肝细胞癌凋亡、p21和PCNA表达与临床预后关系的研究
作者：孔宪炳 梁力建 黄洁夫
单位：孔宪炳 梁力建 中山医科大学第七期CMB访问学者，现在重庆医科大学附属第一医院外科(重庆，400016)；黄洁夫 课题负责人，中山医科大学附属第一医院肝胆外科(广州，510080)
关键词：肝肿瘤；细胞凋亡；p21蛋白；增殖细胞核抗原；预后
癌症990421
【摘要】目的：研究HCC细胞凋亡、p21和PCNA表达与临床预后的关系。方法：55例HCC标本采用DNA末端标记(Tunel)和免疫组化检测并结合计算机图像技术定量分析。结果：小肝癌(<5cm)AI高于大肝癌(P<0.01)，肝内转移、浸润性及低分化HCC的AI分别低于无转移(P<0.01)、非浸润性及高分化HCC(P<0.05)。而PCNA-LI恰好相反。癌旁组织p21阳性率及p21表达值(PU)均高于癌组织(P<0.01)。并且癌及癌旁组织p21表达值在浸润性及肝内转移HCC分别高于非浸润性及无转移HCC(P<0.01)。AI与PCNA-LI呈高度负相关(r=0.7289，P<0.01)。术后生存1年以上者其AI大于生存1年以内者(P<0.01)，而PCNA-LI和p21表达值却小于生存1年以内者(P<0.05)。结论：AI、PCNA-LI和p21表达水平与HCC的分化、浸润、转移和预后密切相关，可能成为HCC预后判断的潜在指标。
, http://www.100md.com
中图分类号：R735.7 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0426-04
A study of correlation between apoptosis,expression of p21 protein and PCNA,and the clinical prognosis in hepatocellular carcinoma
KONG Xian-bing1, LIANG Li-jian2, HUANG Jie-fu2
1 Department of Surgery,the First Affiliated Hospital,Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016, P.R.China
, 百拇医药
2 Division of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080, P.R.China
【Abstract】 Objective：To investigate the prognostic significance of apoptosis,expression of p21 protein and PCNA in hepatocellular carcinoma(HCC).Methods：We examined apoptosis,expression of PCNA and p21 in 55 HCCs by the in situ end-labeling and immunohistochemical methods in combination with computer-imaging analytic technique.Results：Apoptosis index(AI)was significantly higher in small HCCs (<5 cm)than large HCCs (P<0.01),and HCCs with intrahepatic metastasis,infiltration and poorly differentiation had a significantly lower AI than those without intrahepatic metastasis (P<0.01),no infiltration and well differentiation (P<0.05).However,PCNA- LI was found in negative relation to AI on the above state (P<0.01).The positive percentage and the expression level of p21 were significantly higher in tumor- surrounding tissues than that in tumor tissues (P<0.01),and HCCs with infiltration and intrahepatic metastasis had a significantly higher p21 expression level than those without infiltration and intrahepatic metastasis(P<0.01).Moreover, AI was highly inversely related to PCNA-LI (r=-0.7289，P<0.001)，and significantly higher in patients with long postoperative survival (over one year)than those with short survival (P<0.01).Conclusions： AI,PCNA-LI and p21 expression level in HCC were closely associated with the differentiation,infiltration,metastasis and prognosis of the tumor,and thus probably became potential markers in predicting prognosis of HCC.
, 百拇医药
Key words：Liver neoplasms;Apoptosis;p21protein;Proliferating cell nuclear antigen;Prognosis
近来关于肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)细胞凋亡(Apoptosis)的研究逐渐增多[1]。但多为体外肝癌细胞系或大鼠实验中的形态学、免疫组化观察，尚未发现人HCC凋亡与p21表达同临床预后相关研究的报道。本实验利用DNA末端标记(Tunel)和免疫组化检测HCC凋亡、p21蛋白和增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA),并结合计算机图像技术定量分析，与HCC临床预后各指标进行对比研究，以探讨其临床意义。
1 材料与方法
1.1 标本
, 百拇医药
近年手术切除的肝癌标本55例，男46例，女9例，年龄25～74岁，中位年龄49.7岁，均经病理证实为HCC。其中53例HBsAg阳性，49例伴肝硬化，45例带有完整癌旁组织。全部55例肝癌标本行Tunel法测定apoptosis,53例测定PCNA，47例测定p21。所有患者术前均未化疗或放疗。另取11例正常肝组织对照。
1.2 临床病理学指标
包括肿瘤大小，分化程度，浸润性(包膜受侵、门静脉癌栓、癌周卫星结节)，肝内转移，AFP，术后生存时间等。获得随访的HCC41例术后生存时间以1年为界，生存期超过1年为A组，25例，小于1年为B组，16例。
1.3 DNA末端标记法(Tunel)
采用改良的TdT介导的dUTP-biotin切口末端标记原位检测法[2]。标记液及抗体购自德国BoehringerMannhein公司。
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1.4 免疫组化染色
p21和PCNA用免疫组化SABC法。小鼠抗人N-rasp21单抗，PCNA单抗，羊抗小鼠IgG和SABC试剂盒购自武汉博士德生物公司(进口分装)。
1.5 定量分析
采用德国Kontron公司的IBAS真彩图像分析仪对p21，Apoptosis和PCNA染色切片进行定量测定。凋亡阳性细胞为胞核呈紫蓝色，主要表现为核浓缩或核质呈均匀的染色。p21染色阳性为细胞浆呈棕黄色。PCNA染色阳性为细胞核呈棕黄色颗粒状。参照申氏方法计算p21的阳性单位(PositiveUnit,PU)[3]，PU反映测试区域p21染色的灰度级和面积密度，代表p21的相对含量。每张切片，用图像分析仪随机测试1000个癌细胞，以凋亡细胞和PCNA阳性细胞的百分率代表凋亡指数(Apoptosis index, AI)和增殖指数(PCNA-Labeling index, PCNA-LI)。
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1.6 统计学分析
数据用
±s表达，两组均数差别显著性用Student-t检验或t检验。两样本率比较用χ2检验。AI、p21表达值和PCNA-LI之间行直线相关分析。
2 结果
凋亡阳性染色位于细胞核，呈紫蓝色。主要表现为核浓缩或核质呈均匀的染色，染色质边聚，无白细胞浸润(图1)。肝癌组织凋亡细胞阳性率高于癌旁组织(P<0.01，表1)。PCNA阳性染色仅限于细胞核内，呈黄色颗粒，肝癌组织PCNA阳性率及PCNA-LI均高于癌旁组织(P<0.01，表1，2)。p21阳性着色主要位于细胞浆，棕黄色，呈片状或团巢状，其中以近邻癌组织的肝细胞着色最明显(图2)。癌旁组织p21阳性率及p21表达值(PU)均高于癌组织(P<0.01，表1，2)。AI、PCNA-LI及p21表达值与临床病理指标的关系见表3。
, 百拇医药
表1 肝癌和癌旁组织Apoptosis、PCNA、p21阳性率(%)比较
Apoptosis
PCNA
p21
癌组织
81.82(45/55)**
83.02(44/53)**
34.04(16/47)
癌旁组织
42.22(19/45)
28.57(12/42)
, http://www.100md.com
79.49(31/39)**
癌组织与癌旁组织比较**P<0.01表2 肝癌和癌旁组织AI、PCNA-LI、p21表达值(PU)比较(±S)
n
AI
n
PCNA-LI
n
PU
癌组织
55
, http://www.100md.com
3.99±3.18▲
53
49.96±23.62**
47
1.30±0.95
癌旁组织
45
3.62±2.93
42
14.05±10.68
39
5.29±1.94**
, 百拇医药
癌组织与癌旁组织比较**P<0.01 ▲P>0.05表3 肝癌AI、PCNA-LI及p21表达值(PU)与临床理学指标的关系(±s) 项目
n
AI
n
PCNA-LI
n
癌p21(PU)
n
癌旁p21(PU)
肿瘤直径
, 百拇医药
≤5cm
10
6.41±3.78**
13
3999±24.96
13
1.42±1.01▲
11
4.75±1.99
>5cm
45
3.45±2.81
, 百拇医药
40
53.20±22.54▲
34
1.26±0.86
28
5.49±1.92▲
肿瘤浸润
有
19
2.60±2.38
22
63.60±16.60**
, http://www.100md.com
21
1.71±1.27**
18
6.16±1.53**
无
36
4.72±3.23*
31
40.28±23.24
26
0.97±0.34
21
, 百拇医药
4.52±1.97
肝内转移
有
16
2.11±1.98
15
59.80±19.01▲
15
1.98±1.38**
13
6.34±1.73**
无
, 百拇医药
39
4.76±3.28**
38
46.62±24.34
32
0.98±0.39
26
4.75±1.85
甲胎蛋白
AFP(+)
30
4.41±3.16▲
, 百拇医药
28
54.62±21.58▲
27
1.12±0.57
19
4.85±2.15
AFP(-)
25
3.49±3.20
25
44.74±24.99
20
, 百拇医药
1.56±1.01▲
20
5.69±1.94▲
分级
Ⅰ～Ⅱ
20
5.29±3.70*
20
32.57±21.15
20
1.31±0.86▲
, http://www.100md.com 15
4.58±1.57
Ⅲ～Ⅳ
35
3.25±2.63
33
60.50±18.37**
27
1.30±0.89
24
5.71±2.01▲
各项目内比较**P<0.01 *P<0.05 ▲P>0.05
, http://www.100md.com
图1 肝癌显示较强的凋亡标记染色(AI11.4)。Tunel法×100
图2 肝癌旁组织p21染色阳性(PU值3.13)，癌组织p21染色阴性。SABC法×100
AI与PCNA-LI呈高度负相关(r=-0.7289，P<0.001)。癌和癌旁组织p21表达值与AI亦呈负相关(r=-0.4178，P<0.005和r=-0.4753，P<0.005)。
AI、PCNA-LI和p21表达值与生存时间的关系见表4。B组AI低于A组(P<0.01)，而B组PCNA-LI和p21表达值(包括癌和癌旁组织)均高于A组(P<0.05)。
表4 肝癌AI、PCN-LI和p21表达值与生存时间的关系(±S)
, 百拇医药
n
AI
PCNA-LI
肝癌p21
癌旁p21
A组(>1年)
25
4.99±3.15**
43.70±22.85
1.05±0.54
4.58±1.46
B组(≤1年)
, 百拇医药
16
2.48±1.89
60.80±17.29*
1.69±1.02*
5.97±2.05*
A组与B组比较**P<0.01 *P<0.05
3 讨论
恶性肿瘤不仅表现细胞增殖和分化异常，同时也存在细胞凋亡的异常。过去对肿瘤的研究多集中在组织增殖方面，而对细胞死亡未予足够的重视。我们发现多数肝癌和癌旁组织表现不同程度的细胞凋亡，小肝癌(5cm以下)AI高于大肝癌。低分化HCCAI小于高分化HCC，但低分化HCCPCNA-LI却大于高分化HCC。提示HCC在去分化过程中随着肿瘤的不断增殖和生长，细胞凋亡相对减少。肿瘤细胞的生长优势不但可以从肿瘤细胞强大的增殖力和低分化程度中获得，而且可以从肿瘤细胞凋亡受抑，生存期延长中获得[4]。本研究显示，HCC中AI与PCNA-LI呈显著负相关，并且浸润性和转移性HCC有较高的PCNA-LI和较低的AI，表明HCC增殖旺盛而凋亡相对不足，具有明显的生长优势，生物学行为较恶性。
, 百拇医药
肝癌侵犯门静脉与肝内转移是其重要特征，表明肝癌侵袭能力强，预后差。本实验发现，浸润性与肝内转移HCC凋亡指数低于非浸润性与无转移HCC。提示浸润性或肝内转移HCC可能逃避了调控基因介导的细胞凋亡，说明细胞凋亡率下降与肝癌的侵袭转移有关。
理论上认为，调亡发生率高，则肿瘤生长慢，预后较好。我们发现术后生存时间长的HCC，其凋亡指数高于生存时间短的HCC，而增殖指数低于生存时间短的HCC。显示凋亡指数和增殖指数与HCC术后生存时间密切相关。
ras基因编码的p21蛋白具有调节GTP酶的特性，参与细胞跨膜信号传递和各种细胞过程如细胞增殖、分化和凋亡的调节[5]。本实验表明，肝癌和癌旁组织p21表达水平与凋亡指数呈负相关，提示p21的过量表达能降低细胞凋亡的发生，这可能与p21抑制了凋亡关联酶——内核酸酶的活性有关[6]。因此，通过药物或基因治疗阻抑ras基因的激活以启动肿瘤细胞的凋亡通道，抑制肿瘤生长，将会为HCC的防治开辟出一条新的途径。
, 百拇医药
我们发现，肝癌p21表达多位于肿瘤边缘，并且癌及癌旁组织p21的表达水平在浸润性转移性HCC高于非浸润性无转移性HCC，说明p21的过表达与HCC的浸润、转移有着密切的联系。癌旁组织p21表达值明显高于癌组织，说明p21蛋白的过度表达可能发生于肝细胞癌变之前，因此肝癌手术时，切除足够的癌旁组织对减少或避免术后肝内转移与复发具有重要意义。同时，我们还发现p21表达水平高的HCC其术后生存时间短于表达水平低的HCC，表明p21的过表达与HCC的进展和预后也密切相关。因此，p21可能成为HCC肝内转移和预后判断的潜在指标。
本研究得到中山医科大学病理教研室林汉良教授、朱全胜副教授、吴惠茜主管技师的支持与帮助，谨此致谢。
基金项目：本课题受美国中华医学基金会(CMB)资助，编号90543
参考文献
1 Hino N,Higashi T,Nouso K,et al.Apoptosis and proliferation of human hepatocellular carcinoma [J] .Liver,1996,16(2):123～129.
, http://www.100md.com
2 Gavrieli Y,Sherman Y, Ben-Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation [J] .J Cell Biol,1992,119(4):493～501.
3 申洪.免疫组织化学染色定量方法研究(Ⅲ)[J].中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4(1)：89～91.
4 Arends MJ,McGregor AH,Toft NJ,et al.Susceptibility to apoptosis is differentially regulated by c-myc and mutated Ha-ras oncogenes and is associated with endonuclease availability [J] .Br J Cancer,1993,68(6):1127～1133.
, 百拇医药
5 Cheng AL,Chuang SE,Fine RL,et al.Inhibition of the menbrane translocation and activation of protein kinase C,and potentiation of doxorubicin-induced apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by tamoxifen [J] .Biochem Pharmacol,1998,55(4):523～531.
6 Moore J,Boswell S,Hoffman R,et al.Mutation H-ras over-expression inhibits a random apoptotic nuclease in myeloid leukemia cells [J] .Leuk Res,1993,17(8):703～709.
收稿日期：1998-09-09；修回日期：1998-11-24, 百拇医药
单位：孔宪炳 梁力建 中山医科大学第七期CMB访问学者，现在重庆医科大学附属第一医院外科(重庆，400016)；黄洁夫 课题负责人，中山医科大学附属第一医院肝胆外科(广州，510080)
关键词：肝肿瘤；细胞凋亡；p21蛋白；增殖细胞核抗原；预后
癌症990421
【摘要】目的：研究HCC细胞凋亡、p21和PCNA表达与临床预后的关系。方法：55例HCC标本采用DNA末端标记(Tunel)和免疫组化检测并结合计算机图像技术定量分析。结果：小肝癌(<5cm)AI高于大肝癌(P<0.01)，肝内转移、浸润性及低分化HCC的AI分别低于无转移(P<0.01)、非浸润性及高分化HCC(P<0.05)。而PCNA-LI恰好相反。癌旁组织p21阳性率及p21表达值(PU)均高于癌组织(P<0.01)。并且癌及癌旁组织p21表达值在浸润性及肝内转移HCC分别高于非浸润性及无转移HCC(P<0.01)。AI与PCNA-LI呈高度负相关(r=0.7289，P<0.01)。术后生存1年以上者其AI大于生存1年以内者(P<0.01)，而PCNA-LI和p21表达值却小于生存1年以内者(P<0.05)。结论：AI、PCNA-LI和p21表达水平与HCC的分化、浸润、转移和预后密切相关，可能成为HCC预后判断的潜在指标。
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中图分类号：R735.7 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0426-04
A study of correlation between apoptosis,expression of p21 protein and PCNA,and the clinical prognosis in hepatocellular carcinoma
KONG Xian-bing1, LIANG Li-jian2, HUANG Jie-fu2
1 Department of Surgery,the First Affiliated Hospital,Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016, P.R.China
, 百拇医药
2 Division of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080, P.R.China
【Abstract】 Objective：To investigate the prognostic significance of apoptosis,expression of p21 protein and PCNA in hepatocellular carcinoma(HCC).Methods：We examined apoptosis,expression of PCNA and p21 in 55 HCCs by the in situ end-labeling and immunohistochemical methods in combination with computer-imaging analytic technique.Results：Apoptosis index(AI)was significantly higher in small HCCs (<5 cm)than large HCCs (P<0.01),and HCCs with intrahepatic metastasis,infiltration and poorly differentiation had a significantly lower AI than those without intrahepatic metastasis (P<0.01),no infiltration and well differentiation (P<0.05).However,PCNA- LI was found in negative relation to AI on the above state (P<0.01).The positive percentage and the expression level of p21 were significantly higher in tumor- surrounding tissues than that in tumor tissues (P<0.01),and HCCs with infiltration and intrahepatic metastasis had a significantly higher p21 expression level than those without infiltration and intrahepatic metastasis(P<0.01).Moreover, AI was highly inversely related to PCNA-LI (r=-0.7289，P<0.001)，and significantly higher in patients with long postoperative survival (over one year)than those with short survival (P<0.01).Conclusions： AI,PCNA-LI and p21 expression level in HCC were closely associated with the differentiation,infiltration,metastasis and prognosis of the tumor,and thus probably became potential markers in predicting prognosis of HCC.
, 百拇医药
Key words：Liver neoplasms;Apoptosis;p21protein;Proliferating cell nuclear antigen;Prognosis
近来关于肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)细胞凋亡(Apoptosis)的研究逐渐增多[1]。但多为体外肝癌细胞系或大鼠实验中的形态学、免疫组化观察，尚未发现人HCC凋亡与p21表达同临床预后相关研究的报道。本实验利用DNA末端标记(Tunel)和免疫组化检测HCC凋亡、p21蛋白和增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA),并结合计算机图像技术定量分析，与HCC临床预后各指标进行对比研究，以探讨其临床意义。
1 材料与方法
1.1 标本
, 百拇医药
近年手术切除的肝癌标本55例，男46例，女9例，年龄25～74岁，中位年龄49.7岁，均经病理证实为HCC。其中53例HBsAg阳性，49例伴肝硬化，45例带有完整癌旁组织。全部55例肝癌标本行Tunel法测定apoptosis,53例测定PCNA，47例测定p21。所有患者术前均未化疗或放疗。另取11例正常肝组织对照。
1.2 临床病理学指标
包括肿瘤大小，分化程度，浸润性(包膜受侵、门静脉癌栓、癌周卫星结节)，肝内转移，AFP，术后生存时间等。获得随访的HCC41例术后生存时间以1年为界，生存期超过1年为A组，25例，小于1年为B组，16例。
1.3 DNA末端标记法(Tunel)
采用改良的TdT介导的dUTP-biotin切口末端标记原位检测法[2]。标记液及抗体购自德国BoehringerMannhein公司。
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1.4 免疫组化染色
p21和PCNA用免疫组化SABC法。小鼠抗人N-rasp21单抗，PCNA单抗，羊抗小鼠IgG和SABC试剂盒购自武汉博士德生物公司(进口分装)。
1.5 定量分析
采用德国Kontron公司的IBAS真彩图像分析仪对p21，Apoptosis和PCNA染色切片进行定量测定。凋亡阳性细胞为胞核呈紫蓝色，主要表现为核浓缩或核质呈均匀的染色。p21染色阳性为细胞浆呈棕黄色。PCNA染色阳性为细胞核呈棕黄色颗粒状。参照申氏方法计算p21的阳性单位(PositiveUnit,PU)[3]，PU反映测试区域p21染色的灰度级和面积密度，代表p21的相对含量。每张切片，用图像分析仪随机测试1000个癌细胞，以凋亡细胞和PCNA阳性细胞的百分率代表凋亡指数(Apoptosis index, AI)和增殖指数(PCNA-Labeling index, PCNA-LI)。
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1.6 统计学分析
数据用
±s表达，两组均数差别显著性用Student-t检验或t检验。两样本率比较用χ2检验。AI、p21表达值和PCNA-LI之间行直线相关分析。2 结果
凋亡阳性染色位于细胞核，呈紫蓝色。主要表现为核浓缩或核质呈均匀的染色，染色质边聚，无白细胞浸润(图1)。肝癌组织凋亡细胞阳性率高于癌旁组织(P<0.01，表1)。PCNA阳性染色仅限于细胞核内，呈黄色颗粒，肝癌组织PCNA阳性率及PCNA-LI均高于癌旁组织(P<0.01，表1，2)。p21阳性着色主要位于细胞浆，棕黄色，呈片状或团巢状，其中以近邻癌组织的肝细胞着色最明显(图2)。癌旁组织p21阳性率及p21表达值(PU)均高于癌组织(P<0.01，表1，2)。AI、PCNA-LI及p21表达值与临床病理指标的关系见表3。
, 百拇医药
表1 肝癌和癌旁组织Apoptosis、PCNA、p21阳性率(%)比较
Apoptosis
PCNA
p21
癌组织
81.82(45/55)**
83.02(44/53)**
34.04(16/47)
癌旁组织
42.22(19/45)
28.57(12/42)
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79.49(31/39)**
癌组织与癌旁组织比较**P<0.01表2 肝癌和癌旁组织AI、PCNA-LI、p21表达值(PU)比较(
±S)n
AI
n
PCNA-LI
n
PU
癌组织
55
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3.99±3.18▲
53
49.96±23.62**
47
1.30±0.95
癌旁组织
45
3.62±2.93
42
14.05±10.68
39
5.29±1.94**
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癌组织与癌旁组织比较**P<0.01 ▲P>0.05表3 肝癌AI、PCNA-LI及p21表达值(PU)与临床理学指标的关系(
±s) 项目n
AI
n
PCNA-LI
n
癌p21(PU)
n
癌旁p21(PU)
肿瘤直径
, 百拇医药
≤5cm
10
6.41±3.78**
13
3999±24.96
13
1.42±1.01▲
11
4.75±1.99
>5cm
45
3.45±2.81
, 百拇医药
40
53.20±22.54▲
34
1.26±0.86
28
5.49±1.92▲
肿瘤浸润
有
19
2.60±2.38
22
63.60±16.60**
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21
1.71±1.27**
18
6.16±1.53**
无
36
4.72±3.23*
31
40.28±23.24
26
0.97±0.34
21
, 百拇医药
4.52±1.97
肝内转移
有
16
2.11±1.98
15
59.80±19.01▲
15
1.98±1.38**
13
6.34±1.73**
无
, 百拇医药
39
4.76±3.28**
38
46.62±24.34
32
0.98±0.39
26
4.75±1.85
甲胎蛋白
AFP(+)
30
4.41±3.16▲
, 百拇医药
28
54.62±21.58▲
27
1.12±0.57
19
4.85±2.15
AFP(-)
25
3.49±3.20
25
44.74±24.99
20
, 百拇医药
1.56±1.01▲
20
5.69±1.94▲
分级
Ⅰ～Ⅱ
20
5.29±3.70*
20
32.57±21.15
20
1.31±0.86▲
, http://www.100md.com 15
4.58±1.57
Ⅲ～Ⅳ
35
3.25±2.63
33
60.50±18.37**
27
1.30±0.89
24
5.71±2.01▲
各项目内比较**P<0.01 *P<0.05 ▲P>0.05
, http://www.100md.com
图1 肝癌显示较强的凋亡标记染色(AI11.4)。Tunel法×100
图2 肝癌旁组织p21染色阳性(PU值3.13)，癌组织p21染色阴性。SABC法×100
AI与PCNA-LI呈高度负相关(r=-0.7289，P<0.001)。癌和癌旁组织p21表达值与AI亦呈负相关(r=-0.4178，P<0.005和r=-0.4753，P<0.005)。
AI、PCNA-LI和p21表达值与生存时间的关系见表4。B组AI低于A组(P<0.01)，而B组PCNA-LI和p21表达值(包括癌和癌旁组织)均高于A组(P<0.05)。
表4 肝癌AI、PCN-LI和p21表达值与生存时间的关系(
±S), 百拇医药
n
AI
PCNA-LI
肝癌p21
癌旁p21
A组(>1年)
25
4.99±3.15**
43.70±22.85
1.05±0.54
4.58±1.46
B组(≤1年)
, 百拇医药
16
2.48±1.89
60.80±17.29*
1.69±1.02*
5.97±2.05*
A组与B组比较**P<0.01 *P<0.05
3 讨论
恶性肿瘤不仅表现细胞增殖和分化异常，同时也存在细胞凋亡的异常。过去对肿瘤的研究多集中在组织增殖方面，而对细胞死亡未予足够的重视。我们发现多数肝癌和癌旁组织表现不同程度的细胞凋亡，小肝癌(5cm以下)AI高于大肝癌。低分化HCCAI小于高分化HCC，但低分化HCCPCNA-LI却大于高分化HCC。提示HCC在去分化过程中随着肿瘤的不断增殖和生长，细胞凋亡相对减少。肿瘤细胞的生长优势不但可以从肿瘤细胞强大的增殖力和低分化程度中获得，而且可以从肿瘤细胞凋亡受抑，生存期延长中获得[4]。本研究显示，HCC中AI与PCNA-LI呈显著负相关，并且浸润性和转移性HCC有较高的PCNA-LI和较低的AI，表明HCC增殖旺盛而凋亡相对不足，具有明显的生长优势，生物学行为较恶性。
, 百拇医药
肝癌侵犯门静脉与肝内转移是其重要特征，表明肝癌侵袭能力强，预后差。本实验发现，浸润性与肝内转移HCC凋亡指数低于非浸润性与无转移HCC。提示浸润性或肝内转移HCC可能逃避了调控基因介导的细胞凋亡，说明细胞凋亡率下降与肝癌的侵袭转移有关。
理论上认为，调亡发生率高，则肿瘤生长慢，预后较好。我们发现术后生存时间长的HCC，其凋亡指数高于生存时间短的HCC，而增殖指数低于生存时间短的HCC。显示凋亡指数和增殖指数与HCC术后生存时间密切相关。
ras基因编码的p21蛋白具有调节GTP酶的特性，参与细胞跨膜信号传递和各种细胞过程如细胞增殖、分化和凋亡的调节[5]。本实验表明，肝癌和癌旁组织p21表达水平与凋亡指数呈负相关，提示p21的过量表达能降低细胞凋亡的发生，这可能与p21抑制了凋亡关联酶——内核酸酶的活性有关[6]。因此，通过药物或基因治疗阻抑ras基因的激活以启动肿瘤细胞的凋亡通道，抑制肿瘤生长，将会为HCC的防治开辟出一条新的途径。
, 百拇医药
我们发现，肝癌p21表达多位于肿瘤边缘，并且癌及癌旁组织p21的表达水平在浸润性转移性HCC高于非浸润性无转移性HCC，说明p21的过表达与HCC的浸润、转移有着密切的联系。癌旁组织p21表达值明显高于癌组织，说明p21蛋白的过度表达可能发生于肝细胞癌变之前，因此肝癌手术时，切除足够的癌旁组织对减少或避免术后肝内转移与复发具有重要意义。同时，我们还发现p21表达水平高的HCC其术后生存时间短于表达水平低的HCC，表明p21的过表达与HCC的进展和预后也密切相关。因此，p21可能成为HCC肝内转移和预后判断的潜在指标。
本研究得到中山医科大学病理教研室林汉良教授、朱全胜副教授、吴惠茜主管技师的支持与帮助，谨此致谢。
基金项目：本课题受美国中华医学基金会(CMB)资助，编号90543
参考文献
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, 百拇医药
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收稿日期：1998-09-09；修回日期：1998-11-24, 百拇医药