血链球菌与nifs、nifu基因同源序列分析
作者：潘亚萍 张学 孙开来
单位：110002 沈阳，中国医科大学口腔医学院(潘亚萍)；基础医学院遗传教研室(张学 孙开来)
关键词：血链球菌；基因克隆；核酸序列 nif基因
中华微生物990430 【 摘要 】 目的 对具有一定的特异性和稳定性的血链球菌ATCC10556 染色体一800bp DNA 片段进行基因序列分析。方法 采用TA克隆技术并进行碱基序列测定，通过GeneBank 进行同源分析。 结果 ATCC10556 DNA片段氨基酸序列含有与固氮酶nifs、nifu 基因同源序列，同源率分别为72%，71%。与非固氮菌中的磷酸吡哆醛依赖性氨基酸转移酶基因也具有同源性，同源率63%。Southern杂交表明，与血链球菌ATCC10556相似的另2株血链球菌含有同样的nifs、nifu基因，而其它亲源相近的口腔链球菌，如血链球菌JFr菌株，变链球菌血清型c、d、f参考菌株及唾液链球菌HHT参考株不含有同样nif基因。 结论 血链球菌ATCC10556 含有的nif 基因具有一定特异性，其基因结构及其生理性功能尚待深入研究。
, 百拇医药
Streptococcus sanguis and nifs, nifu gene homology sequence analysis PAN Yaping*, ZHANG Xue, SUN Kailai. * Department of Oral Medicine of Dental School in China Medical University, Shenyang 110002
【 Abstract 】 Objective To analyse the sequence of a 800bp DNA fragment which is specific and stable contained in Streptococcus sanguis chromosome DNA. Methods TA cloning technique was utilized and the product was sequenced and analysed for homology sequence with GeneBank. Results By GeneBanks database, it showed that 800bp gene sequence contained homology with other nitrogen fixing bacteria enzyme gene-nifs and nifu gene. The nifs, nifu homologous rate was 72% and 71%, respectively. nifs family was a new class of pyridoxal phosphate-dependent enzymes, its homologous rate with ATCC10556 800bp gene fragment was 63%. Two strains of S. sanguis had the same nifs and nifu gene as ATCC10556, other oral Streptococcus like S. mutans and S. salivarus were negative by dot blotting assay. It suggested they had not same nif gene as S. sanguis. Conclusions The results suggest that this nif gene of ATCC10556 strain could be specific and its gene construction and function should be studied in the future.
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【 Subject words 】 Streptococcus sanguis Gene clone Nucleotide sequences nif gene
血链球菌为口腔早期定植菌，长期存留于口腔，也是口腔中检测频率及数量较多的一类细菌。同时，该细菌对牙周致病菌具有较强的抑制作用，其生物学特性及在口腔的生态作用受到学者们的广泛关注。通过DNA多态性分析等前期工作发现，血链球菌含有一800bp 碱基片段并具有一定的特异性，我们对此片段进行了基因分析。
材料与方法
1.菌株：血链球菌Streptococcus sanguis国际标准株 ATCC10556。血链球菌参考株S34sr、S34 非1，JFr。变链球菌S.mutans 3株参考株即血清型c、d、f。唾液链球菌S.salivarius参考株HHT。
2.试剂和仪器：PCR试剂，DNA相对分子质量标准(phix174 / Hae Ⅲ)，WizardTM PCR Preps DNA纯化试剂盒为Promega公司产品；ABI PRISM DNA 测序仪及其配套试剂盒等为PE公司产品；Eukaryotic TA Cloning System 试剂盒(含线性真核表达质粒PCRTM3，T4 DNA 连接酶，one shot 感受态细菌等)从Invitrogen 公司购买；质粒快速提取试剂盒为QIAGEN公司产品；EcoRⅠ等酶试剂为GIBCO 公司产品；DIG标记及检测试剂盒为Boehringer公司产品。
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3.PCR扩增及产物纯化：ATCC10556 染色体DNA为模板，引物为S1，S2，即5＇GAGGTCCACA 3＇，5＇CCTCTGACTG 3＇ 。扩增产物8%聚丙烯酰胺检测，1.5%低熔点琼脂糖回收DNA片段、纯化、浓度测定。
4.PCR产物核酸序列分析：采用TA克隆系统将PCR产物克隆至PCRTM3真核表达质粒上，提取质粒，用EcoRⅠ酶切确定克隆DNA，并采用荧光素引物标记，使用通用引物T7进行序列分析。
5.蛋白质氨基酸同源序列分析：将已知碱基序列转换为氨基酸序列，进入GeneBank 系统进行蛋白氨基酸同源序列分析。
6.地高辛(DIG)标记探针制备：1μg 酶切后纯化的DNA加入双蒸水16μl，5分钟煮沸变性，加入DIG标记引物4μl。制备的探针根据对照测试膜选择适当的浓度做杂交实验。
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7.Southern blotting：提取各种细菌染色体DNA煮沸变性，点样于尼龙膜，用DIG探针进行分析杂交，酶标亲和素显示阳性结果。
结果和讨论
1.血链球菌PCR扩增及氨基酸序列的测定：血链球菌通过设计一对10-mer 引物，经PCR扩增合成的片段为800bp左右，为清晰一条带，产量较高，符合克隆条件，见图1。 PCRTM3 有两个EcoRⅠ酶切位点，重组质粒经EcoRⅠ消化后预计得到816bp含血链球菌特异DNA片段。测序后所读出的序列应为载体序列→S1，S2引物序列→DNA片段碱基序列→载体序列，测序一次完成，与预期完全相符，表明运用真核TA克隆表达PCR产物获得成功，并获得了部分血链球菌的遗传基因。
图1 血链球菌PCR扩增及800bp片段纯化结果
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Fig 1. S.sanguis PCR amplification,a 800bp DNA fragment
A:Standard marker(phix174/HaeⅢ)
B：S.sanguis PCR produats
2.血链球菌nif基因同源序列分析：nif 基因(nitrogen fixed gene)为固氮菌中的固氮酶基因。Kennedy C 等研究显示,nifu， nifs及nifv基因是激活3种固氮酶活性的必要基因〔1〕，Walter Arnold〔2〕于1988年研究显示nifs和nifu在nif基因框架中是相邻基因，它们的上游基因和下游基因是固氮酶的合成基因，nifs和nifu被认为是促进蛋白合成的促进基因〔3〕。近年对nifs基因深入研究显示nifs家族蛋白是磷酸吡哆醛依赖酶，在细菌NAD生物合成中nifs基因被认为是必需基因〔4〕。固氮菌中nifs基因与非固氮菌的磷酸吡哆醛依赖性氨基酸转移酶基因有高度同源性，因此，有学者认为nifs基因为新一类磷酸吡哆醛依赖性酶家族〔5〕，其基因结构显示在丝氨酸周围有磷酸吡哆醛结合位点，因此又被称作磷酸吡哆醛依赖性丝氨酸氨基酸转移酶(pyridoxal phosphate-dependent serine aminotransferase)，其功能在于修饰或抑制蛋白发生异构，调节或改变细菌代谢途径〔6〕。
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血链球菌ATCC10556的DNA片段与18种微生物的nif基因进行同源序列分析表明,它与集胞藻菌属的nifs基因同源率为72%，氨基酸序列位于+3阅读框架内；与蓝绿藻目菌nifu基因同源率为71%，位于+2氨基酸阅读框架内；它与大肠杆菌nifs nifu基因同源率分别为63%，70%；与麻风分枝杆菌nifs nifu基因同源率分别为72%，58%；与肺炎克氏杆菌nifs，nifu基因同源率分别为67%，65%。 血链球菌800bp DNA片段中的nifs基因主要位于其碱基序列第(9～220)bp和(558～701)bp区域内，nifu基因位于第(147～223)bp和(383～502)bp区域,显示血链球nifs和nifu基因分别为两个区域并有部分区域重叠。
3.口腔链球菌nif基因的检测： 斑点印迹杂交结果表明血链球菌S34sr，S34 非1与血链球菌ATCC10556特异DNA制备的探针杂交强阳性，显示两种菌株都含有同样nifs nifu基因，另一血链球菌参考株JFr杂交阴性表明无同样nif基因。虽然变链球菌、唾液链球菌与血链球菌亲源性相近，但杂交阴性，未发现同样的nif基因，见图2。
, 百拇医药
图2 细菌斑点杂交结果(3株细菌为阳性结果，其它细菌阴性)
Fig 2. The results of bacteria dot blotting and hybridization(three bacteria strains are positive,others are negative)
A,B,C:S.sanguis with strains;D:S.salivarius HHT;E,F,G:S.mutans of serum types of c,d,f; H:S.sanguis S34sr;I:S.sanguis S34 no 1; J:S.sanguis JFr; K,L:S.mutans wild strains;M:Negative control,TE solution;N:Positive control,ATCC 10556 enzyme digestion products
, 百拇医药
血链球菌目前被认为是基因来源不完全一致的一组菌群，同时研究表明，在nif基因群中只有nif HDK的DNA序列保守性强，细菌种属间的同源率较高，同源率可达90%，而其它调节基因保守性较差，细菌之间同源率也较低，大约在(30～50)%之间〔7〕。口腔其它细菌是否含有nif基因尚待深入研究。
本课题受美国中华医学会CMB基金资助
参考文献
1 Kennedy C, Dean D. The nifu, nifs and nifv gene products are regulated for activity of all the three nitrogenases of Azotobacter vinelandii. Mol Gen Genet, 1992, 231∶494-498.
2 Arnold WA, Rump WK, Prifer UB, et al.Nucleotide sequence of a 24，206-base pair DNA fragment containing the entire nitrogen fixation gene cluster of Klebsiella pneumoniae.J Mol Biol, 1988, 203∶715-738.
, 百拇医药
3 Jacobson MR, Bridge KE, Bennett LT, et al.Physical and genetic map of the major nif gene cluster from Azotobacter vinelandii. J Bacteriol, 1989, 171∶1017-1027.
4 Leong-Morgenthaler P, Oliver SG, Hottinger H, at al.A Lactobacillus nifs-like gene suppresses an Escherichia coli transaminase. Biochimie 1994, 76∶45-49.
5 Ouzounis C, Sander C. Homology of the nifs family of proteins to a new class of pyridoxal phosphate-dependent enzymes. FEBS Lett 1993，322∶159-164.
6 Hoover TR, Robertson AD, Cernly RC, et al.Identification of the V factor needed for synthesis of the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase as homocitrate. Nature (London), 1987, 329∶855-857.
7 阎大来，李季伦.几种固氮菌基因片段nifA的同源性分析.微生物学报，1992, 32∶309-313.
(收稿：1998-06-17 修回：1998-10-13), 百拇医药
单位：110002 沈阳，中国医科大学口腔医学院(潘亚萍)；基础医学院遗传教研室(张学 孙开来)
关键词：血链球菌；基因克隆；核酸序列 nif基因
中华微生物990430 【 摘要 】 目的 对具有一定的特异性和稳定性的血链球菌ATCC10556 染色体一800bp DNA 片段进行基因序列分析。方法 采用TA克隆技术并进行碱基序列测定，通过GeneBank 进行同源分析。 结果 ATCC10556 DNA片段氨基酸序列含有与固氮酶nifs、nifu 基因同源序列，同源率分别为72%，71%。与非固氮菌中的磷酸吡哆醛依赖性氨基酸转移酶基因也具有同源性，同源率63%。Southern杂交表明，与血链球菌ATCC10556相似的另2株血链球菌含有同样的nifs、nifu基因，而其它亲源相近的口腔链球菌，如血链球菌JFr菌株，变链球菌血清型c、d、f参考菌株及唾液链球菌HHT参考株不含有同样nif基因。 结论 血链球菌ATCC10556 含有的nif 基因具有一定特异性，其基因结构及其生理性功能尚待深入研究。
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Streptococcus sanguis and nifs, nifu gene homology sequence analysis PAN Yaping*, ZHANG Xue, SUN Kailai. * Department of Oral Medicine of Dental School in China Medical University, Shenyang 110002
【 Abstract 】 Objective To analyse the sequence of a 800bp DNA fragment which is specific and stable contained in Streptococcus sanguis chromosome DNA. Methods TA cloning technique was utilized and the product was sequenced and analysed for homology sequence with GeneBank. Results By GeneBanks database, it showed that 800bp gene sequence contained homology with other nitrogen fixing bacteria enzyme gene-nifs and nifu gene. The nifs, nifu homologous rate was 72% and 71%, respectively. nifs family was a new class of pyridoxal phosphate-dependent enzymes, its homologous rate with ATCC10556 800bp gene fragment was 63%. Two strains of S. sanguis had the same nifs and nifu gene as ATCC10556, other oral Streptococcus like S. mutans and S. salivarus were negative by dot blotting assay. It suggested they had not same nif gene as S. sanguis. Conclusions The results suggest that this nif gene of ATCC10556 strain could be specific and its gene construction and function should be studied in the future.
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【 Subject words 】 Streptococcus sanguis Gene clone Nucleotide sequences nif gene
血链球菌为口腔早期定植菌，长期存留于口腔，也是口腔中检测频率及数量较多的一类细菌。同时，该细菌对牙周致病菌具有较强的抑制作用，其生物学特性及在口腔的生态作用受到学者们的广泛关注。通过DNA多态性分析等前期工作发现，血链球菌含有一800bp 碱基片段并具有一定的特异性，我们对此片段进行了基因分析。
材料与方法
1.菌株：血链球菌Streptococcus sanguis国际标准株 ATCC10556。血链球菌参考株S34sr、S34 非1，JFr。变链球菌S.mutans 3株参考株即血清型c、d、f。唾液链球菌S.salivarius参考株HHT。
2.试剂和仪器：PCR试剂，DNA相对分子质量标准(phix174 / Hae Ⅲ)，WizardTM PCR Preps DNA纯化试剂盒为Promega公司产品；ABI PRISM DNA 测序仪及其配套试剂盒等为PE公司产品；Eukaryotic TA Cloning System 试剂盒(含线性真核表达质粒PCRTM3，T4 DNA 连接酶，one shot 感受态细菌等)从Invitrogen 公司购买；质粒快速提取试剂盒为QIAGEN公司产品；EcoRⅠ等酶试剂为GIBCO 公司产品；DIG标记及检测试剂盒为Boehringer公司产品。
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3.PCR扩增及产物纯化：ATCC10556 染色体DNA为模板，引物为S1，S2，即5＇GAGGTCCACA 3＇，5＇CCTCTGACTG 3＇ 。扩增产物8%聚丙烯酰胺检测，1.5%低熔点琼脂糖回收DNA片段、纯化、浓度测定。
4.PCR产物核酸序列分析：采用TA克隆系统将PCR产物克隆至PCRTM3真核表达质粒上，提取质粒，用EcoRⅠ酶切确定克隆DNA，并采用荧光素引物标记，使用通用引物T7进行序列分析。
5.蛋白质氨基酸同源序列分析：将已知碱基序列转换为氨基酸序列，进入GeneBank 系统进行蛋白氨基酸同源序列分析。
6.地高辛(DIG)标记探针制备：1μg 酶切后纯化的DNA加入双蒸水16μl，5分钟煮沸变性，加入DIG标记引物4μl。制备的探针根据对照测试膜选择适当的浓度做杂交实验。
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7.Southern blotting：提取各种细菌染色体DNA煮沸变性，点样于尼龙膜，用DIG探针进行分析杂交，酶标亲和素显示阳性结果。
结果和讨论
1.血链球菌PCR扩增及氨基酸序列的测定：血链球菌通过设计一对10-mer 引物，经PCR扩增合成的片段为800bp左右，为清晰一条带，产量较高，符合克隆条件，见图1。 PCRTM3 有两个EcoRⅠ酶切位点，重组质粒经EcoRⅠ消化后预计得到816bp含血链球菌特异DNA片段。测序后所读出的序列应为载体序列→S1，S2引物序列→DNA片段碱基序列→载体序列，测序一次完成，与预期完全相符，表明运用真核TA克隆表达PCR产物获得成功，并获得了部分血链球菌的遗传基因。
图1 血链球菌PCR扩增及800bp片段纯化结果
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Fig 1. S.sanguis PCR amplification,a 800bp DNA fragment
A:Standard marker(phix174/HaeⅢ)
B：S.sanguis PCR produats
2.血链球菌nif基因同源序列分析：nif 基因(nitrogen fixed gene)为固氮菌中的固氮酶基因。Kennedy C 等研究显示,nifu， nifs及nifv基因是激活3种固氮酶活性的必要基因〔1〕，Walter Arnold〔2〕于1988年研究显示nifs和nifu在nif基因框架中是相邻基因，它们的上游基因和下游基因是固氮酶的合成基因，nifs和nifu被认为是促进蛋白合成的促进基因〔3〕。近年对nifs基因深入研究显示nifs家族蛋白是磷酸吡哆醛依赖酶，在细菌NAD生物合成中nifs基因被认为是必需基因〔4〕。固氮菌中nifs基因与非固氮菌的磷酸吡哆醛依赖性氨基酸转移酶基因有高度同源性，因此，有学者认为nifs基因为新一类磷酸吡哆醛依赖性酶家族〔5〕，其基因结构显示在丝氨酸周围有磷酸吡哆醛结合位点，因此又被称作磷酸吡哆醛依赖性丝氨酸氨基酸转移酶(pyridoxal phosphate-dependent serine aminotransferase)，其功能在于修饰或抑制蛋白发生异构，调节或改变细菌代谢途径〔6〕。
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血链球菌ATCC10556的DNA片段与18种微生物的nif基因进行同源序列分析表明,它与集胞藻菌属的nifs基因同源率为72%，氨基酸序列位于+3阅读框架内；与蓝绿藻目菌nifu基因同源率为71%，位于+2氨基酸阅读框架内；它与大肠杆菌nifs nifu基因同源率分别为63%，70%；与麻风分枝杆菌nifs nifu基因同源率分别为72%，58%；与肺炎克氏杆菌nifs，nifu基因同源率分别为67%，65%。 血链球菌800bp DNA片段中的nifs基因主要位于其碱基序列第(9～220)bp和(558～701)bp区域内，nifu基因位于第(147～223)bp和(383～502)bp区域,显示血链球nifs和nifu基因分别为两个区域并有部分区域重叠。
3.口腔链球菌nif基因的检测： 斑点印迹杂交结果表明血链球菌S34sr，S34 非1与血链球菌ATCC10556特异DNA制备的探针杂交强阳性，显示两种菌株都含有同样nifs nifu基因，另一血链球菌参考株JFr杂交阴性表明无同样nif基因。虽然变链球菌、唾液链球菌与血链球菌亲源性相近，但杂交阴性，未发现同样的nif基因，见图2。
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图2 细菌斑点杂交结果(3株细菌为阳性结果，其它细菌阴性)
Fig 2. The results of bacteria dot blotting and hybridization(three bacteria strains are positive,others are negative)
A,B,C:S.sanguis with strains;D:S.salivarius HHT;E,F,G:S.mutans of serum types of c,d,f; H:S.sanguis S34sr;I:S.sanguis S34 no 1; J:S.sanguis JFr; K,L:S.mutans wild strains;M:Negative control,TE solution;N:Positive control,ATCC 10556 enzyme digestion products
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血链球菌目前被认为是基因来源不完全一致的一组菌群，同时研究表明，在nif基因群中只有nif HDK的DNA序列保守性强，细菌种属间的同源率较高，同源率可达90%，而其它调节基因保守性较差，细菌之间同源率也较低，大约在(30～50)%之间〔7〕。口腔其它细菌是否含有nif基因尚待深入研究。
本课题受美国中华医学会CMB基金资助
参考文献
1 Kennedy C, Dean D. The nifu, nifs and nifv gene products are regulated for activity of all the three nitrogenases of Azotobacter vinelandii. Mol Gen Genet, 1992, 231∶494-498.
2 Arnold WA, Rump WK, Prifer UB, et al.Nucleotide sequence of a 24，206-base pair DNA fragment containing the entire nitrogen fixation gene cluster of Klebsiella pneumoniae.J Mol Biol, 1988, 203∶715-738.
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3 Jacobson MR, Bridge KE, Bennett LT, et al.Physical and genetic map of the major nif gene cluster from Azotobacter vinelandii. J Bacteriol, 1989, 171∶1017-1027.
4 Leong-Morgenthaler P, Oliver SG, Hottinger H, at al.A Lactobacillus nifs-like gene suppresses an Escherichia coli transaminase. Biochimie 1994, 76∶45-49.
5 Ouzounis C, Sander C. Homology of the nifs family of proteins to a new class of pyridoxal phosphate-dependent enzymes. FEBS Lett 1993，322∶159-164.
6 Hoover TR, Robertson AD, Cernly RC, et al.Identification of the V factor needed for synthesis of the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase as homocitrate. Nature (London), 1987, 329∶855-857.
7 阎大来，李季伦.几种固氮菌基因片段nifA的同源性分析.微生物学报，1992, 32∶309-313.
(收稿：1998-06-17 修回：1998-10-13), 百拇医药