间接视神经损伤动物模型的研制
作者：王 一 周继红 许立军 马志中 刘 杰
单位：王一、周继红、许立军 400038 重庆，第三军医大学附属西南医院眼科；马志中 解放军总医院眼科；刘 杰 解放军第三O四医院眼科
关键词：视神经；创伤和损伤；模型
中华创伤杂志990415 【摘要】 目的 研制接近临床状态的间接视神经损伤动物模型。方法 选日本大耳白兔,全麻后手术显露两侧眶上缘切迹和眶壁，咬除眶壁(深7～8 mm,宽6 mm),头放在致伤管下,将自制致伤卡头置于视神经孔上方眶板上,致伤球(45 g)从致伤管上端自由落下(管长2 m),击于致伤卡头,经骨板将力传递至视神经孔致伤神经,一侧不打击作对照。致伤后瞳孔散大固定，直接光反射消失为致伤成功。结果 视神经损伤发生率76.7%，合并视神经孔骨折80%，神经鞘膜出血53%，鞘膜下血肿26.7%，视神经断裂10%。结论 本模型制作方法简单易行，成功率高，骨折及鞘膜下血肿发生率与临床视神经损伤时合并情况接近，有明确的神经损伤的临床特征，是目前最接近临床损伤特征的间接视神经损伤动物模型。
, http://www.100md.com
Preparation of Animal Model with Indirect Optic Nerve Injury
WANG Yi, ZHOU Jihong, XU Lijun, et al.
Dept. of Ophthalmology, Southwestern Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038
【Abstract】 Objective Vision is often seriously damaged in optic nerve injury. Most cases seen in clinics are indirect injuries. But animal model approaching the clinical features of indirect optic nerve injury has not been reported at home and abroad. Accordingly it is an urgent need to prepare an animal model for elucidation of the pathological course and for direction of clinical treatment of indirect optic nerve injury. Methods Under general anesthesia, the bilateral supra-orbital noches and orbital walls were surgically exposed. A rectangular gap on either side of orbital walls was made by excision of a portion of orbital lamina (7-8mm deep and 6 mm wide) from supra-orbital notch downwards to the optic foramen, so the underlying optic nerve was left intact. Then a self-made traumatic clamp was clamped on the upper margin of the remained orbital lamina above the optic foramen. A traumatic tube (length, 2m; inner diameter, 25mm) was perpendicalarly placed 25 mm above the traumatic clamp. Lastly, a rustless steel ball, (weight, 45 g; diameter, 22.25 mm) was dropped freely from the upper orifice of the traumatic tube and hit upon the upper surface of traumatic clamp. Occurrence of fixed pupil dilatation in company with loss of direct light reflex immediately after the struck were takenas criteria for a successful trauma. The optic nerve on the control side was not struck. Results Incidence of optic nerve injury was 76.7%. Gross anatomy, bone fractures of optic foramen 80%, hemorrhage of neurilemma 53%, subneurilemma hematoma 26% and separation of optic nerve 10%. Conclusions The method to prepare this model is simple, easy to use and of high success rate. The model, having incidence of bone fractures and subpial hematoma, similar to complications of clinical nerve injuries and definite clinical criteria for diagnosis of nerve injury, is therefore one of the most approaching clinical features of indirect optic nerve injury.
, 百拇医药
【Key words】 Optic nerve Wounds and injuries Animal model
临床最常见的视神经损伤为间接损伤，目前对视神经损伤研究采用的致伤方法主要为钳夹、牵拉、冷冻，气囊压迫和切断等[1-4]，所造成的视神经损伤与临床间接视神经损伤特征存在较大差异，不能满足临床研究需要。为此，我们设计研制出接近临床状态的间接视神经损伤动物模型，为系统研究奠定基础。
材料与方法
一、 实验动物
日本纯种大耳白兔60只，体重2.0～2.5 kg，分为两组，每组30只。
二、 动物模型的制作
1.模型制作方法之一：闭合式打击法。(1)致伤设备：装置如图1，为自由落体原理。主要有底座、工作台、可调滑动杆和打击锤4部分组成。致伤强度可调节。本实验致伤冲量1.30 kg*m。(2)动物模型制作：选取致伤眼眶上缘切迹内、后各0.5 cm为打击点，用龙胆紫标记，以标记点为中心用一相配的聚乙烯板(35 mm×25 mm×2 mm)保护，兔头置于工作台园孔窗下，打击点为中心点，用1.30 kg*m致伤冲量，对标记点打击，打击后的兔子喂养观察。
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图1 闭合式打击法致伤装置示意图
图2 开放式打击法致伤装置示意图
2. 模型制作方法之二：开放式打击法。(1)致伤设备：装置如图2，由以下几部分构成：致伤管(长2 m、内径25 mm)、致伤球(45 g)、致伤卡头(上方直径30 mm圆盘，下方为直径5 mm、长40 mm圆杆，杆的顶端为3 mm方形头，中央为宽1.5 mm、深1 mm槽)，致伤冲量为重量乘以管的长度，本实验致伤冲量为0.09 kg*m。(2)动物模型制作：质量浓度为30 g/L的戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉注射麻醉。手术显露两侧的眶上缘切迹和眶壁。用咬骨钳经两侧眶上缘切迹处向视神经管方向咬除部分眶壁骨板(深7～8mm、宽6mm)，保持硬脑膜和眶骨膜的完整性及视神经管的完整性。兔头放在致伤管下，将致伤卡头卡在一侧视神经孔上方的眶板上，调整卡头和兔头角度(兔头右侧斜15°)，使卡头与致伤管成一线，球从管上端自由落下击于卡头。对侧不打击作对照，缝合伤口，喂养观察。
, 百拇医药
3. 视神经损伤判定及组织学检查：(1)致伤眼直接对光反射消失，瞳孔散大固定，为成功致伤模型。(2)取伤后7天传入性瞳孔反射异常及对照眼的神经组织，作组织学检查(光镜、电镜)。
4. 统计学处理：数据采用卡方检验。
结 果
一、 致伤率及并发症
两种方法打击后，如果有视神经损伤，在麻醉清醒后，表现为瞳孔散大，直接对光反射消失。其致伤率及并发症见表1，2，3。
二、 组织学改变
表1 两种方法视神经损伤发生率和死亡率的比较[兔数(百分率)] 方法
兔数
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视神经损伤
7天内死亡
闭合法
30
5(16.7)
9(30.0)
开放法
30
23(76.7)**
2(6.7)*
组间比较：*P<0.05，**P<0.01表2 两种方法的并发症比较[兔数(百分率)] 方法
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并发症
下颌骨折
鼻出血
眼内出血
脑挫伤
感染
闭合法
22(73.3)
26(86.7)
3(10.0)
6(20.0)
-
开放法
, 百拇医药
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
1(3.3)*
2(6.7)
组间比较：*P<0.05表3 两种方法打击后视神经及周围组织异常发生率[兔数(百分率)] 方法
并发症
眶壁骨折
神经鞘膜出血
鞘膜下血肿
视神经断裂
, 百拇医药
闭合法
20(66.7)
3(10.0)
4(13.3)
0(0.0)
开放法
24(80.0)
16(53.3)**
8(26.7)
3(10.0)
组间比较：**P<0.01 1. 光镜：两种方法的视神经组织表现为部分区域呈现脱髓鞘改变，组织疏松呈网状，部分轴突裸露，在神经软膜有细胞浸润，胶质细胞分布不均有增生，而对照眼组织学正常。
, 百拇医药
2. 电镜：神经纤维疏松，髓鞘普遍变性，线粒体肿胀，严重的成空泡状。部分变性髓鞘形成洋葱样小体，胶质增生，有灶性水肿软化区存在。
讨 论
临床常见的视神经损伤，多为致伤力通过颅骨的传导，在伴发或不伴发视神经管骨折的情况下致视神经损伤。根据临床视神经损伤的特点，我们首先采用闭合式打击法。Gross等[5]利用全息摄影干涉量度法对人的颅骨进行研究，观察到施加到额骨的力通过骨的传导最终集中在视神经管的区域造成视神经的损伤。临床资料也表明，额颞部受力最易致视神经损伤。表明受力点是视神经损伤的重要因素之一。结合我们对兔眶骨的观察及实验摸索，把打击的位点定在兔的眶缘切迹后、内各0.5 cm区域颅顶，致伤冲量从0.5 kg*m开始逐步加大，当达1.30 kg*m时，可以稳定地出现视神经管及周围骨折的改变。通过对30只兔子进行打击观察，发现视神经损伤率16.7%。再加大致伤强度，则动物死亡率陡增。分析其原因，从力学原理出发，打击后眶壁产生一下传振动波，只有当下传振动波和反射波相交，才能产生最大损伤效应，最易造成骨壁和视神经损伤，而两波交会点是一个随机点。因此出现我们所见的低成功率，也可解释临床上闭合性颅脑外伤合并视神经损伤的发病率为什么并不高。因此，该模型由于低成功率，高合并症及高死亡率不能满足科学研究的需要。
, 百拇医药
第二设计是开放式打击法。经眶缘切迹处向视神经孔方向咬除部分眶壁，在视神经孔上方眶壁打击。我们采用不同大小球体，在不同的高度自由落体进行打击和抗打击试验，寻找出最佳组合。最后得出45 g重的球体(直径22.24 mm)，从2 m高落下，其致伤冲量0.09 kg*m；眶壁咬除的范围，从眶缘切迹向下深7～8 mm，宽6 mm，两者结合可有效的致神经损伤。对30只兔子进行致伤实验，成功率达76.7%。骨折率为80%，视神经鞘出血和鞘膜下血肿分别为53.3%和26.7%，与临床间接视神经损伤中的神经鞘出血率为87%，骨折率为50%比较接近[6，7]。而且本模型制作有如下特点：(1)视神经损伤的同时保持了其完整性；(2)致伤设备简单、操作方法易行；(3)有明显临床视神经损伤判定征象(瞳孔散大，直接光反射消失)；(4)伤情稳定、重复性好，又可大致定量。
从上述可见，闭合式打击法虽与临床视神经损伤特点相符合，但由于低成功率及高死亡率，不是理想的模型制作方法。而开放式打击由于咬除部分眶壁，使其打击力量更加集中，方向性更好，以低致伤强度能稳定地，高成功率致视神经损伤。与其他视神经损伤模型相比，更接近临床间接视神经损伤特征。
, 百拇医药
瞳孔反应更常作为判定视神经损伤已为大家所公认。在单侧视神经损伤病人，传入性瞳孔反射异常是诊断视神经损伤的必要条件[8，9]。本研究中，我们选择打击后传入性瞳孔反射异常的视神经组织，经光镜和电镜检查，证实了神经有损伤的组织学改变。而打击后未成功的动物(即瞳孔反应正常者)和对侧神经组织病理检查则正常。因此，传入性瞳孔反射异常也可作为动物视神经损伤判定的简易而可靠指标。
参考文献
1 Kostyk SK, D'Amore PA, Herman IR, et al. Optic nerve injury alter basic fibroblast growth factor localization in the retina and optic tract. J Neurosci, 1994, 14∶1441-1449.
2 Gennarelli TA, Thibault LE, Tipperman R, et al. Axonal injury in the optic nerve: a model simulating diffuse axonal injury in the brain. J Neurosurg, 1989, 71∶224-253.
, 百拇医药
3 Murakami M, lde C, Kanaya H. Regeneration in the rat optic nerve after cold injury. J Neurosurg, 1989, 71∶254-265.
4 Haciyakupoglu G, Ozdemir N, Polat S, et al. Ultrastructural finding and SOD levels in experimental optic nerve injury: effect of thyroid-releasing hormone on the degenerative and regenerative processes. Ophthalmologica, 1994, 208∶270-277.
5 Gross CE, Dekock JR, Painje WR, et al. Evidence for orbital deformation that may contribute to monocular blindness following minor frontal head trauma. J Neurosurg, 1981, 55∶963-966.
, http://www.100md.com
6 Muller PT. Intracranial hypertension. J Neurosurg, 1974, 41∶160-166.
7 Seill SR. High dose corlicosteroids for treatment of vision loss due to indirect injury to the optic nerve. Ophthalmic Surg, 1990, 21∶389-395.
8 Warner JEA, Lessell S. Traumatic optic neuropathy. Int Ophthalmol Clin, 1995, 35∶57-62.
9 Steinsapir KD, Goldberg RA. Traumatic optic neuropathy. Surg Ophthalmology, 1994, 38∶487-518.
收稿日期：1998-09-24
修稿日期：1999-03-26, http://www.100md.com
单位：王一、周继红、许立军 400038 重庆，第三军医大学附属西南医院眼科；马志中 解放军总医院眼科；刘 杰 解放军第三O四医院眼科
关键词：视神经；创伤和损伤；模型
中华创伤杂志990415 【摘要】 目的 研制接近临床状态的间接视神经损伤动物模型。方法 选日本大耳白兔,全麻后手术显露两侧眶上缘切迹和眶壁，咬除眶壁(深7～8 mm,宽6 mm),头放在致伤管下,将自制致伤卡头置于视神经孔上方眶板上,致伤球(45 g)从致伤管上端自由落下(管长2 m),击于致伤卡头,经骨板将力传递至视神经孔致伤神经,一侧不打击作对照。致伤后瞳孔散大固定，直接光反射消失为致伤成功。结果 视神经损伤发生率76.7%，合并视神经孔骨折80%，神经鞘膜出血53%，鞘膜下血肿26.7%，视神经断裂10%。结论 本模型制作方法简单易行，成功率高，骨折及鞘膜下血肿发生率与临床视神经损伤时合并情况接近，有明确的神经损伤的临床特征，是目前最接近临床损伤特征的间接视神经损伤动物模型。
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Preparation of Animal Model with Indirect Optic Nerve Injury
WANG Yi, ZHOU Jihong, XU Lijun, et al.
Dept. of Ophthalmology, Southwestern Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038
【Abstract】 Objective Vision is often seriously damaged in optic nerve injury. Most cases seen in clinics are indirect injuries. But animal model approaching the clinical features of indirect optic nerve injury has not been reported at home and abroad. Accordingly it is an urgent need to prepare an animal model for elucidation of the pathological course and for direction of clinical treatment of indirect optic nerve injury. Methods Under general anesthesia, the bilateral supra-orbital noches and orbital walls were surgically exposed. A rectangular gap on either side of orbital walls was made by excision of a portion of orbital lamina (7-8mm deep and 6 mm wide) from supra-orbital notch downwards to the optic foramen, so the underlying optic nerve was left intact. Then a self-made traumatic clamp was clamped on the upper margin of the remained orbital lamina above the optic foramen. A traumatic tube (length, 2m; inner diameter, 25mm) was perpendicalarly placed 25 mm above the traumatic clamp. Lastly, a rustless steel ball, (weight, 45 g; diameter, 22.25 mm) was dropped freely from the upper orifice of the traumatic tube and hit upon the upper surface of traumatic clamp. Occurrence of fixed pupil dilatation in company with loss of direct light reflex immediately after the struck were takenas criteria for a successful trauma. The optic nerve on the control side was not struck. Results Incidence of optic nerve injury was 76.7%. Gross anatomy, bone fractures of optic foramen 80%, hemorrhage of neurilemma 53%, subneurilemma hematoma 26% and separation of optic nerve 10%. Conclusions The method to prepare this model is simple, easy to use and of high success rate. The model, having incidence of bone fractures and subpial hematoma, similar to complications of clinical nerve injuries and definite clinical criteria for diagnosis of nerve injury, is therefore one of the most approaching clinical features of indirect optic nerve injury.
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【Key words】 Optic nerve Wounds and injuries Animal model
临床最常见的视神经损伤为间接损伤，目前对视神经损伤研究采用的致伤方法主要为钳夹、牵拉、冷冻，气囊压迫和切断等[1-4]，所造成的视神经损伤与临床间接视神经损伤特征存在较大差异，不能满足临床研究需要。为此，我们设计研制出接近临床状态的间接视神经损伤动物模型，为系统研究奠定基础。
材料与方法
一、 实验动物
日本纯种大耳白兔60只，体重2.0～2.5 kg，分为两组，每组30只。
二、 动物模型的制作
1.模型制作方法之一：闭合式打击法。(1)致伤设备：装置如图1，为自由落体原理。主要有底座、工作台、可调滑动杆和打击锤4部分组成。致伤强度可调节。本实验致伤冲量1.30 kg*m。(2)动物模型制作：选取致伤眼眶上缘切迹内、后各0.5 cm为打击点，用龙胆紫标记，以标记点为中心用一相配的聚乙烯板(35 mm×25 mm×2 mm)保护，兔头置于工作台园孔窗下，打击点为中心点，用1.30 kg*m致伤冲量，对标记点打击，打击后的兔子喂养观察。
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图1 闭合式打击法致伤装置示意图
图2 开放式打击法致伤装置示意图
2. 模型制作方法之二：开放式打击法。(1)致伤设备：装置如图2，由以下几部分构成：致伤管(长2 m、内径25 mm)、致伤球(45 g)、致伤卡头(上方直径30 mm圆盘，下方为直径5 mm、长40 mm圆杆，杆的顶端为3 mm方形头，中央为宽1.5 mm、深1 mm槽)，致伤冲量为重量乘以管的长度，本实验致伤冲量为0.09 kg*m。(2)动物模型制作：质量浓度为30 g/L的戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉注射麻醉。手术显露两侧的眶上缘切迹和眶壁。用咬骨钳经两侧眶上缘切迹处向视神经管方向咬除部分眶壁骨板(深7～8mm、宽6mm)，保持硬脑膜和眶骨膜的完整性及视神经管的完整性。兔头放在致伤管下，将致伤卡头卡在一侧视神经孔上方的眶板上，调整卡头和兔头角度(兔头右侧斜15°)，使卡头与致伤管成一线，球从管上端自由落下击于卡头。对侧不打击作对照，缝合伤口，喂养观察。
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3. 视神经损伤判定及组织学检查：(1)致伤眼直接对光反射消失，瞳孔散大固定，为成功致伤模型。(2)取伤后7天传入性瞳孔反射异常及对照眼的神经组织，作组织学检查(光镜、电镜)。
4. 统计学处理：数据采用卡方检验。
结 果
一、 致伤率及并发症
两种方法打击后，如果有视神经损伤，在麻醉清醒后，表现为瞳孔散大，直接对光反射消失。其致伤率及并发症见表1，2，3。
二、 组织学改变
表1 两种方法视神经损伤发生率和死亡率的比较[兔数(百分率)] 方法
兔数
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视神经损伤
7天内死亡
闭合法
30
5(16.7)
9(30.0)
开放法
30
23(76.7)**
2(6.7)*
组间比较：*P<0.05，**P<0.01表2 两种方法的并发症比较[兔数(百分率)] 方法
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并发症
下颌骨折
鼻出血
眼内出血
脑挫伤
感染
闭合法
22(73.3)
26(86.7)
3(10.0)
6(20.0)
-
开放法
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0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
1(3.3)*
2(6.7)
组间比较：*P<0.05表3 两种方法打击后视神经及周围组织异常发生率[兔数(百分率)] 方法
并发症
眶壁骨折
神经鞘膜出血
鞘膜下血肿
视神经断裂
, 百拇医药
闭合法
20(66.7)
3(10.0)
4(13.3)
0(0.0)
开放法
24(80.0)
16(53.3)**
8(26.7)
3(10.0)
组间比较：**P<0.01 1. 光镜：两种方法的视神经组织表现为部分区域呈现脱髓鞘改变，组织疏松呈网状，部分轴突裸露，在神经软膜有细胞浸润，胶质细胞分布不均有增生，而对照眼组织学正常。
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2. 电镜：神经纤维疏松，髓鞘普遍变性，线粒体肿胀，严重的成空泡状。部分变性髓鞘形成洋葱样小体，胶质增生，有灶性水肿软化区存在。
讨 论
临床常见的视神经损伤，多为致伤力通过颅骨的传导，在伴发或不伴发视神经管骨折的情况下致视神经损伤。根据临床视神经损伤的特点，我们首先采用闭合式打击法。Gross等[5]利用全息摄影干涉量度法对人的颅骨进行研究，观察到施加到额骨的力通过骨的传导最终集中在视神经管的区域造成视神经的损伤。临床资料也表明，额颞部受力最易致视神经损伤。表明受力点是视神经损伤的重要因素之一。结合我们对兔眶骨的观察及实验摸索，把打击的位点定在兔的眶缘切迹后、内各0.5 cm区域颅顶，致伤冲量从0.5 kg*m开始逐步加大，当达1.30 kg*m时，可以稳定地出现视神经管及周围骨折的改变。通过对30只兔子进行打击观察，发现视神经损伤率16.7%。再加大致伤强度，则动物死亡率陡增。分析其原因，从力学原理出发，打击后眶壁产生一下传振动波，只有当下传振动波和反射波相交，才能产生最大损伤效应，最易造成骨壁和视神经损伤，而两波交会点是一个随机点。因此出现我们所见的低成功率，也可解释临床上闭合性颅脑外伤合并视神经损伤的发病率为什么并不高。因此，该模型由于低成功率，高合并症及高死亡率不能满足科学研究的需要。
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第二设计是开放式打击法。经眶缘切迹处向视神经孔方向咬除部分眶壁，在视神经孔上方眶壁打击。我们采用不同大小球体，在不同的高度自由落体进行打击和抗打击试验，寻找出最佳组合。最后得出45 g重的球体(直径22.24 mm)，从2 m高落下，其致伤冲量0.09 kg*m；眶壁咬除的范围，从眶缘切迹向下深7～8 mm，宽6 mm，两者结合可有效的致神经损伤。对30只兔子进行致伤实验，成功率达76.7%。骨折率为80%，视神经鞘出血和鞘膜下血肿分别为53.3%和26.7%，与临床间接视神经损伤中的神经鞘出血率为87%，骨折率为50%比较接近[6，7]。而且本模型制作有如下特点：(1)视神经损伤的同时保持了其完整性；(2)致伤设备简单、操作方法易行；(3)有明显临床视神经损伤判定征象(瞳孔散大，直接光反射消失)；(4)伤情稳定、重复性好，又可大致定量。
从上述可见，闭合式打击法虽与临床视神经损伤特点相符合，但由于低成功率及高死亡率，不是理想的模型制作方法。而开放式打击由于咬除部分眶壁，使其打击力量更加集中，方向性更好，以低致伤强度能稳定地，高成功率致视神经损伤。与其他视神经损伤模型相比，更接近临床间接视神经损伤特征。
, 百拇医药
瞳孔反应更常作为判定视神经损伤已为大家所公认。在单侧视神经损伤病人，传入性瞳孔反射异常是诊断视神经损伤的必要条件[8，9]。本研究中，我们选择打击后传入性瞳孔反射异常的视神经组织，经光镜和电镜检查，证实了神经有损伤的组织学改变。而打击后未成功的动物(即瞳孔反应正常者)和对侧神经组织病理检查则正常。因此，传入性瞳孔反射异常也可作为动物视神经损伤判定的简易而可靠指标。
参考文献
1 Kostyk SK, D'Amore PA, Herman IR, et al. Optic nerve injury alter basic fibroblast growth factor localization in the retina and optic tract. J Neurosci, 1994, 14∶1441-1449.
2 Gennarelli TA, Thibault LE, Tipperman R, et al. Axonal injury in the optic nerve: a model simulating diffuse axonal injury in the brain. J Neurosurg, 1989, 71∶224-253.
, 百拇医药
3 Murakami M, lde C, Kanaya H. Regeneration in the rat optic nerve after cold injury. J Neurosurg, 1989, 71∶254-265.
4 Haciyakupoglu G, Ozdemir N, Polat S, et al. Ultrastructural finding and SOD levels in experimental optic nerve injury: effect of thyroid-releasing hormone on the degenerative and regenerative processes. Ophthalmologica, 1994, 208∶270-277.
5 Gross CE, Dekock JR, Painje WR, et al. Evidence for orbital deformation that may contribute to monocular blindness following minor frontal head trauma. J Neurosurg, 1981, 55∶963-966.
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6 Muller PT. Intracranial hypertension. J Neurosurg, 1974, 41∶160-166.
7 Seill SR. High dose corlicosteroids for treatment of vision loss due to indirect injury to the optic nerve. Ophthalmic Surg, 1990, 21∶389-395.
8 Warner JEA, Lessell S. Traumatic optic neuropathy. Int Ophthalmol Clin, 1995, 35∶57-62.
9 Steinsapir KD, Goldberg RA. Traumatic optic neuropathy. Surg Ophthalmology, 1994, 38∶487-518.
收稿日期：1998-09-24
修稿日期：1999-03-26, http://www.100md.com