微血管内皮细胞[Ca++]i的增高，使EC 间隙增加，为PMN由血管内向血管外的迁移作好了最为基本的准备。
, 百拇医药
参考文献
[1] 方勇，陈玉林，葛绳得，等. 烧伤后CD11b/CD18介导的中性粒细胞粘附对肺微血管内皮细胞单层通透性的影响 . 中华医学杂志，1998，78：746-748.
[2] 胡清华, 金咸榕, 王迪浔. 应用Fura-2测定猪肺动脉内皮细胞游离钙浓度. 中国病理生理杂志，1992，8：447-449.
[3] 丁自强,李少华. 内皮细胞骨架在血管通透性调节中的作用. 生理科学进展, 1991，22: 212-214.
[4] Vogetseder W, Dierich MP. Intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) is associated with actin filaments . Immunobiology, 1991，182:143-151.
[5] Fujita H, Morita I, Murota S. A possible mechanism for vascular endothelial cell injury elicited by activated leukocytes. A significant involvement of adhesion molecules, CD11/CD18, and ICAM-1. Arch Bioche Biophy, 1994，309:62-69.
(收稿：1998-03-24 修回：1998-12-23), 百拇医药