不需酚抽提的DNA提取方法的建立*
作者：林金容 刘晓霞 姜 泊 张亚历 林 鸿 周殿元
单位：林金容 广州军区广州总医院肿瘤科 广州市 510010； 刘晓霞 姜 泊 张亚历 林 鸿 周殿元 南方医院全军消化病研究所 广州市 510515
关键词：DNA/分析；聚合酶链反应；方法
世界华人消化杂志990429
Subject headings DNA/analysis; polymerase chain reaction; methods
中国图书资料分类号 R362
1 材料和方法
1.1 材料 石蜡包埋组织(大肠癌组织)为近年来本院普外科手术切除标本，应用10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋. PCR扩增仪购自美国Elmerkin 公司，Taq酶购自Promega公司，蛋白酶K购自德国Merck公司.
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 ①参照Frank方法改进：具体操作简述如下：取5μm石蜡切片组织，常规脱蜡，取其中一张切片做常规苏木素-伊红(HE)染色，观察肿瘤细胞所在部位，然后取另外切片挑取目的细胞刮入0.5mL Eppendorf管，加入0.1mL pH 8.0 50mmol/L Tris-HCl及200mg/L蛋白酶K，37℃反应过夜，然后煮沸10min，灭活蛋白酶K，10000r/min，离心15min，弃沉淀，上清直接做PCR. ②按上述方法取5μm石蜡切片组织，常规酚-氯仿法提取DNA，最后沉淀物溶于DDH2O中.
1.2.2 PCR扩增 参照常规方法. 引物为家族性腺瘤性息肉病基因(Fimilial adenomatous polyposis coli, APC). 总反应体积为25μL，其中含4μL DNA提取液，上、下游引物各12.5pmol，200μmol/L×dNTP，1×扩增缓冲液、1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，DNA Taq酶0.75U. 覆盖石蜡油后97℃变性8min，进入下列循环35次，扩增条件为94℃,40s,56℃,30s,72℃,40s，最后72℃再延伸7min.
2 结果
采用①②提取的DNA经过PCR扩增，银染聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，均可看到133bp棕色带，表明2种方法均可以得到较好的结果.
3 讨论
本文参照Frank方法略加改进从石蜡包埋组织中提取DNA，并用于PCR的扩增，获得了较满意的结果. 与常规酚-氯仿抽提方法提取DNA相比，具有下列优点：①方法简单方便，只需一步法提取DNA，不需要酚-氯仿抽提及乙醇沉淀. ②提高了效果. 由于本方法不需要经过酚-氯仿抽提，避免了常规方法提取过程中DNA的损失，儿乎所有目的DNA均被用于PCR扩增，提高了PCR扩增效果. ③提高了特异性. 由于先行HE染色，选取目的细胞用于DNA提取，排除了细胞间质及红细胞等因素及非目的DNA的干扰，所以提高了特异性. 另外由于红细胞对PCR扩增有一定的抑制作用，所以亦提高了效果. ④消化液中不含有SDS及钠离子，二者均对PCR有一定的影响，所以亦提高了PCR扩增的效果. ⑤对于含极少量目的DNA的提取具有更重大意义. 如法医鉴定、脱落细胞及活检组织等.
作者简介:*本课题为全军大肠癌九五攻关课题资助项目 NO.96Z028
通讯作者 林金容
收稿日期 1998-11-19, http://www.100md.com
单位：林金容 广州军区广州总医院肿瘤科 广州市 510010； 刘晓霞 姜 泊 张亚历 林 鸿 周殿元 南方医院全军消化病研究所 广州市 510515
关键词：DNA/分析；聚合酶链反应；方法
世界华人消化杂志990429
Subject headings DNA/analysis; polymerase chain reaction; methods
中国图书资料分类号 R362
1 材料和方法
1.1 材料 石蜡包埋组织(大肠癌组织)为近年来本院普外科手术切除标本，应用10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋. PCR扩增仪购自美国Elmerkin 公司，Taq酶购自Promega公司，蛋白酶K购自德国Merck公司.
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 ①参照Frank方法改进：具体操作简述如下：取5μm石蜡切片组织，常规脱蜡，取其中一张切片做常规苏木素-伊红(HE)染色，观察肿瘤细胞所在部位，然后取另外切片挑取目的细胞刮入0.5mL Eppendorf管，加入0.1mL pH 8.0 50mmol/L Tris-HCl及200mg/L蛋白酶K，37℃反应过夜，然后煮沸10min，灭活蛋白酶K，10000r/min，离心15min，弃沉淀，上清直接做PCR. ②按上述方法取5μm石蜡切片组织，常规酚-氯仿法提取DNA，最后沉淀物溶于DDH2O中.
1.2.2 PCR扩增 参照常规方法. 引物为家族性腺瘤性息肉病基因(Fimilial adenomatous polyposis coli, APC). 总反应体积为25μL，其中含4μL DNA提取液，上、下游引物各12.5pmol，200μmol/L×dNTP，1×扩增缓冲液、1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，DNA Taq酶0.75U. 覆盖石蜡油后97℃变性8min，进入下列循环35次，扩增条件为94℃,40s,56℃,30s,72℃,40s，最后72℃再延伸7min.
2 结果
采用①②提取的DNA经过PCR扩增，银染聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，均可看到133bp棕色带，表明2种方法均可以得到较好的结果.
3 讨论
本文参照Frank方法略加改进从石蜡包埋组织中提取DNA，并用于PCR的扩增，获得了较满意的结果. 与常规酚-氯仿抽提方法提取DNA相比，具有下列优点：①方法简单方便，只需一步法提取DNA，不需要酚-氯仿抽提及乙醇沉淀. ②提高了效果. 由于本方法不需要经过酚-氯仿抽提，避免了常规方法提取过程中DNA的损失，儿乎所有目的DNA均被用于PCR扩增，提高了PCR扩增效果. ③提高了特异性. 由于先行HE染色，选取目的细胞用于DNA提取，排除了细胞间质及红细胞等因素及非目的DNA的干扰，所以提高了特异性. 另外由于红细胞对PCR扩增有一定的抑制作用，所以亦提高了效果. ④消化液中不含有SDS及钠离子，二者均对PCR有一定的影响，所以亦提高了PCR扩增的效果. ⑤对于含极少量目的DNA的提取具有更重大意义. 如法医鉴定、脱落细胞及活检组织等.
作者简介:*本课题为全军大肠癌九五攻关课题资助项目 NO.96Z028
通讯作者 林金容
收稿日期 1998-11-19, http://www.100md.com