肝细胞癌患者偏移免疫治疗前后T细胞亚群分析*
作者：肖兰风 刘琥琥 黄树林
单位：广东药学院分子生物学研究室 广东省广州市 510224
关键词：肝肿瘤/治疗；癌，肝细胞/治疗；CD4细胞；CD3细胞；CD8细胞；免疫治疗
世界华人消化杂志990430
Subject headings liver neoplasms/therapy; carcinoma, hepatocellular/therapy; CD4 cells; CD3 cells; CD8 cells; immunotherapy
中国图书资料分类号 R735.7
肿瘤免疫反应是涉及各种免疫细胞和细胞因子(CK)以及它们之间相互作用的复杂过程，这个过程大致可以分为相互联系、交错进行的两个阶段，即诱导阶段和效应阶段. 诱导阶段包括对抗原的识别、免疫细胞的增殖和活化. 在免疫反应的诱导阶段，以辅助T细胞(Th)的活化为其中心环节. Th活化在细胞免疫和体液免疫中都是不可缺少的，而在效应阶段，CTL，M，NK以及某些CK都对靶分子攻击[1]. 在杀伤肿瘤细胞过程中，CD28与B7分子相互作用对T细胞的共激活是非常重要的，而且与膜表面分子表达相对应. 因此我们报告共刺激激活T细胞，并加强APC的递呈抗原的能力，用流式细胞术(FACS)分析T细胞CD3的转化，CD4偏移，CD8变化，为促进肝癌的治疗寻找依据.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 单克隆抗体(mAb)来源 CD28，T细胞亚群，干粉；CD80，B细胞亚群，干粉；CD3，成熟T细胞；CD4+，辅助/诱导T细胞；CD8+，抑制/细胞毒性T细胞(均购自Immunotech公司).
1.2 FACS检测PBL表型 健康人11例外周血(PBL)，每例1mL，肝细胞癌(HCC)患者11例血，每例1mL，加等体积Hanks液稀释，Ficoll密度梯度离心，收集淋巴细胞，Hanks液洗涤3次，计数，调整细胞数为1×109/L，加入20μL mAb(CD3，CD4+,CD8+)，设对照1管(鼠IgG-FITC 20μL再加入5×105淋巴细胞100μL，4℃孵育30min后加PBS 1mL，1800r/min离心5min，去上清，再加入1mL PBS)，上机(EPICS.Rcoulter公司).
, 百拇医药
1.3 淋巴细胞的分离培养 正常人外周血100mL(广州血液中心)，加等体积Hanks液稀释，Ficoll密度梯度离心，收集淋巴细胞，Hanks液洗涤3次，计数，以1×109/L 悬浮于RPMI1640液中(含100mL/L小牛血清)，(IL-2 200kU/L，CD3 mAb 70μg/L，CD28 mAb 1pg/cell，CD80 mAb 1pg/cell)，37℃， 50mL/L CO2孵箱中培养6d～10d，细胞数达1×108[2].
2 结果
健康志愿者PBL(未培养)CD4与CD8的表达没有明显差异. 肝癌患者免疫治疗前CD4偏移(No. 1，3，5，6，8，9，10，11)，mAb共激活PBL输入患者1wk后再次取血，FACS检测PBL(未经培养)，发现CD3转化降低，CD4偏移消失(11例中有3例CD4仍偏移，No.2,5,9)，8例患者CD8增高(No.1，2，3，4，7，8，10，11).
, http://www.100md.com
3 讨论
不同来源的PBL，其T细胞膜表面分子有着不同的表型特征，这与免疫细胞的功能状态密切相关，也关系到肿瘤的治疗效果[3]. 抗原与TCR结合是免疫应答的开始(第一信号)，当APC表达B7分子作用T细胞表面的CD28作为第二刺激信号时，T细胞才激活、分裂、增殖[4]. 为了促进T细胞的杀伤作用和粘附分子分泌，以及NK细胞的杀伤功能，我们将共刺激(CD28+80)后的健康人PBL输入肝癌患者，结果发现，在输入前，肝癌患者PBL有CD4偏移现象，而输入后CD4偏移消失，且CD8增多，CD3降低. 此现象在健康人组中未见到. 这提示总T细胞向CTL转化，CD4偏移消失有利于诱导阶段转向效应阶段，发挥抗肿瘤作用. 这也可能是肝癌患者T细胞某些功能被抑制，不能充分表达其膜表面分子，当共激活PBL输入体内，在癌抗原的参与下，T细胞的TCR接受APC相应抗原的刺激，具有该TCR的淋巴细胞迅速增殖而成为针对该抗原的T细胞克隆，发挥其识别杀伤癌细胞的作用.
, 百拇医药
作者简介：*国家自然科学基金39770698和广东省五个一工程粤卫科[20号]资助.
通讯作者 肖兰风
4 参考文献
[1] 吴易元. 肿瘤免疫. 张友会主编. 现代肿瘤学. 第1版. 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社(北京)，1993：203
[2] 黄树林，肖兰风，罗利琼. McAb协同或共刺激外周血淋巴细胞表型分析. 中国免疫学杂志，1997；13(增刊)：16-18
[3] 吴直江，高奇蓉，龚忠萍. 淋巴因子激活的LAK/TIL细胞及其亚型. 中国肿瘤生物治疗杂志，1997；4：192
[4] 黄树林，肖兰风，罗利琼. McAb共激活T细胞介导肝癌细胞前后的膜分子与TCR Vβ基因的表达. 中国免疫学杂志，1998；14：334-337
收稿日期 1998-11-19, 百拇医药
单位：广东药学院分子生物学研究室 广东省广州市 510224
关键词：肝肿瘤/治疗；癌，肝细胞/治疗；CD4细胞；CD3细胞；CD8细胞；免疫治疗
世界华人消化杂志990430
Subject headings liver neoplasms/therapy; carcinoma, hepatocellular/therapy; CD4 cells; CD3 cells; CD8 cells; immunotherapy
中国图书资料分类号 R735.7
肿瘤免疫反应是涉及各种免疫细胞和细胞因子(CK)以及它们之间相互作用的复杂过程，这个过程大致可以分为相互联系、交错进行的两个阶段，即诱导阶段和效应阶段. 诱导阶段包括对抗原的识别、免疫细胞的增殖和活化. 在免疫反应的诱导阶段，以辅助T细胞(Th)的活化为其中心环节. Th活化在细胞免疫和体液免疫中都是不可缺少的，而在效应阶段，CTL，M，NK以及某些CK都对靶分子攻击[1]. 在杀伤肿瘤细胞过程中，CD28与B7分子相互作用对T细胞的共激活是非常重要的，而且与膜表面分子表达相对应. 因此我们报告共刺激激活T细胞，并加强APC的递呈抗原的能力，用流式细胞术(FACS)分析T细胞CD3的转化，CD4偏移，CD8变化，为促进肝癌的治疗寻找依据.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 单克隆抗体(mAb)来源 CD28，T细胞亚群，干粉；CD80，B细胞亚群，干粉；CD3，成熟T细胞；CD4+，辅助/诱导T细胞；CD8+，抑制/细胞毒性T细胞(均购自Immunotech公司).
1.2 FACS检测PBL表型 健康人11例外周血(PBL)，每例1mL，肝细胞癌(HCC)患者11例血，每例1mL，加等体积Hanks液稀释，Ficoll密度梯度离心，收集淋巴细胞，Hanks液洗涤3次，计数，调整细胞数为1×109/L，加入20μL mAb(CD3，CD4+,CD8+)，设对照1管(鼠IgG-FITC 20μL再加入5×105淋巴细胞100μL，4℃孵育30min后加PBS 1mL，1800r/min离心5min，去上清，再加入1mL PBS)，上机(EPICS.Rcoulter公司).
, 百拇医药
1.3 淋巴细胞的分离培养 正常人外周血100mL(广州血液中心)，加等体积Hanks液稀释，Ficoll密度梯度离心，收集淋巴细胞，Hanks液洗涤3次，计数，以1×109/L 悬浮于RPMI1640液中(含100mL/L小牛血清)，(IL-2 200kU/L，CD3 mAb 70μg/L，CD28 mAb 1pg/cell，CD80 mAb 1pg/cell)，37℃， 50mL/L CO2孵箱中培养6d～10d，细胞数达1×108[2].
2 结果
健康志愿者PBL(未培养)CD4与CD8的表达没有明显差异. 肝癌患者免疫治疗前CD4偏移(No. 1，3，5，6，8，9，10，11)，mAb共激活PBL输入患者1wk后再次取血，FACS检测PBL(未经培养)，发现CD3转化降低，CD4偏移消失(11例中有3例CD4仍偏移，No.2,5,9)，8例患者CD8增高(No.1，2，3，4，7，8，10，11).
, http://www.100md.com
3 讨论
不同来源的PBL，其T细胞膜表面分子有着不同的表型特征，这与免疫细胞的功能状态密切相关，也关系到肿瘤的治疗效果[3]. 抗原与TCR结合是免疫应答的开始(第一信号)，当APC表达B7分子作用T细胞表面的CD28作为第二刺激信号时，T细胞才激活、分裂、增殖[4]. 为了促进T细胞的杀伤作用和粘附分子分泌，以及NK细胞的杀伤功能，我们将共刺激(CD28+80)后的健康人PBL输入肝癌患者，结果发现，在输入前，肝癌患者PBL有CD4偏移现象，而输入后CD4偏移消失，且CD8增多，CD3降低. 此现象在健康人组中未见到. 这提示总T细胞向CTL转化，CD4偏移消失有利于诱导阶段转向效应阶段，发挥抗肿瘤作用. 这也可能是肝癌患者T细胞某些功能被抑制，不能充分表达其膜表面分子，当共激活PBL输入体内，在癌抗原的参与下，T细胞的TCR接受APC相应抗原的刺激，具有该TCR的淋巴细胞迅速增殖而成为针对该抗原的T细胞克隆，发挥其识别杀伤癌细胞的作用.
, 百拇医药
作者简介：*国家自然科学基金39770698和广东省五个一工程粤卫科[20号]资助.
通讯作者 肖兰风
4 参考文献
[1] 吴易元. 肿瘤免疫. 张友会主编. 现代肿瘤学. 第1版. 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社(北京)，1993：203
[2] 黄树林，肖兰风，罗利琼. McAb协同或共刺激外周血淋巴细胞表型分析. 中国免疫学杂志，1997；13(增刊)：16-18
[3] 吴直江，高奇蓉，龚忠萍. 淋巴因子激活的LAK/TIL细胞及其亚型. 中国肿瘤生物治疗杂志，1997；4：192
[4] 黄树林，肖兰风，罗利琼. McAb共激活T细胞介导肝癌细胞前后的膜分子与TCR Vβ基因的表达. 中国免疫学杂志，1998；14：334-337
收稿日期 1998-11-19, 百拇医药