酮对老年小鼠抗氧化酶活性的影响
作者：何泉华 许实波
单位：何泉华(广州蛇毒研究所，广州 510182)；许实波(中山大学药学系，广州 510275)
关键词：酮；抗氧化；抗氧化物酶
广州医学院学报990402 提要 目的：探讨从穿心草中提取的三种黄酮类化合物
酮(Xanthone,Xan) 对老年小鼠体内抗氧化酶活性的影响。方法：连续20天腹腔注射0.2μmol/L和0.02μmol/L的三种Xan，测定体内超氧化物歧化酶、谷胱甘过氧化物酶和过氧化氢酶的活性。结果：三种Xan均能不同程度地增加老年小鼠体内多种抗氧化酶的含量，作用强度依次为Xan-Ⅰ>Xan-Ⅲ>Xan-Ⅱ。结论：三种Xan对老年小鼠体内抗氧化酶的活性有不同程度的影响，提示Xan对机体的保护作用与其清除氧自由基、提高抗氧化酶的活性有关。
, 百拇医药
中图分类号 R285.5
Effects of Xanthones on Antioxidation Enzyme Activities in old mice
He Quanhua
(Guangzhou Research Institute of Snake Venom,Guangzhou 510182)
Xu Shibo
(Department of Pharmacy,Zhongshan University,Guangzhou 510275)
Objective:To explore the effects of three xanthones (flavone compounds,extracted from green chiretta) on the activities of antioxidation enzymes in old mice. Method: After being administrated i.p.with each of three xanthones individually at concentrations of 0.2μmol/L and 0.02μmol/L,respectively for 20 days,superoxide dismutase, glutathione peroxidase and hydroperoxidase in the mice of each group were measured for their activities. Results:Three xanthones all increased the activities of several antioxidation enzymes in the old mice to different extents,the order of effects was 1, 8-dihydroxy-3, 5-dimethoxyxanthone>1-hydroxy-3, 7,8-trimethoxy-xanthone>1-hydoxy-3, 5-dimethoxyxanthone. Conclusion: Three kinds of xanthones have influence to different extents on the activities of antioxidation enzymes in old mice,which indicates that the protective effect of xanthones on injury may be related to their activities in scavenging oxygenic radicals and in increasing antioxidation enzyme activities.
, 百拇医药
Key words Xanthone;Antioxidation;Enzyme
穿心草含有多种活性成分，其主要成分-黄酮类化合物，具有明显的抗氧化、清除氧自由基和抗心肌缺血再灌注心律失常的保护作用[1]。衰老的自由基学说认为，自由基可与体内的核酸、蛋白质、氨基酸及脂质等发生反应，使膜通透性增高、蛋白质变性、细胞中的酶失活、核酸和染色体被破坏，最终导致细胞衰老和死亡[2～3]。Xan属于黄酮类的其中一种，体外实验表明，Xan具有明显清除多种自由基的作用[4]。经试验发现，Xan具有抗衰老作用，那么它的抗衰老作用是否通过清除老年动物体内的自由基、提高抗氧化酶的活性来实现呢?本文作了探讨。
1 实验材料酮(Xanthone，结构如图1)：1，8-dihydroxy-3,5-dimethoxyxanthone(Xan-Ⅰ)；1-hydroxy-3,5-dimethoxy- xanthone(Xan-Ⅱ);1-hydroxy-3,7,8-trithoxyxanthone(Xan-Ⅲ),呈黄色针状晶体，纯度为99.6%，由中山大学化学化工学院天然有机室提供。
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图1酮的结构
Ⅰ：1，8-dihydroxy-3,5-dimethoxyxanthone(Xan-Ⅰ)
Ⅱ：1-hydroxy-3,5-dimethoxyxanthone(Xan-Ⅱ)
Ⅲ：1-hydroxy-3,5,8-trithoxyanathone(Xan-Ⅲ)
使用时以含0.1%的二甲亚砜和0.1%的吐温80双蒸水悬液。SOD试剂盒，南京建成生物工程研究所。还原型谷胱甘肽(GSH)，Serva 公司。5，5-三硫代对硝基苯甲酸(DTNB)， Sigma公司。
NIH小鼠，由广东省医用实验动物中心提供。
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2 实验方法
选取20月龄的老年NIH小鼠80只，雌雄各半，随机分成8组，每组雌雄各5只。实验设溶媒对照组、3种Xan分别为0.2μmol/L组、0.02μmol/L组和维生素E组(阳性对照)。每天早、晚给各组动物腹腔注射受试样品2次，连续20天。
2.1 对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响 提取红细胞及心肌中的SOD后，按SOD试剂盒说明书的操作方法取20μl的样品测试。在550nm处比色(1cm光径比色杯)，蒸馏水调零。
2.2 对谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响
制备血样稀释液及组织上清液后，GSH-PX活性测定采用DTNB直接比色法[5～6]。加样步骤：取全血稀释液(或组织上清液)0.4ml，加1.0mmol/L GSH(用NaN3缓冲液配制)0.4ml，37℃水浴5min，加37℃预温的1.25mmol/L H2O2 0.2ml，37℃水浴中准确计时3min，加偏磷酸沉淀液(内含1.67% Na2HPO4、0.05% EDTA和28% NaCl)4.0ml终止反应，800×g离心10min，取上清液2.0ml，加0.32mol/L Na2HPO4 2.5ml，加0.04% DTNB(内含1%柠檬酸三钠)，反应1min后于分光光度计上测波长422nm处的吸光度A 422nm(光径1cm)。非酶管以0.4ml蒸馏水代替H2O2，其余操作同样品管；调零空白管加样步骤为0.4ml蒸馏水+1.6ml偏磷酸沉淀液+2.5ml 0.32mol/L Na2HPO4+0.5ml 0.04% DTNB。各管A 422nm相当于GSH的量可由GSH标准曲线求得。
, 百拇医药
2.3 对过氧化氢酶(CAT)活性的影响 血样稀释液及组织上清液的制备，连续给受试样品20d后，每鼠眼眶取血10ml，加入到1.0ml蒸馏水中，制成全血溶血液。CAT活性测定采用紫外分光光度法[7]。取0.1mol/L H2O2 0.4ml加入到2.6ml 0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，加全血溶血液10ml，摇匀，立即于分光光度计上测波长230nm处的吸光度A 230nm(光径1cm)，以0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)调零。测试条件：温度25℃，测试时间400s，间隔8s测1次。将记录结果作统计学处理。
3 实验结果
3.1 对SOD活性的影响 表1所示，给小鼠腹腔注射20天3种受试样品后，可明显减少小鼠血浆及心肌组织中SOD的含量的消耗，其中Xan-Ⅰ的作用最强，Xan-Ⅱ最弱。
, http://www.100md.com 表1 Xan对老年动物体内SOD含量的影响(
±s,n=8) 组 别
给药剂量
μmol/L
血浆SOD
心肌SOD
NU/ml
增加率%
NU/ml
增加率%
对 照
186.68±23.31
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139.76±6.50
Vit E
0.02
242.65±12.67***
30.11
168.52±8.48***
20.86
Xan-Ⅰ
0.2
248.28±32.20**
33.33
, http://www.100md.com
192.10±5.04***
37.21
0.02
228.26±7.97**
22.58
167.64±5.82***
19.29
Xan-Ⅱ
0.2
215.46±11.24*
15.59
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160.52±7.95**
15.11
0.02
196.39±15.53
5.38
143.76±4.66*
2.88
Xan-Ⅲ
0.2
230.46±11.24***
23.66
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186.24±5.61***
32.85
0.02
214.82±12.68*
15.05
165.23±4.50***
17.86
与对照组比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
3.2 对GSH-Px活性的影响 表2所示，给小鼠腹腔注射20天受试样品后，可明显减少小鼠血浆及心肌组织中GSH-Px含量的消耗(P<0.01或P<0.001)。
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表2 Xan对老年动物体内GSH-Px活性的影响(±s,n=8) 组别
给药剂量
μmol/L
血浆GSH-Px含量
U/L
增加率%
心肌GSH-Px含量
U/g wet wt
增加率%
对照
19.21±0.31
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16.31±0.37
Vit E
0.02
24.59±0.33***
28.01
21.45±0.28***
31.51
Xan-Ⅰ
0.2
27.23±0.15***
41.75
, 百拇医药
23.56±0.38***
44.45
0.02
25.22±0.30***
31.15
21.57±0.55***
32.25
Xan-Ⅱ
0.2
22.52±0.38***
17.23
, 百拇医药
19.09±0.33***
17.04
0.02
21.45±0.28***
12.56
17.61±0.47**
7.97
Xan-Ⅲ
0.2
26.36±0.31***
37.22
, 百拇医药
22.36±0.29***
37.09
0.02
24.51±0.44***
27.59
20.45±0.46***
25.38
与对照组比：**P<0.01，***P<0.001
3.3 对CAT活性的影响 图1所示，以时间为横座标，A230nm 为纵座标，绘浓度均为0.02μmol/L组的CAT分解H2O2的速率曲线。
, 百拇医药
图1 三种Xan对老年动物体内过氧化氢酶含量的影响
对照组(n=8) Xan-Ⅰ：(P<0.01，n=8)；Xan-Ⅱ(P>0.05，n=8)；
Vit E:0.02 μmol/L(P<0.01，n=8)；Xan-Ⅲ(P<0.01,n=8)
从图中所示，给药组的曲线均在对照组的下面，说明给样品组明显阻止了过氧化氢酶活性的降低，使分解H2O2的能力大为提高，导致H2O2的浓度大为下降；药物的作用强习顺序为：Xan-Ⅰ>Vit E>Xan-Ⅲ>Xan-Ⅱ。
4 讨论
正常情况下，机体靠抗氧化酶(如SOD、GSH-Px、CAT)等的作用使代谢过程中活性氧自由基的产生与消除处于平衡状态。随着年龄的增长，由于抗氧化酶活性不断下降，体内产生的过量氧自由基无法得至到及时清除，致使生物膜中的不饱和脂肪酸被氧化，从而使细胞膜的通透性发生改变，线粒体、微粒体膜膨胀破裂，造成细胞代谢和功能形态的改变，引起细胞的衰老和死亡。衰老的自由基学说认为，自由基导致脂质氧化，引起细胞破裂和进行性病变是衰老的主要原因[3]。
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前期的工作表明：Xan可减少动物脏器组织(脑、肝、心)匀浆的脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量，能清除.O-2和.OH，对心肌缺血再灌注损伤及异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤均有明显的保护作用。本研究发现，三种Xan均不同程度地提高老年小鼠血液及心肌组织中的SOD、GSH-Px及CAT的含量，作用强弱顺序为Xan-Ⅰ>Xan-Ⅲ>Xan-Ⅱ，与前期的报道一致。从而提示，Xan延缓衰老的作用机制可能与其清除体内自由基、提高抗氧化酶的活性、抑制脂质过氧化反应、维持细胞膜功能的完整有关。
参考文献：
[1]Havxteen B,Flavonoids. A calss of natreal products of high pharmacological potency. Biochem Pharmacol，1983;32:1141～1148
, 百拇医药
[2]De Grey AD.A proposed refinement of the mitochondrial free radical theory of aging.Bioassays,1997;19(2):161～166
[3]陈勤主编.抗衰老研究实验方法.中国医药科技出版社，1996:434～436
[4]何泉华，许实波.穿心草酮抗氧化作用初探.中国药理学通报，1998；14(2)：130～134
[5]荣征星，刘慧中，鲍景奇等.小鼠全血中谷胱甘肽过氧化物酶活力的微量测定法.生物化学与生物物理进展，1994；21(4)：362～367
[6]柯雪红，方永奇.改良法测定人血GSH-Px的研究.中国老年学杂志，1997；17(4)：205～208
[7]汪永孝，郑云敏，谭月华.四氢巴马汀抗缺血再灌注心律失常的作用及其机理.中国药理学通报，1993；9(5)：358～362
(收稿：1999-10-28), 百拇医药
单位：何泉华(广州蛇毒研究所，广州 510182)；许实波(中山大学药学系，广州 510275)
关键词：酮；抗氧化；抗氧化物酶
广州医学院学报990402 提要 目的：探讨从穿心草中提取的三种黄酮类化合物
酮(Xanthone,Xan) 对老年小鼠体内抗氧化酶活性的影响。方法：连续20天腹腔注射0.2μmol/L和0.02μmol/L的三种Xan，测定体内超氧化物歧化酶、谷胱甘过氧化物酶和过氧化氢酶的活性。结果：三种Xan均能不同程度地增加老年小鼠体内多种抗氧化酶的含量，作用强度依次为Xan-Ⅰ>Xan-Ⅲ>Xan-Ⅱ。结论：三种Xan对老年小鼠体内抗氧化酶的活性有不同程度的影响，提示Xan对机体的保护作用与其清除氧自由基、提高抗氧化酶的活性有关。, 百拇医药
中图分类号 R285.5
Effects of Xanthones on Antioxidation Enzyme Activities in old mice
He Quanhua
(Guangzhou Research Institute of Snake Venom,Guangzhou 510182)
Xu Shibo
(Department of Pharmacy,Zhongshan University,Guangzhou 510275)
Objective:To explore the effects of three xanthones (flavone compounds,extracted from green chiretta) on the activities of antioxidation enzymes in old mice. Method: After being administrated i.p.with each of three xanthones individually at concentrations of 0.2μmol/L and 0.02μmol/L,respectively for 20 days,superoxide dismutase, glutathione peroxidase and hydroperoxidase in the mice of each group were measured for their activities. Results:Three xanthones all increased the activities of several antioxidation enzymes in the old mice to different extents,the order of effects was 1, 8-dihydroxy-3, 5-dimethoxyxanthone>1-hydroxy-3, 7,8-trimethoxy-xanthone>1-hydoxy-3, 5-dimethoxyxanthone. Conclusion: Three kinds of xanthones have influence to different extents on the activities of antioxidation enzymes in old mice,which indicates that the protective effect of xanthones on injury may be related to their activities in scavenging oxygenic radicals and in increasing antioxidation enzyme activities.
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Key words Xanthone;Antioxidation;Enzyme
穿心草含有多种活性成分，其主要成分-黄酮类化合物，具有明显的抗氧化、清除氧自由基和抗心肌缺血再灌注心律失常的保护作用[1]。衰老的自由基学说认为，自由基可与体内的核酸、蛋白质、氨基酸及脂质等发生反应，使膜通透性增高、蛋白质变性、细胞中的酶失活、核酸和染色体被破坏，最终导致细胞衰老和死亡[2～3]。Xan属于黄酮类的其中一种，体外实验表明，Xan具有明显清除多种自由基的作用[4]。经试验发现，Xan具有抗衰老作用，那么它的抗衰老作用是否通过清除老年动物体内的自由基、提高抗氧化酶的活性来实现呢?本文作了探讨。
1 实验材料
酮(Xanthone，结构如图1)：1，8-dihydroxy-3,5-dimethoxyxanthone(Xan-Ⅰ)；1-hydroxy-3,5-dimethoxy- xanthone(Xan-Ⅱ);1-hydroxy-3,7,8-trithoxyxanthone(Xan-Ⅲ),呈黄色针状晶体，纯度为99.6%，由中山大学化学化工学院天然有机室提供。, http://www.100md.com
图1
酮的结构Ⅰ：1，8-dihydroxy-3,5-dimethoxyxanthone(Xan-Ⅰ)
Ⅱ：1-hydroxy-3,5-dimethoxyxanthone(Xan-Ⅱ)
Ⅲ：1-hydroxy-3,5,8-trithoxyanathone(Xan-Ⅲ)
使用时以含0.1%的二甲亚砜和0.1%的吐温80双蒸水悬液。SOD试剂盒，南京建成生物工程研究所。还原型谷胱甘肽(GSH)，Serva 公司。5，5-三硫代对硝基苯甲酸(DTNB)， Sigma公司。
NIH小鼠，由广东省医用实验动物中心提供。
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2 实验方法
选取20月龄的老年NIH小鼠80只，雌雄各半，随机分成8组，每组雌雄各5只。实验设溶媒对照组、3种Xan分别为0.2μmol/L组、0.02μmol/L组和维生素E组(阳性对照)。每天早、晚给各组动物腹腔注射受试样品2次，连续20天。
2.1 对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响 提取红细胞及心肌中的SOD后，按SOD试剂盒说明书的操作方法取20μl的样品测试。在550nm处比色(1cm光径比色杯)，蒸馏水调零。
2.2 对谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响
制备血样稀释液及组织上清液后，GSH-PX活性测定采用DTNB直接比色法[5～6]。加样步骤：取全血稀释液(或组织上清液)0.4ml，加1.0mmol/L GSH(用NaN3缓冲液配制)0.4ml，37℃水浴5min，加37℃预温的1.25mmol/L H2O2 0.2ml，37℃水浴中准确计时3min，加偏磷酸沉淀液(内含1.67% Na2HPO4、0.05% EDTA和28% NaCl)4.0ml终止反应，800×g离心10min，取上清液2.0ml，加0.32mol/L Na2HPO4 2.5ml，加0.04% DTNB(内含1%柠檬酸三钠)，反应1min后于分光光度计上测波长422nm处的吸光度A 422nm(光径1cm)。非酶管以0.4ml蒸馏水代替H2O2，其余操作同样品管；调零空白管加样步骤为0.4ml蒸馏水+1.6ml偏磷酸沉淀液+2.5ml 0.32mol/L Na2HPO4+0.5ml 0.04% DTNB。各管A 422nm相当于GSH的量可由GSH标准曲线求得。
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2.3 对过氧化氢酶(CAT)活性的影响 血样稀释液及组织上清液的制备，连续给受试样品20d后，每鼠眼眶取血10ml，加入到1.0ml蒸馏水中，制成全血溶血液。CAT活性测定采用紫外分光光度法[7]。取0.1mol/L H2O2 0.4ml加入到2.6ml 0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，加全血溶血液10ml，摇匀，立即于分光光度计上测波长230nm处的吸光度A 230nm(光径1cm)，以0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)调零。测试条件：温度25℃，测试时间400s，间隔8s测1次。将记录结果作统计学处理。
3 实验结果
3.1 对SOD活性的影响 表1所示，给小鼠腹腔注射20天3种受试样品后，可明显减少小鼠血浆及心肌组织中SOD的含量的消耗，其中Xan-Ⅰ的作用最强，Xan-Ⅱ最弱。
, http://www.100md.com 表1 Xan对老年动物体内SOD含量的影响(
±s,n=8) 组 别给药剂量
μmol/L
血浆SOD
心肌SOD
NU/ml
增加率%
NU/ml
增加率%
对 照
186.68±23.31
, http://www.100md.com
139.76±6.50
Vit E
0.02
242.65±12.67***
30.11
168.52±8.48***
20.86
Xan-Ⅰ
0.2
248.28±32.20**
33.33
, http://www.100md.com
192.10±5.04***
37.21
0.02
228.26±7.97**
22.58
167.64±5.82***
19.29
Xan-Ⅱ
0.2
215.46±11.24*
15.59
, 百拇医药
160.52±7.95**
15.11
0.02
196.39±15.53
5.38
143.76±4.66*
2.88
Xan-Ⅲ
0.2
230.46±11.24***
23.66
, http://www.100md.com
186.24±5.61***
32.85
0.02
214.82±12.68*
15.05
165.23±4.50***
17.86
与对照组比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
3.2 对GSH-Px活性的影响 表2所示，给小鼠腹腔注射20天受试样品后，可明显减少小鼠血浆及心肌组织中GSH-Px含量的消耗(P<0.01或P<0.001)。
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表2 Xan对老年动物体内GSH-Px活性的影响(
±s,n=8) 组别给药剂量
μmol/L
血浆GSH-Px含量
U/L
增加率%
心肌GSH-Px含量
U/g wet wt
增加率%
对照
19.21±0.31
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16.31±0.37
Vit E
0.02
24.59±0.33***
28.01
21.45±0.28***
31.51
Xan-Ⅰ
0.2
27.23±0.15***
41.75
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23.56±0.38***
44.45
0.02
25.22±0.30***
31.15
21.57±0.55***
32.25
Xan-Ⅱ
0.2
22.52±0.38***
17.23
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19.09±0.33***
17.04
0.02
21.45±0.28***
12.56
17.61±0.47**
7.97
Xan-Ⅲ
0.2
26.36±0.31***
37.22
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22.36±0.29***
37.09
0.02
24.51±0.44***
27.59
20.45±0.46***
25.38
与对照组比：**P<0.01，***P<0.001
3.3 对CAT活性的影响 图1所示，以时间为横座标，A230nm 为纵座标，绘浓度均为0.02μmol/L组的CAT分解H2O2的速率曲线。
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图1 三种Xan对老年动物体内过氧化氢酶含量的影响
对照组(n=8) Xan-Ⅰ：(P<0.01，n=8)；Xan-Ⅱ(P>0.05，n=8)；
Vit E:0.02 μmol/L(P<0.01，n=8)；Xan-Ⅲ(P<0.01,n=8)
从图中所示，给药组的曲线均在对照组的下面，说明给样品组明显阻止了过氧化氢酶活性的降低，使分解H2O2的能力大为提高，导致H2O2的浓度大为下降；药物的作用强习顺序为：Xan-Ⅰ>Vit E>Xan-Ⅲ>Xan-Ⅱ。
4 讨论
正常情况下，机体靠抗氧化酶(如SOD、GSH-Px、CAT)等的作用使代谢过程中活性氧自由基的产生与消除处于平衡状态。随着年龄的增长，由于抗氧化酶活性不断下降，体内产生的过量氧自由基无法得至到及时清除，致使生物膜中的不饱和脂肪酸被氧化，从而使细胞膜的通透性发生改变，线粒体、微粒体膜膨胀破裂，造成细胞代谢和功能形态的改变，引起细胞的衰老和死亡。衰老的自由基学说认为，自由基导致脂质氧化，引起细胞破裂和进行性病变是衰老的主要原因[3]。
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前期的工作表明：Xan可减少动物脏器组织(脑、肝、心)匀浆的脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量，能清除.O-2和.OH，对心肌缺血再灌注损伤及异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤均有明显的保护作用。本研究发现，三种Xan均不同程度地提高老年小鼠血液及心肌组织中的SOD、GSH-Px及CAT的含量，作用强弱顺序为Xan-Ⅰ>Xan-Ⅲ>Xan-Ⅱ，与前期的报道一致。从而提示，Xan延缓衰老的作用机制可能与其清除体内自由基、提高抗氧化酶的活性、抑制脂质过氧化反应、维持细胞膜功能的完整有关。
参考文献：
[1]Havxteen B,Flavonoids. A calss of natreal products of high pharmacological potency. Biochem Pharmacol，1983;32:1141～1148
, 百拇医药
[2]De Grey AD.A proposed refinement of the mitochondrial free radical theory of aging.Bioassays,1997;19(2):161～166
[3]陈勤主编.抗衰老研究实验方法.中国医药科技出版社，1996:434～436
[4]何泉华，许实波.穿心草
酮抗氧化作用初探.中国药理学通报，1998；14(2)：130～134[5]荣征星，刘慧中，鲍景奇等.小鼠全血中谷胱甘肽过氧化物酶活力的微量测定法.生物化学与生物物理进展，1994；21(4)：362～367
[6]柯雪红，方永奇.改良法测定人血GSH-Px的研究.中国老年学杂志，1997；17(4)：205～208
[7]汪永孝，郑云敏，谭月华.四氢巴马汀抗缺血再灌注心律失常的作用及其机理.中国药理学通报，1993；9(5)：358～362
(收稿：1999-10-28), 百拇医药