吸入一氧化氮对兔的肺功能和血小板凝聚功能的影响
作者：谢桂芬 高枫 孙波 吴NFDC9 邵肖梅 樊绍曾 罗伯特·林德瓦尔
单位：
关键词：一氧化氮；肺表面活性物质；顺应性；血小板
吸入一氧化氮对兔的肺功能和血小板 凝聚功能的影响 谢桂芬 高枫 孙波 吴 【摘要】 目的 吸入一氧化氮气体在动物体内的代谢 及对肺功能和血小板凝聚的影响。 方法 对机械通气下的健康成年家兔8小时内连续吸入不同浓度(5～80×10-6)一氧化氮，并分别给予正常氧(21%)、高氧(60%)和低氧(13%)，测定肺功能变 化、气道灌 洗液肺表面活性物质磷脂、高铁血红蛋白及血清和尿中的亚硝酸根/硝酸根含量变化；对胎 粪吸入的家兔，测定血小板最大凝聚力、血小板计数和出血时间。 结果 经不同氧浓度处理的三组动物均出现动态顺应性的下降，以低氧 组显著；肺表面活性物质中饱和卵磷脂/总蛋白比无显著变化，但高氧组饱和卵磷脂/总蛋白 比下 降；血清和尿液中亚硝酸根上升1～2倍，尿中亚硝酸根含量约4～5倍于血清含量。另一组动 物在正常氧(21%)和高氧(73%)下吸入150×10-6一氧化氮使高铁血红蛋白迅速大于3% 。经胎粪吸入的动物，出现血小板凝聚力下降>50%，出血时间延长>50%，血小板含量下降。 结论 健康兔吸入一氧化氮存在肺功能下降趋势，但对内源性肺表面活 性物质磷脂影响不大。血清和尿液亚硝酸根含量呈上升趋势。吸入一氧化氮可以伴有血小板 功能抑制。
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Influence of inhaled nitric oxide on rabbits pulmonary function and p latelet aggregation XIE Guifen, GAO Feng, SUN Bo, et al. Children's Hospital of Shanghai Medical University, Shanghai, 200032
【Abstract】 Objective To assess the metabolism of inhaled nitric oxide (iNO) and the effects of iNO on pulmonary and platelet function. Methods 5～80×10-6 iNO was inhaled by ventilated adul t rabbits under normal, hyper- and hypoxic conditions for 8h, and dynamic measurement of lung compliance (Cdyn), saturated phosphatidylcholine (SatPC) in bronchoalveolar lavage fluid, serum and urine nitrite and nitrate, and methemogl obin (MetHb) were performed. In another study in ventilated rabbits with meconiu m aspiration and iNO(20×10-6), platelet counts, aggregation and bleeding time were determined. Results The animals at different oxygen levels had decreased Cd yn, especially those in the hypoxic group. There was no substantial change in Sa tPC in total phospholipids, concomitantly there was 1～2 fold increments of nitr i te and nitrate in the serum and urine. iNO resulted in significant decrease in i ntensity of platelet aggregation and prolonged bleeding time by >50%.Conclusion iNO decreased the lung function but had no influence on pulmonary surfactant production. It inhibited platelet aggregation and caused, prolongs th e bleeding time and increases the serum and nitrite levels.(Shanghai Med J , 1999,22∶223-227)
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【Key words】 Nitric oxide Pulmonary surfactants prod uction pulmonary compliance platelet
一氧化氮(NO)系由血管内皮细胞合成的血管张力调节因子，可以弥散入阻力性小血管壁平滑 肌，使血管松弛扩张[1]。NO和氧可以迅速生成二氧化氮(NO2)，NO在体内迅 速与血红蛋白结合形成高铁血红蛋白，并可以代谢为亚硝酸根/硝酸根，经尿液排出体外 [2]。
国外临床试验应用吸入NO治疗新生儿肺动脉高压症，取得显著效果。这一技术涉及临床的供 气系统设置的合理性，安全性，以及适用性，以避免技术操作上的失误和NO的毒副作用 [3，4]。但对于吸入NO后肺功能及肺表面活性物质变化，及对血小板相关血凝功能的 研究少 见报道。本实验用经机械通气的健康成年家兔，观察了不同氧浓度时，连续吸入高浓度NO气 体对肺功能和血气交换的影响，并测定了高铁血红蛋白，以及血清和尿液的亚硝酸根/硝酸 根水平变化。本研究亦对胎粪吸入兔模型测定了吸入NO后血小板凝聚功能，以对临床试验应 用吸入一氧化氮技术的安全性有一综合评价。
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材料与方法
一、实验动物处理及试验方案
(一) 试验1 不同氧浓度吸入NO。新西兰白兔28只，体重2.5～3.0kg。肌肉注射安定1～2mg /kg体重，15分钟后给予静脉注射1%戊巴比妥钠15mg/kg麻醉，行气管切开和插管，接入人工 呼吸机(美国纽邦E200型)机械通气。氧浓度由附设COMPASS VM200型监测仪测定。通气模式 为 定压式支持/控制(A/C)，吸入氧浓度为21%，气道峰压(PIP)1.47kPa(15cm H2O)，呼气末 正压(PEEP) 0 kPa，吸呼比1∶2.5，频率25次/分，潮气量10～12ml/kg，并做适当调节，以 维持 血pH7.35～7.45,PaCO2 3.99～6.65kPa(30～50mmHg)。待15分钟后，经颈动脉留置导 管取血供作血气分析 和高铁血红蛋白等化学测定用。然后测定动物动态肺顺应性并作吸入NO试验。试验中 动物分组处理见表1。实验中麻醉给予静脉连续滴注1%戊巴比妥钠2～4mg/h维持，及林格- 乳酸缓冲液5～10ml·kg-1·h-1。实验结束处死动物时，采用静脉推注过量戊 巴比妥钠，直至动物心跳呼吸停止。立即打开胸腔，结扎左肺门，取左侧中部肺组织小块称 干湿重并计算干湿重比。右侧肺作肺泡灌洗，用温生理盐水按20ml/kg体重给予，同一液体 洗2次回收，反复洗3遍，总回收量为>90%的入液量。液体先作低速离心后留上清液，用 于测定总蛋白和肺表面活性物质磷脂。
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(二) 试验2 胎粪吸入后的吸入NO和血小板试验。新西兰白兔17只，体重2.3～3.4kg。麻醉 、机械通气同上。14只兔气道内滴入人胎粪，继续机械通气并吸入100%氧直至呼吸衰竭出现 [5]。继而吸入NO 20×10-6治疗。在基础状态、呼吸衰竭出现(0h)和吸入N O后1小时 采血，血样用枸橼酸钠抗凝后离心，用富含血小板血清在SH-93智能血液凝聚仪测定血小板 最大凝聚力。血小板计数按标准临床检验法。出血时间用耳缘静脉血管切口滤纸计时测定法 。
二、吸入NO[6]
(一) 分组 试验分组及吸入NO见表1。
(二) NO气体 高纯度NO气体由上海比欧西气体公司供应，用高纯度氮气(99.999%，上海比 欧 西气体公司)作为平衡气体，使NO浓度在800～1 000×10-6。治疗吸入NO浓 度使用质量流量控制 器控制流量获得，使用电化学法NO和NO2浓度监测仪(NOxBOX，英国Bedfont公司)监测。
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三、血气和肺功能测定
所有动物在基础状态、吸入NO开始后30、60分以及每2小时测定动脉血pH、氧和二氧化碳 分压(Ciba-Corning公司170型自动血气分析仪)。动态顺应性测定用Navigator呼吸监护仪G M250型(美国BICORE公司)。
四、高铁血红蛋白测定
分别在试验的基础状态、吸入NO后4和8小时，取动脉肝素化全血50μl注入自动血红蛋白分 析 仪OSM-3(丹麦Radiometer公司)测定高铁血红蛋白，并以高铁血红蛋白占总血红蛋白的百分 比表示。
五、亚硝酸根测定
采用改良镉柱层析还原法[7]。
六、肺泡灌洗液中总蛋白和肺表面活性物质磷脂测定[6]
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(一) 总蛋白 采用Lowry蛋白测定法，用牛血清白蛋白作为标准品。
(二) 饱和卵磷脂和总磷脂 取1ml低速离心后的肺泡灌洗液上清，加入1ml甲醇和2ml氯仿提 取。氯仿中脂质经四氧化锇(锇酸)处理后，并经中性铝粉柱洗脱得到饱和卵磷脂(Mason法) ，再经无机磷法测定磷脂总量(Bartlett法)。结果用饱和卵磷脂和总蛋白比值，饱和卵磷脂 和总磷脂百分比值表达。
七、统计分析
生理学指标用分组平均值和标准差(s)表示，不同时点的组内差别用Wilcoxon符号秩序检验 ，组间差别采用Wilcoxon-Mann-Whitney检验，以P值<0.05为差别有显著性。
结 果
一、试验1结果
, 百拇医药
见表1。实验中测定1～4组的吸入NO浓度均在设定值的±2×10-6内。第1～3组NO2 的浓度均未 超过3×10-6。吸入150×10-6的3只动物NO2>3×10-6，但在撤去NO后 NO2回落到<2%以下。第1～ 3组在任何浓度氧和选定的NO浓度，高铁血红蛋白含量亦未超过1%。第4组3只动物在正常氧 时吸入150×10-6 NO仅1小时，高铁血红蛋白即上升到3%～13%；在吸入高氧(73%)时 达到3%～10 %；在撤去NO后，高铁血红蛋白在3小时内回复到1%。在第3组动物，用13%氧通气可以迅速使 动物处于低氧血症(PaO2<50)，但是在吸入10～80×10-6 NO时，动物反应不一，多 数并不表 现为动脉血氧分压的提高，仅少数出现动脉血氧分压随吸入NO浓度增加而上升，但达不到正 常氧水平。所有动物血清和尿中亚硝酸根和硝酸根总量随吸入NO水平和时间而呈上升趋势( 表2)，尤其以3只吸入150×10-6 NO的动物为显著，但在撤去NO后血清和尿中亚硝酸 根水平下降 。对第1～3组动物测定肺功能均呈下降趋势，其中第2、3组动物在连续吸入高氧或低氧和高 NO后8小时内，动态顺应性均呈明显下降趋势。测定肺表面活性物质饱和卵磷脂显示，1～3 组动物的饱和卵磷脂占总磷脂含量在40%～50%，没有显著减少，但第2组动物的饱和卵磷脂 和蛋白比值减少，顺应性亦下降(表3)。肺干湿重比例在1～3组间无显著差别。
, 百拇医药
二、试验2结果
见表4。在胎粪吸入后的30～60分钟时间内，动物出现低氧血症和呼吸衰竭，血小板最大 凝聚力、出血时间均没有显著变化，但血小板计数下降。在吸入20×10-6的NO后1小 时，血小板 最大凝聚力显著下降，伴出血时间的显著延长。没有胎粪吸入的3只正常对照动物，上述参 数也出现类似变化趋势，但差别不显著。
表1 动脉血氧分压和高铁血红蛋白变化
分组
数量
氧浓度
(%)
NO浓度
(ppm)
, 百拇医药
通气时间
(分钟)
动脉氧分压(kPa)
高铁血红蛋白(%)
基础状态
实验后
基础状态
实验后
1
8
21
60
480
, 百拇医药
10.8±1.5
9.1±1.8
0.44±0.18
0.46±0.21
2
8
60
60
480
19.5±5.4
16.4±4.4
0.36±0.26
0.34±0.21
, 百拇医药
3
9
21
0
10.4±2.7
0.39±0.16
13
0
5.6±1.1
13
10
30
5.5±0.1
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13
20
30
5.4±1.1
13
40
30
5.0±1.1
13
80
30
6.5±1.7
13
, http://www.100md.com
10
180
5.1±1.2
13
5
180
4.9±1.3
0.41±0.12
4
3
21
150
120
, 百拇医药
3-13
73
150
120
3-10
21
0
180
<1
总计
114.85±48.74
137.56±44.93
117.44±49.67
, 百拇医药
7.326
0.002
107.81±53.80
147.40±56.80
131.50±59.88
1.712
0.212
表2 血清和尿亚硝酸根含量测定结果(μmol/L)
分组
基础状态
4小时
8小时
, 百拇医药
血清
尿
血清
尿
血清
尿
1
119±25
-
201±56
997±197
254±228
912±317
, 百拇医药
2
105±32
-
197±67
812±394
297±405
1180±54 6
3
101±37
-
193±55
734±340
168±44
, 百拇医药
972±421
4
112±62
595±269
432±214
1198±351
286±32
73 8±75
表3 肺功能和肺表面活性物质磷脂测定
分组
动态顺应性(ml*kPa-1*kg-1)
, 百拇医药
饱和卵磷脂/总蛋白
(μg/mg)
饱和卵磷脂/总磷脂
(%)
肺干重/湿重
基础状态
实验后
1
1.09±0.24
0.75±0.24
209±104
48.3±4.5
, 百拇医药
0.19±0.02
2
1.10±0.24
0.65±0.18
121±28
45.2±7.6
0.16±0.01
3
1.20±0.31
0.55±0.08*
212±89
43.8±4.1
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0.21±0.05
*P<0.05(组内比较基础状态值)
表4 血小板最大凝聚力、血小板计数和出血时间
项目
基础状态
胎粪吸入
胎粪吸入+NO
正常+NO
0小时
1小时
0小时
1小时
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0小时
1小时
例数
17
4
10
3
血小板最大凝聚力(%)
40±12
43±9
27±7*#
42±12
23±10**#
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44±8[ ]27±4
血小板计数(×109/L)
326±66
313±79
225±56
311±53
250±68*
2 67±41
191±29
出血时间
35±8
29±6
, 百拇医药
50±16*#
28±4#
57±16**
37±8
49±6
此部分实验动物分3小组，14只气道内滴入胎粪，然后均机械通气治疗至出现呼吸衰竭 为0小时；给予吸入NO治疗1小时，4只胎粪吸入动物未给予NO治疗，3只未给予胎粪为正常动 物。数据为均数±标准差；*P<0.05,**P<0.01(组内比较0小时值 )，#P<0.05(组内比较基础状态值)
讨 论
原发性和继发性肺动脉高压多见于新生儿和婴幼儿缺氧性呼吸衰竭，临床表现为低氧血症、 青紫、通气-灌流失调和肺内动静脉分流。吸入NO疗法是近5年来的一项新的治疗呼吸衰竭 的技术[1～3，8],具有显效快，高选择性，无创伤的优点。但使用中可以有毒 副作用，可能会直接影响肺功能，并可以带来高铁血红蛋白和高亚硝酸根血症，及影响血小 板凝聚，为目前临床试验应用所关注[8]。
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本实验的第一部分观察了不同浓度氧的机械通气。在第2组连续8小时吸入高氧和高NO时，吸 入NO2和血高铁血红蛋白分别维持在<3×10-6和1%的安全水平。但在动物吸入NO达 到15 0ppm时，无论在正常氧或高氧，高铁血红蛋白均>3%，且吸入的NO2高于3×10-6 的安全水平 ，在撤掉NO后可以迅速回复到正常水平。提示吸入NO时有必要监测高铁血红蛋白。
我们的实验中亦观察到血清和尿亚硝酸根/硝酸根的升高，低氧组和高氧或正常氧组间无 显著差异。理论上讲，由于NO进入机体可以被血红蛋白迅速结合而失活，并被转化为亚硝酸 根/硝酸根由肾脏排出体外，因而长时间吸入不带来NO在体内的积蓄。但在低氧血症时，可 因肾血流减少致少尿和无尿的病理情况，血中的亚硝酸根/硝酸根水平可能升高。在长时间 连续吸入NO时，血清和尿亚硝酸根/硝酸根的变化对组织细胞的影响是有待研究的重要内容 ，以避免长期吸入NO带来的对细胞的毒副作用。
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实验中观察到吸入NO后肺功能的下降，以及在高氧和高NO时肺表面活性物质饱和卵磷脂 的下降。目前国外文献提到N0的氧化代谢产物—过氧化亚硝基(ONOO-)可以使肺表面活性物 质蛋白A(SP-A)结构发生改变，从而影响肺表面活性物质和肺功能[9]。对本实验 中吸入N O时肺功能和肺表面活性物质磷脂的变化与对照动物相比，差别不显著，说明治疗浓度NO短 时间内对肺功能和肺表面活性物质不产生显著影响。
血小板凝聚机制与cGMP有关，而NO也可以影响GTP转换为cGMP途径，从而影响血小板凝 聚。本实验的第二部分，观察了胎粪吸入造成低氧血症时，对血小板最大凝聚力没有显著影 响，但在吸入治疗浓度NO(20×10-6)后1小时可以使其显著下降 ,正常对照动物也有 相似变化 趋势。表明吸入NO对于循环血小板凝聚存在抑制作用。这种作用是否对病人有益(如逆转高 凝状态)或有害(如出血)，尚有待研究。
吸入NO的浓度受流量影响。如果源气体中NO浓度太低，比如<200×10-6，在给予高浓 度NO时 ，势必增加NO流量。这一附加连续气流可以影响呼吸机主供气回路的流量，进一步影响到病 人的实际通气量和吸入氧浓度。本实验中源气体NO浓度为800～1000×10-6，发现在 吸入>20×10-6 NO时，仅用转子流量计，可以使吸入NO浓度相对恒定。而在吸入5～2 0×10-6 NO时，质量 流量控制器可以显著地提高NO浓度调节的精确和恒定。结果表明，我们建立的NO供气、流量 控制，和浓度监测装置，以及辅助监测参数和结果，基本符合目前国际上提倡的安全要求 [2，3]，为进一步临床试验应用提供了保障。
, 百拇医药
参考文献
1 Edwards AD. The pharmacology of inhaled nitric oxide. Arch Dis Child, 1995, 72:127-130.
2 Miller OI, Celermajer DS, Deanfield JE, et al. Guidelines for the safe admini stration of inhaled nitric
oxide. Arch Dis Child, 1994, 70:47-49.
3 Bouchet M, Renaudin MH, Raveau C, et al. Safety requirement for use of inhale d nitric oxide in
, http://www.100md.com
neonates. Lancet, 1993, 341:968-969.
4 Jacob TD, Nakayama DK, Seki I, et al. Hemodynamic effects and metabolic fate of inhaled nitric oxide
in hypoxic piglets. J Appl Physiol, 1994,76:1794-1801.
5 Sun B, Herting E, Curstedt T, et al. Exogenous surfactant improves lung compl iance and oxygenation
in adult rats with meconium aspiration. J Appl Physiol, 1 994, 77:1961-1971.
, http://www.100md.com
6 Zhu GF, Sun B, Niu SF, et al. Combined surfactant therapy and inhaled nitric oxide in rabbits with
oleic acid-induced acute respiratory distress syndrome. A m J Respir Crit Care Med, 1998, 158:437-
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7 Shi Y, Li HQ, Shen CK, et al. Plasma nitric oxide levels in newborn infants w ith sepsis. J Pediatr,1993, 123:435-438.
8 Wessel DL, Adatia I, Thompson JE, et al. Delivery and monitoring of inhaled n itric oxide in patients
with pulmonary hypertension. Crit Care Med, 1994, 22:930 -938.
9 Haddad IY, Crow JP, Hu P, et al. Concurrent generation of nitric oxide and su peroxide damages
surfactant protein A. Am J Physiol, 1994, 267:L242-249.
收稿：1999-01-22, 百拇医药
单位：
关键词：一氧化氮；肺表面活性物质；顺应性；血小板
吸入一氧化氮对兔的肺功能和血小板 凝聚功能的影响 谢桂芬 高枫 孙波 吴 【摘要】 目的 吸入一氧化氮气体在动物体内的代谢 及对肺功能和血小板凝聚的影响。 方法 对机械通气下的健康成年家兔8小时内连续吸入不同浓度(5～80×10-6)一氧化氮，并分别给予正常氧(21%)、高氧(60%)和低氧(13%)，测定肺功能变 化、气道灌 洗液肺表面活性物质磷脂、高铁血红蛋白及血清和尿中的亚硝酸根/硝酸根含量变化；对胎 粪吸入的家兔，测定血小板最大凝聚力、血小板计数和出血时间。 结果 经不同氧浓度处理的三组动物均出现动态顺应性的下降，以低氧 组显著；肺表面活性物质中饱和卵磷脂/总蛋白比无显著变化，但高氧组饱和卵磷脂/总蛋白 比下 降；血清和尿液中亚硝酸根上升1～2倍，尿中亚硝酸根含量约4～5倍于血清含量。另一组动 物在正常氧(21%)和高氧(73%)下吸入150×10-6一氧化氮使高铁血红蛋白迅速大于3% 。经胎粪吸入的动物，出现血小板凝聚力下降>50%，出血时间延长>50%，血小板含量下降。 结论 健康兔吸入一氧化氮存在肺功能下降趋势，但对内源性肺表面活 性物质磷脂影响不大。血清和尿液亚硝酸根含量呈上升趋势。吸入一氧化氮可以伴有血小板 功能抑制。
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Influence of inhaled nitric oxide on rabbits pulmonary function and p latelet aggregation XIE Guifen, GAO Feng, SUN Bo, et al. Children's Hospital of Shanghai Medical University, Shanghai, 200032
【Abstract】 Objective To assess the metabolism of inhaled nitric oxide (iNO) and the effects of iNO on pulmonary and platelet function. Methods 5～80×10-6 iNO was inhaled by ventilated adul t rabbits under normal, hyper- and hypoxic conditions for 8h, and dynamic measurement of lung compliance (Cdyn), saturated phosphatidylcholine (SatPC) in bronchoalveolar lavage fluid, serum and urine nitrite and nitrate, and methemogl obin (MetHb) were performed. In another study in ventilated rabbits with meconiu m aspiration and iNO(20×10-6), platelet counts, aggregation and bleeding time were determined. Results The animals at different oxygen levels had decreased Cd yn, especially those in the hypoxic group. There was no substantial change in Sa tPC in total phospholipids, concomitantly there was 1～2 fold increments of nitr i te and nitrate in the serum and urine. iNO resulted in significant decrease in i ntensity of platelet aggregation and prolonged bleeding time by >50%.Conclusion iNO decreased the lung function but had no influence on pulmonary surfactant production. It inhibited platelet aggregation and caused, prolongs th e bleeding time and increases the serum and nitrite levels.(Shanghai Med J , 1999,22∶223-227)
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【Key words】 Nitric oxide Pulmonary surfactants prod uction pulmonary compliance platelet
一氧化氮(NO)系由血管内皮细胞合成的血管张力调节因子，可以弥散入阻力性小血管壁平滑 肌，使血管松弛扩张[1]。NO和氧可以迅速生成二氧化氮(NO2)，NO在体内迅 速与血红蛋白结合形成高铁血红蛋白，并可以代谢为亚硝酸根/硝酸根，经尿液排出体外 [2]。
国外临床试验应用吸入NO治疗新生儿肺动脉高压症，取得显著效果。这一技术涉及临床的供 气系统设置的合理性，安全性，以及适用性，以避免技术操作上的失误和NO的毒副作用 [3，4]。但对于吸入NO后肺功能及肺表面活性物质变化，及对血小板相关血凝功能的 研究少 见报道。本实验用经机械通气的健康成年家兔，观察了不同氧浓度时，连续吸入高浓度NO气 体对肺功能和血气交换的影响，并测定了高铁血红蛋白，以及血清和尿液的亚硝酸根/硝酸 根水平变化。本研究亦对胎粪吸入兔模型测定了吸入NO后血小板凝聚功能，以对临床试验应 用吸入一氧化氮技术的安全性有一综合评价。
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材料与方法
一、实验动物处理及试验方案
(一) 试验1 不同氧浓度吸入NO。新西兰白兔28只，体重2.5～3.0kg。肌肉注射安定1～2mg /kg体重，15分钟后给予静脉注射1%戊巴比妥钠15mg/kg麻醉，行气管切开和插管，接入人工 呼吸机(美国纽邦E200型)机械通气。氧浓度由附设COMPASS VM200型监测仪测定。通气模式 为 定压式支持/控制(A/C)，吸入氧浓度为21%，气道峰压(PIP)1.47kPa(15cm H2O)，呼气末 正压(PEEP) 0 kPa，吸呼比1∶2.5，频率25次/分，潮气量10～12ml/kg，并做适当调节，以 维持 血pH7.35～7.45,PaCO2 3.99～6.65kPa(30～50mmHg)。待15分钟后，经颈动脉留置导 管取血供作血气分析 和高铁血红蛋白等化学测定用。然后测定动物动态肺顺应性并作吸入NO试验。试验中 动物分组处理见表1。实验中麻醉给予静脉连续滴注1%戊巴比妥钠2～4mg/h维持，及林格- 乳酸缓冲液5～10ml·kg-1·h-1。实验结束处死动物时，采用静脉推注过量戊 巴比妥钠，直至动物心跳呼吸停止。立即打开胸腔，结扎左肺门，取左侧中部肺组织小块称 干湿重并计算干湿重比。右侧肺作肺泡灌洗，用温生理盐水按20ml/kg体重给予，同一液体 洗2次回收，反复洗3遍，总回收量为>90%的入液量。液体先作低速离心后留上清液，用 于测定总蛋白和肺表面活性物质磷脂。
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(二) 试验2 胎粪吸入后的吸入NO和血小板试验。新西兰白兔17只，体重2.3～3.4kg。麻醉 、机械通气同上。14只兔气道内滴入人胎粪，继续机械通气并吸入100%氧直至呼吸衰竭出现 [5]。继而吸入NO 20×10-6治疗。在基础状态、呼吸衰竭出现(0h)和吸入N O后1小时 采血，血样用枸橼酸钠抗凝后离心，用富含血小板血清在SH-93智能血液凝聚仪测定血小板 最大凝聚力。血小板计数按标准临床检验法。出血时间用耳缘静脉血管切口滤纸计时测定法 。
二、吸入NO[6]
(一) 分组 试验分组及吸入NO见表1。
(二) NO气体 高纯度NO气体由上海比欧西气体公司供应，用高纯度氮气(99.999%，上海比 欧 西气体公司)作为平衡气体，使NO浓度在800～1 000×10-6。治疗吸入NO浓 度使用质量流量控制 器控制流量获得，使用电化学法NO和NO2浓度监测仪(NOxBOX，英国Bedfont公司)监测。
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三、血气和肺功能测定
所有动物在基础状态、吸入NO开始后30、60分以及每2小时测定动脉血pH、氧和二氧化碳 分压(Ciba-Corning公司170型自动血气分析仪)。动态顺应性测定用Navigator呼吸监护仪G M250型(美国BICORE公司)。
四、高铁血红蛋白测定
分别在试验的基础状态、吸入NO后4和8小时，取动脉肝素化全血50μl注入自动血红蛋白分 析 仪OSM-3(丹麦Radiometer公司)测定高铁血红蛋白，并以高铁血红蛋白占总血红蛋白的百分 比表示。
五、亚硝酸根测定
采用改良镉柱层析还原法[7]。
六、肺泡灌洗液中总蛋白和肺表面活性物质磷脂测定[6]
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(一) 总蛋白 采用Lowry蛋白测定法，用牛血清白蛋白作为标准品。
(二) 饱和卵磷脂和总磷脂 取1ml低速离心后的肺泡灌洗液上清，加入1ml甲醇和2ml氯仿提 取。氯仿中脂质经四氧化锇(锇酸)处理后，并经中性铝粉柱洗脱得到饱和卵磷脂(Mason法) ，再经无机磷法测定磷脂总量(Bartlett法)。结果用饱和卵磷脂和总蛋白比值，饱和卵磷脂 和总磷脂百分比值表达。
七、统计分析
生理学指标用分组平均值和标准差(s)表示，不同时点的组内差别用Wilcoxon符号秩序检验 ，组间差别采用Wilcoxon-Mann-Whitney检验，以P值<0.05为差别有显著性。
结 果
一、试验1结果
, 百拇医药
见表1。实验中测定1～4组的吸入NO浓度均在设定值的±2×10-6内。第1～3组NO2 的浓度均未 超过3×10-6。吸入150×10-6的3只动物NO2>3×10-6，但在撤去NO后 NO2回落到<2%以下。第1～ 3组在任何浓度氧和选定的NO浓度，高铁血红蛋白含量亦未超过1%。第4组3只动物在正常氧 时吸入150×10-6 NO仅1小时，高铁血红蛋白即上升到3%～13%；在吸入高氧(73%)时 达到3%～10 %；在撤去NO后，高铁血红蛋白在3小时内回复到1%。在第3组动物，用13%氧通气可以迅速使 动物处于低氧血症(PaO2<50)，但是在吸入10～80×10-6 NO时，动物反应不一，多 数并不表 现为动脉血氧分压的提高，仅少数出现动脉血氧分压随吸入NO浓度增加而上升，但达不到正 常氧水平。所有动物血清和尿中亚硝酸根和硝酸根总量随吸入NO水平和时间而呈上升趋势( 表2)，尤其以3只吸入150×10-6 NO的动物为显著，但在撤去NO后血清和尿中亚硝酸 根水平下降 。对第1～3组动物测定肺功能均呈下降趋势，其中第2、3组动物在连续吸入高氧或低氧和高 NO后8小时内，动态顺应性均呈明显下降趋势。测定肺表面活性物质饱和卵磷脂显示，1～3 组动物的饱和卵磷脂占总磷脂含量在40%～50%，没有显著减少，但第2组动物的饱和卵磷脂 和蛋白比值减少，顺应性亦下降(表3)。肺干湿重比例在1～3组间无显著差别。
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二、试验2结果
见表4。在胎粪吸入后的30～60分钟时间内，动物出现低氧血症和呼吸衰竭，血小板最大 凝聚力、出血时间均没有显著变化，但血小板计数下降。在吸入20×10-6的NO后1小 时，血小板 最大凝聚力显著下降，伴出血时间的显著延长。没有胎粪吸入的3只正常对照动物，上述参 数也出现类似变化趋势，但差别不显著。
表1 动脉血氧分压和高铁血红蛋白变化
分组
数量
氧浓度
(%)
NO浓度
(ppm)
, 百拇医药
通气时间
(分钟)
动脉氧分压(kPa)
高铁血红蛋白(%)
基础状态
实验后
基础状态
实验后
1
8
21
60
480
, 百拇医药
10.8±1.5
9.1±1.8
0.44±0.18
0.46±0.21
2
8
60
60
480
19.5±5.4
16.4±4.4
0.36±0.26
0.34±0.21
, 百拇医药
3
9
21
0
10.4±2.7
0.39±0.16
13
0
5.6±1.1
13
10
30
5.5±0.1
, http://www.100md.com
13
20
30
5.4±1.1
13
40
30
5.0±1.1
13
80
30
6.5±1.7
13
, http://www.100md.com
10
180
5.1±1.2
13
5
180
4.9±1.3
0.41±0.12
4
3
21
150
120
, 百拇医药
3-13
73
150
120
3-10
21
0
180
<1
总计
114.85±48.74
137.56±44.93
117.44±49.67
, 百拇医药
7.326
0.002
107.81±53.80
147.40±56.80
131.50±59.88
1.712
0.212
表2 血清和尿亚硝酸根含量测定结果(μmol/L)
分组
基础状态
4小时
8小时
, 百拇医药
血清
尿
血清
尿
血清
尿
1
119±25
-
201±56
997±197
254±228
912±317
, 百拇医药
2
105±32
-
197±67
812±394
297±405
1180±54 6
3
101±37
-
193±55
734±340
168±44
, 百拇医药
972±421
4
112±62
595±269
432±214
1198±351
286±32
73 8±75
表3 肺功能和肺表面活性物质磷脂测定
分组
动态顺应性(ml*kPa-1*kg-1)
, 百拇医药
饱和卵磷脂/总蛋白
(μg/mg)
饱和卵磷脂/总磷脂
(%)
肺干重/湿重
基础状态
实验后
1
1.09±0.24
0.75±0.24
209±104
48.3±4.5
, 百拇医药
0.19±0.02
2
1.10±0.24
0.65±0.18
121±28
45.2±7.6
0.16±0.01
3
1.20±0.31
0.55±0.08*
212±89
43.8±4.1
, http://www.100md.com
0.21±0.05
*P<0.05(组内比较基础状态值)
表4 血小板最大凝聚力、血小板计数和出血时间
项目
基础状态
胎粪吸入
胎粪吸入+NO
正常+NO
0小时
1小时
0小时
1小时
, http://www.100md.com
0小时
1小时
例数
17
4
10
3
血小板最大凝聚力(%)
40±12
43±9
27±7*#
42±12
23±10**#
, http://www.100md.com
44±8[ ]27±4
血小板计数(×109/L)
326±66
313±79
225±56
311±53
250±68*
2 67±41
191±29
出血时间
35±8
29±6
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50±16*#
28±4#
57±16**
37±8
49±6
此部分实验动物分3小组，14只气道内滴入胎粪，然后均机械通气治疗至出现呼吸衰竭 为0小时；给予吸入NO治疗1小时，4只胎粪吸入动物未给予NO治疗，3只未给予胎粪为正常动 物。数据为均数±标准差；*P<0.05,**P<0.01(组内比较0小时值 )，#P<0.05(组内比较基础状态值)
讨 论
原发性和继发性肺动脉高压多见于新生儿和婴幼儿缺氧性呼吸衰竭，临床表现为低氧血症、 青紫、通气-灌流失调和肺内动静脉分流。吸入NO疗法是近5年来的一项新的治疗呼吸衰竭 的技术[1～3，8],具有显效快，高选择性，无创伤的优点。但使用中可以有毒 副作用，可能会直接影响肺功能，并可以带来高铁血红蛋白和高亚硝酸根血症，及影响血小 板凝聚，为目前临床试验应用所关注[8]。
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本实验的第一部分观察了不同浓度氧的机械通气。在第2组连续8小时吸入高氧和高NO时，吸 入NO2和血高铁血红蛋白分别维持在<3×10-6和1%的安全水平。但在动物吸入NO达 到15 0ppm时，无论在正常氧或高氧，高铁血红蛋白均>3%，且吸入的NO2高于3×10-6 的安全水平 ，在撤掉NO后可以迅速回复到正常水平。提示吸入NO时有必要监测高铁血红蛋白。
我们的实验中亦观察到血清和尿亚硝酸根/硝酸根的升高，低氧组和高氧或正常氧组间无 显著差异。理论上讲，由于NO进入机体可以被血红蛋白迅速结合而失活，并被转化为亚硝酸 根/硝酸根由肾脏排出体外，因而长时间吸入不带来NO在体内的积蓄。但在低氧血症时，可 因肾血流减少致少尿和无尿的病理情况，血中的亚硝酸根/硝酸根水平可能升高。在长时间 连续吸入NO时，血清和尿亚硝酸根/硝酸根的变化对组织细胞的影响是有待研究的重要内容 ，以避免长期吸入NO带来的对细胞的毒副作用。
, 百拇医药
实验中观察到吸入NO后肺功能的下降，以及在高氧和高NO时肺表面活性物质饱和卵磷脂 的下降。目前国外文献提到N0的氧化代谢产物—过氧化亚硝基(ONOO-)可以使肺表面活性物 质蛋白A(SP-A)结构发生改变，从而影响肺表面活性物质和肺功能[9]。对本实验 中吸入N O时肺功能和肺表面活性物质磷脂的变化与对照动物相比，差别不显著，说明治疗浓度NO短 时间内对肺功能和肺表面活性物质不产生显著影响。
血小板凝聚机制与cGMP有关，而NO也可以影响GTP转换为cGMP途径，从而影响血小板凝 聚。本实验的第二部分，观察了胎粪吸入造成低氧血症时，对血小板最大凝聚力没有显著影 响，但在吸入治疗浓度NO(20×10-6)后1小时可以使其显著下降 ,正常对照动物也有 相似变化 趋势。表明吸入NO对于循环血小板凝聚存在抑制作用。这种作用是否对病人有益(如逆转高 凝状态)或有害(如出血)，尚有待研究。
吸入NO的浓度受流量影响。如果源气体中NO浓度太低，比如<200×10-6，在给予高浓 度NO时 ，势必增加NO流量。这一附加连续气流可以影响呼吸机主供气回路的流量，进一步影响到病 人的实际通气量和吸入氧浓度。本实验中源气体NO浓度为800～1000×10-6，发现在 吸入>20×10-6 NO时，仅用转子流量计，可以使吸入NO浓度相对恒定。而在吸入5～2 0×10-6 NO时，质量 流量控制器可以显著地提高NO浓度调节的精确和恒定。结果表明，我们建立的NO供气、流量 控制，和浓度监测装置，以及辅助监测参数和结果，基本符合目前国际上提倡的安全要求 [2，3]，为进一步临床试验应用提供了保障。
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参考文献
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2 Miller OI, Celermajer DS, Deanfield JE, et al. Guidelines for the safe admini stration of inhaled nitric
oxide. Arch Dis Child, 1994, 70:47-49.
3 Bouchet M, Renaudin MH, Raveau C, et al. Safety requirement for use of inhale d nitric oxide in
, http://www.100md.com
neonates. Lancet, 1993, 341:968-969.
4 Jacob TD, Nakayama DK, Seki I, et al. Hemodynamic effects and metabolic fate of inhaled nitric oxide
in hypoxic piglets. J Appl Physiol, 1994,76:1794-1801.
5 Sun B, Herting E, Curstedt T, et al. Exogenous surfactant improves lung compl iance and oxygenation
in adult rats with meconium aspiration. J Appl Physiol, 1 994, 77:1961-1971.
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6 Zhu GF, Sun B, Niu SF, et al. Combined surfactant therapy and inhaled nitric oxide in rabbits with
oleic acid-induced acute respiratory distress syndrome. A m J Respir Crit Care Med, 1998, 158:437-
443.
7 Shi Y, Li HQ, Shen CK, et al. Plasma nitric oxide levels in newborn infants w ith sepsis. J Pediatr,1993, 123:435-438.
8 Wessel DL, Adatia I, Thompson JE, et al. Delivery and monitoring of inhaled n itric oxide in patients
with pulmonary hypertension. Crit Care Med, 1994, 22:930 -938.
9 Haddad IY, Crow JP, Hu P, et al. Concurrent generation of nitric oxide and su peroxide damages
surfactant protein A. Am J Physiol, 1994, 267:L242-249.
收稿：1999-01-22, 百拇医药