急性白血病c-myc反义核酸基因治疗的实验研究
作者：博士研究生 刘庭波 专 业 内科学(血液病) 导 师 吕联煌教授
单位：现在福建医科大学附属协和医院
关键词：c-myc基因；急性白血病；反义技术；硫代磷酸寡脱氧核苷酸
福建医科大学学报990438
c-myc基因是调控细胞增殖与分化的癌基因，在急性白血病细胞株及急性白血病、恶性淋巴瘤患者细胞中出现高表达，是影响这些恶性肿瘤发生、发展的重要基因之一。反义核酸治疗恶性肿瘤在技术上具有高效、简便、不需载体等特点，原理是根据碱基互补，将具有特异序列的反义寡核苷酸导入肿瘤细胞与靶基因上的相应部位结合,抑制和阻断相应基因的转录表达。 目的 应用针对c-myc基因的两个反义核酸15mer和18mer作用于急性白血病细胞株和原代细胞，研究反义核酸对白血病细胞的生长、增殖，c-myc mRNA表达以及P65 c-myc蛋白表达率的改变，以及对细胞凋亡、分化方面的影响。 方法 采用锥虫蓝染色法测定细胞的拒染率，绘制细胞的生长曲线，用0.8%甲基纤维素半固体培养法进行克隆形成试验；用流式细胞仪检测在反义核酸作用前后的P65 c-myc蛋白及凋亡率；用RT-PCR法检测c-myc mRNA的表达相对水平；电镜观察凋亡细胞的超微结构；DNA电泳分析凋亡片段;光镜下瑞特染色、NBT染色观察细胞分化水平，流式细胞仪检测分化抗原表达，同时RT-PCR检测分化细胞的mRNA表达；MTT法检测反义核酸与化疗药物对细胞联合作用后对细胞生长的抑制率。 结果 (l)两个反义核酸对白血病细胞株HL-60和白血病原代细胞的生长有抑制作用，对正常非肿瘤性血液病的造血细胞的生长无明显抑制作用。对白血病细胞克隆有明显的抑制作用，急性白血病原代细胞经Aspo作用后CFU-GM生长无抑制，反而有所增加。(2)在Aspo对HL-60细胞作用后P65 c-myc蛋白的表达率明显下降，对急性白血病原代细胞作用后，ALL2合并淋巴瘤患者P65 c-myc蛋白不降低，而急性非淋巴细胞白血病M3b、M5b患者P65 c-myc蛋白均明显下降，其中1例作用72 h后c-myc表达高于作用48 h。(3)Aspo可引起HL-60细胞及白血病原代细胞的凋亡，用流式细胞仪、电镜、DNA片段分析均检测出细胞凋亡。但对正常骨髓细胞不引起凋亡。(4)Aspo低浓度可引起HL-60细胞的分化和c-myc mRNA水平的降低。HL-60细胞分化后出现细胞向成熟期转变。NBT阳性率升高，流式细胞仪检测CD15、CD34明显升高。HLA-DR降低，提示细胞分化成熟水平提高。(5)MTT法检测Aspo联合化疗药物如VP16 DNR等对HL-60细胞生长抑制有协同作用。Aspo加VP16对白血病原代细胞的生长抑制也有协同作用。 结论 c-myc反义核酸是具有高特异性、低毒性的抗肿瘤药物，其作用有浓度和时间依赖性的特点，并具有效应的短暂性，能对急性白血病细胞的生长、分化、凋亡各方面产生影响，联合使用效果更佳，并且与目前化疗药物有协同效应，具有广阔的治疗应用前景。
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脂质体介导c-myc反义核酸对HL-60细胞作用的研究
硕士研究生 陈 琳
专 业 内科学(血液病)
导 师 卓光生副教授,陈志哲、张学敏教授
原癌基因c-myc参与调控细胞的增殖、分化和凋亡过程，在白血病细胞株HL-60中有很高的表达。c-myc通过扩增活化或基因重排而异常激活，在白血病的发生和发展中可能起着重要的作用。 目的 通过脂质体介导c-myc反义核酸转染HL-60细胞，观察其抑制细胞生长增殖、促进分化、诱导凋亡，降低c-myc mRNA和蛋白表达水平，探讨反义核酸的抗肿瘤作用机制。 方法 HL-60细胞在37℃、5%CO2条件下，培养于10%小牛血清1640培养液中，细胞接种密度为4×107/L，反义核酸终浓度为1 μmol/L，反义核酸与脂质体比例为1 μmol(6.5 μg)∶10 μg，无血清转染6 h。实验同时设置空白组、无义组、反义组、脂质体组、脂质体无义组等对照组。连续培养4天。通过锥虫蓝拒染实验测定细胞的生长能力；NBT还原实验和瑞特-姬姆萨染色测定细胞的分化能力；免疫细胞化学染色检测c-myc蛋白表达；RT-PCR法检测c-myc mRNA水平；吖啶橙/溴化乙锭染色观察凋亡细胞形态；流式细胞仪检测凋亡率；DNA抽提及电泳观察凋亡细胞DNA降解片段的形成。 结果 脂质体转染c-myc反义核酸的作用:(1)抑制HL-60细胞的增殖，在转染后第4天最明显，经统计学处理，脂质体转染反义核酸组与其余对照组均有统计学上显著差别(P<0.05)。(2)促进细胞分化成熟。显微镜下形态学观察细胞胞浆增多，胞核缩小，核染色质浓缩，显示向成熟方向分化。NBT还原率从对照组29%上升至脂质体+反义组56.7%。(3)降低c-myc蛋白表达水平，免疫组化显示处理前c-myc蛋白阳性率为80%±3.02%，经脂质体转染c-myc反义核酸后，c-myc阳性率为41.67%±4.56%，两者有统计学显著差异(P<0.01)。(4)降低c-myc mRNA表达水平，RT-PCR产物电泳示经脂质体转染c-myc反义核酸后，c-myc PCR产物电泳带较对照组减弱。(5)诱导HL-60细胞凋亡。AO/EB荧光染色法见致密浓染黄绿色碎片，即凋亡小体。流式细胞仪检测到明显凋亡峰，凋亡率为17%。细胞提取DNA分析出现凋亡特征性片段化DNA形成即梯状DNA带，空白对照组无上述改变。 结论 c-myc反义核酸可抑制HL-60细胞的恶性表型，脂质体做为反义核酸载体可减少反义核酸用量，提高细胞摄取率。c-myc反义核酸在白血病基因治疗中具有一定的作用。
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关键词 c-myc原癌基因; 反义核酸; 脂质体; 白血病
(现在福建医科大学附属协和医院)
纤维蛋白原、极低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞
t-PA和PAI-1 mRNA含量的影响
硕士研究生 黄 春
专 业 内科学(心血管病)
导 师 蓝玉福教授，陈晓春副教授
目的 拟建立逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)半定量法，探讨纤维蛋白原(Fg)、极低密度脂蛋白(VLDL)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、I型纤溶酶原灭活剂(PAI-l)mRNA表达的影响。 方法 (l)用异硫氰酸胍一步法(TRIzol试剂)提取细胞总RNA，用单管RT-PCR法、三对引物分别逆转录、扩增t-PA，PAI-1及内参照三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的特异性片段，扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶图像分析仪照相、计算各条带分子量并扫描其光密度值(integrated density value，IDV)，t-PA、PAI-1 mRNA的IDV用GAPDH mRNA的IDV进行校正，其相对表达量用各实验组与对照组比较的倍数表示。(2)以ELISA法测定内皮细胞(EC)培养上清液(CM)中t-PA，PAI-1总抗原的含量。(3)EC与不同浓度Fg(2，20，200，2000 μg/ml)或VLDL(5，10，20，30，40 μg/ml)共同孵育12 h或24 h后，观察EC t-PA和PAI-1 mRNA水平及CM中抗原含量的变化。(4)EC与某一浓度Fg(200 μg/ml)或VLDL(20 μg/ml)共同孵育不同时间后，观察EC t-PA和PAI-1 mRNA水平及CM中抗原含量的变化。 结果 (1)三个特异性扩增片断的分子量分别为368 bp(t-PA)、401 bp(PAI-1)、195 bp(GAPDH)，与预期长度相吻合；RT-PCR扩增所得产物量与扩增初始模板量之间具有明显的量-效关系。(2)在一定浓度范围内(20～2000 μg/ml)，Fg诱导PAI-1 mRNA表达呈剂量依赖性增加；Fg(200 μg/ml)诱导PAI-1 mRNA表达增加呈时间依赖性，与同一时相的对照组比较，PAI-1 mRNA在Fg刺激l h内增加，12 h达最大效应，为3.6倍，至少持续24 h；CM中PAI-1抗原的增加具有类似的量-效和时-效关系。(3)在一定浓度范围内(5～40 μg/ml)，VLDL诱导PAI-1 mRNA表达呈剂量依赖性增加;VLDL(20 μg/ml)诱导PAI-1 mRNA表达的增加呈时间依赖性，8 h开始有效，48 h达最大效应，为同一时相对照组的2.8倍；CM中PAI-1抗原的增加具有类似的量-效和时-效关系。(4)t-PA mRNA表达及抗原含量不受Fg或VLDL刺激的影响。 结论 (1)本实验建立可靠的单管RT-PCR半定量法检测EC t-PA、PAI-1 mRNA含量。(2)Fg,VLDL均能诱导EC PAI-1 mRNA含量的增加及CM中PAI-1抗原的积聚，而不影响t-PA mRNA及抗原水平，最终导致EC表面的纤溶活性降低，有利于血栓形成和动脉粥样硬化的发生与发展。
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关键词 纤维蛋白原； 极低密度脂蛋白： 组织型纤溶酶原激活物； I型纤溶酶原灭活剂；逆转录-聚合酶链式反应
(现在福建医科大学附属协和医院)
胰岛素诱导心肌肥厚的作用及机制的体外研究
硕士研究生 林 岚
专 业 内科学(心血管病)
导 师 王一波教授，洪华山副教授
目的 在培养的心脏细胞模型上，探讨胰岛素诱导心肌肥厚的作用及其机制。 方法 建立乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细跑的培养方法，用光镜、电镜及免疫细胞化学染色进行鉴定。与空白对照比较，观察胰岛素干预后两种细胞肥大、增殖的量效关系：(1)测定细胞蛋白含量(考马斯亮蓝法)。(2)细胞计数；BrdU、WST-1 ELISA同步测定细胞DNA合成与代谢活性；流式细胞仪分析细胞周期。(3)检测胰岛素(10-7mol)干预后细胞纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)、转化生长因子(TGF βl)及早期反应基因蛋白c-fos、c-myc的表达(免疫细胞化学染色)。 结果 (1)培养的乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度分别在90%和95%以上；(2)一定浓度胰岛素使心肌细胞蛋白含量增高，且在10-10～10-7mol呈量效关系，但心肌细胞数量、BrdU掺入、WST-1代谢活性及S+G2+M期细胞百分比无明显变化(P>0.05)；(3)一定浓度胰岛素使心肌成纤维细胞数量、BrdU掺入、WST-1代谢活性及S+G-2+M期细胞百分比均明显升高；(10-7～10-6)mol胰岛素尚增加其细胞蛋白含量(P<0.01或0.05)；(4)胰岛素(10-7mol)作用后，两种细胞的FN、TGF β1和心肌细胞LN表达增强；作用2 h，两种细胞的c-fos、c-myc蛋白表达均增强，但24 h c-fos表达基本消失。 结论 在体外培养的心脏细胞模型上，胰岛素可通过如下途径诱导心肌肥厚的发生：(1)增加心肌细胞蛋白含量从而促进心肌细胞肥大；(2)促进心肌成纤维细胞增殖；(3)增加FN、LN的表达，而可能参与细胞外基质的改建。作用机制可能与其诱导TGF β1合成及早期反应基因蛋白c-fos、c-myc表达有关。
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关键词 胰岛素; 心肌肥厚; 细胞培养
(现在福建医科大学附属协和医院)
氟伐他汀对高血压大鼠血管结构和功能的影响及机制
硕士研究生 林志鸿
专 业 内科学(心血管病学)
导 师 吴可贵教授,谢良地副教授
目的 探讨内源性胆固醇合成途径的限速酶-HMG-CoA还原酶的抑制剂一氟伐他汀对高血压血管肥厚、血管功能和高血压进程的影响，并揭示其可能的作用机制。 方法 (1)雄性SHR(n=26)，从8周龄起予氟伐他汀(fluvastatin,Flu)20 mg.kg-1.d-1灌胃，分别治疗8周和16周，年龄、性别配对的未治疗的SHR(n=20)和WKY(n=18)作对照。分别测定收缩压(SBP),血脂(TC、TG和LDL-C)(CHOD-PAP和GPO-PAP法);进行血管组织形态学观察，测定血管壁(中膜)/腔面积(W/L)比；应用离体动脉环试验观察血管的功能变化。(2)以培养8周龄的SHR和WKY大鼠胸主动脉平滑肌细胞(ASMCs)为模型，观察(l)两种不同的有丝分裂原-血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和血小板源生长因子(PDGF)对ASMCs增殖(细胞计数)和DNA合成(3H-TdR掺入率)的影响。(2)Flu对20%FCS、AngⅡ和PDGF促ASMCs分裂增殖的抑制作用及(3)胆固醇合成代谢中间产物甲羟戊酸(mevalonic acid，Meva)对Flu抑制ASMCs增殖和DNA合成的逆转效果。 结果 (1)短期Flu治疗4周，即明显延缓SHR的血压进程(175.32±10.90 vs 192.63±4.23 mmHg，P<0.05)，随治疗时间的延长(16周)，Flu使SHR的血压调定在相对低下的水平(193.75±15.03 vs 212.57±l2.01 mmHg，P<0.05).Flu治疗8周后，明显降低SHR的血脂，尤其是TC水平;治疗16周，Flu治疗组的血脂水平虽仍低于对照组，但较治疗8周并无进一步下降。短期Flu治疗(8周)，明显减轻SHR肠系膜动脉阻力血管的肥厚(0.44±0.09 vs 0.79±0.09,P<0.05),治疗至16周时，无论是阻力动脉(肠系膜动脉分支第三级)还是弹性动脉(胸主动脉)，其血管壁的肥厚均得到不同程度的改善(肠系膜动脉0.44±0.02 vs 0.50±0.03，P<0.05；胸主动脉0.25±0.02 vs 0.32±0.02，P<0.05).离体动脉环试验表明，Flu治疗明显改善SHR胸主动脉和肠系膜动脉对硝普钠(SNP)舒张的敏感性，降低对去甲肾上腺素(NE)收缩的反应;而且随着治疗的持续，这种有益效应得到巩固并达到WKY水平，而此时血脂并无进一步下降。(2)在2%FCS培养基条件下，AngⅡ和PDGF均明显的呈浓度依赖性的促进SHR和WKY ASMCs增殖和DNA合成，且作用在SHR表现得更为显著；Flu干预，呈浓度依赖性的抑制20%FCS、AngⅡ(10-6mol/L)和PDGF(10 ng/ml)促ASMCs增殖的作用，且对两种细胞的抑制效应无明显区别。10 μmol/L的Flu使20%FCS诱导的SHR和WKY细胞数分别减少83%和81%，3H-TdR掺入率减少61%和72%；抑制AngⅡ(10-6mol/L)和PDGF(10 ng/ml)诱导两种细胞增殖的作用，细胞数分别减少73%和76%,75%h和75%,3H-TdR掺入率分别减少64%和69%,81%和85%.10-3mol/L的Meva基本上(70%～100%)逆转了Flu所诱导的ASMCs细胞数和3H-TdR掺入率的减少，且这种逆转作用在两个细胞系相似。 结论 Flu治疗延缓了SHR血压发展进程，减轻血管壁的肥厚程度；改善或纠正了SHR血管的异常舒缩功能。其有益作用与显著抑制ASMCs增殖的效应有关，也表明了Meva代谢途径可能参与ASMCs的增殖过程。
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关键词 氟伐他汀; 高血压; 血管肥厚; 血管平滑肌细胞; 甲羟戊酸
(现在福建医科大学附属第一医院)
普萘洛尔预处理对肥厚心肌再灌注损伤的保护作用
硕士研究生 郑理玲
专 业 外科学(胸心外科)
导 师 廖崇先教授,陈道中副教授
目的 肥厚心肌在心脏外科领域普遍存在，其对缺血再灌注损伤的敏感性较正常心肌明显增加，目前肥厚心肌保护尚不满意。本课题研究普萘洛尔预处理对大鼠肥厚心肌的保护作用并探讨其机制。 方法 实验选用健康8周龄雄性SD大鼠38只，2只用于正常心肌组织的超微结构观察，36只随机分为正常心肌(对照组)、肥厚心肌组(H组)、普萘洛尔组(P组)，每组12只。建立经典压力负荷性心肌肥厚模型。予H组、P组行腹主动脉缩窄术后饲养5周，对照组行假手术。围手术期P组日灌服普萘洛尔10 mg/kg,预处理共10天，对照组、H组灌服生理盐水。采用离体鼠心顺行灌注左心做功模型，观察各组心功能指标(AP，LVSP，LVEDP，AF，CF，CO,MVO2，CVR)；测定各组心肌代谢指标：心肌酶(LDH，CPK，CPK-MB)释放量、MDA含量；测定心肌含水量(MWC)；测定心脏重量指数：全心重量/体重、左心室重量/体重;取心肌组织观察超微结构并形态学定量测定线粒体损伤程度。 结果 (1)各组大鼠全部存活，切口无感染、渗血，服药期间无死亡。(2)H组、P组心脏重量指数明显高于对照组(P<0.01)，H组与P组无明显差异。(3)P组在再灌注15,30,60 min LVSP、AP、CF、AF、CO、MVO2均明显高于H组(P<0.05或P<0.01)；CVR、LVedp则明显低于H组(P<0.05或P<0.01)。(4)H组在再灌注15 min内心肌酶(LDH、CPK、CPK-MB)释放量明显高于P组(P<0.01)。(5)H组心肌组织MDA高于P组(P<0.01)。(6)各组心肌组织含水量无明显差异(P>0.05)。(7)心肌细胞线粒体形态学定量测定显示：P组心肌细胞线粒体损伤较H组明显减轻(P<0.01)；超微结构显示P组心肌细胞损伤比H组轻。 结论 (1)普萘洛尔预处理可明显改善肥厚心肌再灌注的血流动力学，减少再灌注时心肌酶释放，保护肥厚心肌。(2)普萘洛尔预处理以减轻心肌线粒体损伤，明显保护再灌注期间线粒体良好的呼吸功能，是减轻肥厚心肌再灌注损伤的一个重要机制。
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关键词 普萘洛尔; 预处理; 心肌肥厚; 再灌注损伤
(现在福建医科大学附属协和医院)
甲状腺乳头状癌端粒酶活性的表达
硕士研究生 黄雄飞
专 业 病理学
导 师 张鹏飞,杨代兴教授,程金妹副教授
目的 观察端粒酶在甲状腺良恶性组织中的表达情况，探讨端粒酶表达在甲状腺乳头状癌的潜在临床价值。 方法 采用TRAP酶标定量检测法和TRAP凝胶电泳定性分析法，对23例甲状腺乳头状癌组织,8例甲状腺滤泡性腺瘤，8例甲状腺肿和10例正常甲状腺组织进行端粒酶活性的检测。 结果 (1)甲状腺乳头状癌组，甲状腺滤泡性腺瘤组，甲状腺肿组和正常甲状腺组织组中端粒酶阳性检出率分别为86.7%，12.5%，12.5%，0%。甲状腺乳头状癌组较其他组差异有显著性(P<0.05)。(2)甲状腺乳头状癌中端粒酶活性检出率与病灶大小、年龄、淋巴结转移及组织学分级无关,病理分期晚期的检出率较早期的高(P<0.05)。(3)甲状腺乳头状癌组的端粒酶活性水平明显高于甲状腺良性病变组和甲状腺正常组织组(P<0.05)。(4)甲状腺乳头状癌端粒酶活性水平与组织学分级无关。病灶越大，年龄越大，病期越晚，端粒酶活性水平越高，伴淋巴结转移的高于无淋巴结转移者(P<0.05)。 结论 端粒酶是特异性较强的恶性肿瘤标记物，可作为甲状腺乳头状癌鉴别诊断和预后评估的良好的参考指标，深入研究端粒酶有助于发展新的肿瘤诊断方法。
关键词 甲状腺乳头状癌; 端粒酶活性; 检测
(现在福建医科大学), http://www.100md.com
单位：现在福建医科大学附属协和医院
关键词：c-myc基因；急性白血病；反义技术；硫代磷酸寡脱氧核苷酸
福建医科大学学报990438
c-myc基因是调控细胞增殖与分化的癌基因，在急性白血病细胞株及急性白血病、恶性淋巴瘤患者细胞中出现高表达，是影响这些恶性肿瘤发生、发展的重要基因之一。反义核酸治疗恶性肿瘤在技术上具有高效、简便、不需载体等特点，原理是根据碱基互补，将具有特异序列的反义寡核苷酸导入肿瘤细胞与靶基因上的相应部位结合,抑制和阻断相应基因的转录表达。 目的 应用针对c-myc基因的两个反义核酸15mer和18mer作用于急性白血病细胞株和原代细胞，研究反义核酸对白血病细胞的生长、增殖，c-myc mRNA表达以及P65 c-myc蛋白表达率的改变，以及对细胞凋亡、分化方面的影响。 方法 采用锥虫蓝染色法测定细胞的拒染率，绘制细胞的生长曲线，用0.8%甲基纤维素半固体培养法进行克隆形成试验；用流式细胞仪检测在反义核酸作用前后的P65 c-myc蛋白及凋亡率；用RT-PCR法检测c-myc mRNA的表达相对水平；电镜观察凋亡细胞的超微结构；DNA电泳分析凋亡片段;光镜下瑞特染色、NBT染色观察细胞分化水平，流式细胞仪检测分化抗原表达，同时RT-PCR检测分化细胞的mRNA表达；MTT法检测反义核酸与化疗药物对细胞联合作用后对细胞生长的抑制率。 结果 (l)两个反义核酸对白血病细胞株HL-60和白血病原代细胞的生长有抑制作用，对正常非肿瘤性血液病的造血细胞的生长无明显抑制作用。对白血病细胞克隆有明显的抑制作用，急性白血病原代细胞经Aspo作用后CFU-GM生长无抑制，反而有所增加。(2)在Aspo对HL-60细胞作用后P65 c-myc蛋白的表达率明显下降，对急性白血病原代细胞作用后，ALL2合并淋巴瘤患者P65 c-myc蛋白不降低，而急性非淋巴细胞白血病M3b、M5b患者P65 c-myc蛋白均明显下降，其中1例作用72 h后c-myc表达高于作用48 h。(3)Aspo可引起HL-60细胞及白血病原代细胞的凋亡，用流式细胞仪、电镜、DNA片段分析均检测出细胞凋亡。但对正常骨髓细胞不引起凋亡。(4)Aspo低浓度可引起HL-60细胞的分化和c-myc mRNA水平的降低。HL-60细胞分化后出现细胞向成熟期转变。NBT阳性率升高，流式细胞仪检测CD15、CD34明显升高。HLA-DR降低，提示细胞分化成熟水平提高。(5)MTT法检测Aspo联合化疗药物如VP16 DNR等对HL-60细胞生长抑制有协同作用。Aspo加VP16对白血病原代细胞的生长抑制也有协同作用。 结论 c-myc反义核酸是具有高特异性、低毒性的抗肿瘤药物，其作用有浓度和时间依赖性的特点，并具有效应的短暂性，能对急性白血病细胞的生长、分化、凋亡各方面产生影响，联合使用效果更佳，并且与目前化疗药物有协同效应，具有广阔的治疗应用前景。
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脂质体介导c-myc反义核酸对HL-60细胞作用的研究
硕士研究生 陈 琳
专 业 内科学(血液病)
导 师 卓光生副教授,陈志哲、张学敏教授
原癌基因c-myc参与调控细胞的增殖、分化和凋亡过程，在白血病细胞株HL-60中有很高的表达。c-myc通过扩增活化或基因重排而异常激活，在白血病的发生和发展中可能起着重要的作用。 目的 通过脂质体介导c-myc反义核酸转染HL-60细胞，观察其抑制细胞生长增殖、促进分化、诱导凋亡，降低c-myc mRNA和蛋白表达水平，探讨反义核酸的抗肿瘤作用机制。 方法 HL-60细胞在37℃、5%CO2条件下，培养于10%小牛血清1640培养液中，细胞接种密度为4×107/L，反义核酸终浓度为1 μmol/L，反义核酸与脂质体比例为1 μmol(6.5 μg)∶10 μg，无血清转染6 h。实验同时设置空白组、无义组、反义组、脂质体组、脂质体无义组等对照组。连续培养4天。通过锥虫蓝拒染实验测定细胞的生长能力；NBT还原实验和瑞特-姬姆萨染色测定细胞的分化能力；免疫细胞化学染色检测c-myc蛋白表达；RT-PCR法检测c-myc mRNA水平；吖啶橙/溴化乙锭染色观察凋亡细胞形态；流式细胞仪检测凋亡率；DNA抽提及电泳观察凋亡细胞DNA降解片段的形成。 结果 脂质体转染c-myc反义核酸的作用:(1)抑制HL-60细胞的增殖，在转染后第4天最明显，经统计学处理，脂质体转染反义核酸组与其余对照组均有统计学上显著差别(P<0.05)。(2)促进细胞分化成熟。显微镜下形态学观察细胞胞浆增多，胞核缩小，核染色质浓缩，显示向成熟方向分化。NBT还原率从对照组29%上升至脂质体+反义组56.7%。(3)降低c-myc蛋白表达水平，免疫组化显示处理前c-myc蛋白阳性率为80%±3.02%，经脂质体转染c-myc反义核酸后，c-myc阳性率为41.67%±4.56%，两者有统计学显著差异(P<0.01)。(4)降低c-myc mRNA表达水平，RT-PCR产物电泳示经脂质体转染c-myc反义核酸后，c-myc PCR产物电泳带较对照组减弱。(5)诱导HL-60细胞凋亡。AO/EB荧光染色法见致密浓染黄绿色碎片，即凋亡小体。流式细胞仪检测到明显凋亡峰，凋亡率为17%。细胞提取DNA分析出现凋亡特征性片段化DNA形成即梯状DNA带，空白对照组无上述改变。 结论 c-myc反义核酸可抑制HL-60细胞的恶性表型，脂质体做为反义核酸载体可减少反义核酸用量，提高细胞摄取率。c-myc反义核酸在白血病基因治疗中具有一定的作用。
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关键词 c-myc原癌基因; 反义核酸; 脂质体; 白血病
(现在福建医科大学附属协和医院)
纤维蛋白原、极低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞
t-PA和PAI-1 mRNA含量的影响
硕士研究生 黄 春
专 业 内科学(心血管病)
导 师 蓝玉福教授，陈晓春副教授
目的 拟建立逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)半定量法，探讨纤维蛋白原(Fg)、极低密度脂蛋白(VLDL)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、I型纤溶酶原灭活剂(PAI-l)mRNA表达的影响。 方法 (l)用异硫氰酸胍一步法(TRIzol试剂)提取细胞总RNA，用单管RT-PCR法、三对引物分别逆转录、扩增t-PA，PAI-1及内参照三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的特异性片段，扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶图像分析仪照相、计算各条带分子量并扫描其光密度值(integrated density value，IDV)，t-PA、PAI-1 mRNA的IDV用GAPDH mRNA的IDV进行校正，其相对表达量用各实验组与对照组比较的倍数表示。(2)以ELISA法测定内皮细胞(EC)培养上清液(CM)中t-PA，PAI-1总抗原的含量。(3)EC与不同浓度Fg(2，20，200，2000 μg/ml)或VLDL(5，10，20，30，40 μg/ml)共同孵育12 h或24 h后，观察EC t-PA和PAI-1 mRNA水平及CM中抗原含量的变化。(4)EC与某一浓度Fg(200 μg/ml)或VLDL(20 μg/ml)共同孵育不同时间后，观察EC t-PA和PAI-1 mRNA水平及CM中抗原含量的变化。 结果 (1)三个特异性扩增片断的分子量分别为368 bp(t-PA)、401 bp(PAI-1)、195 bp(GAPDH)，与预期长度相吻合；RT-PCR扩增所得产物量与扩增初始模板量之间具有明显的量-效关系。(2)在一定浓度范围内(20～2000 μg/ml)，Fg诱导PAI-1 mRNA表达呈剂量依赖性增加；Fg(200 μg/ml)诱导PAI-1 mRNA表达增加呈时间依赖性，与同一时相的对照组比较，PAI-1 mRNA在Fg刺激l h内增加，12 h达最大效应，为3.6倍，至少持续24 h；CM中PAI-1抗原的增加具有类似的量-效和时-效关系。(3)在一定浓度范围内(5～40 μg/ml)，VLDL诱导PAI-1 mRNA表达呈剂量依赖性增加;VLDL(20 μg/ml)诱导PAI-1 mRNA表达的增加呈时间依赖性，8 h开始有效，48 h达最大效应，为同一时相对照组的2.8倍；CM中PAI-1抗原的增加具有类似的量-效和时-效关系。(4)t-PA mRNA表达及抗原含量不受Fg或VLDL刺激的影响。 结论 (1)本实验建立可靠的单管RT-PCR半定量法检测EC t-PA、PAI-1 mRNA含量。(2)Fg,VLDL均能诱导EC PAI-1 mRNA含量的增加及CM中PAI-1抗原的积聚，而不影响t-PA mRNA及抗原水平，最终导致EC表面的纤溶活性降低，有利于血栓形成和动脉粥样硬化的发生与发展。
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关键词 纤维蛋白原； 极低密度脂蛋白： 组织型纤溶酶原激活物； I型纤溶酶原灭活剂；逆转录-聚合酶链式反应
(现在福建医科大学附属协和医院)
胰岛素诱导心肌肥厚的作用及机制的体外研究
硕士研究生 林 岚
专 业 内科学(心血管病)
导 师 王一波教授，洪华山副教授
目的 在培养的心脏细胞模型上，探讨胰岛素诱导心肌肥厚的作用及其机制。 方法 建立乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细跑的培养方法，用光镜、电镜及免疫细胞化学染色进行鉴定。与空白对照比较，观察胰岛素干预后两种细胞肥大、增殖的量效关系：(1)测定细胞蛋白含量(考马斯亮蓝法)。(2)细胞计数；BrdU、WST-1 ELISA同步测定细胞DNA合成与代谢活性；流式细胞仪分析细胞周期。(3)检测胰岛素(10-7mol)干预后细胞纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)、转化生长因子(TGF βl)及早期反应基因蛋白c-fos、c-myc的表达(免疫细胞化学染色)。 结果 (1)培养的乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度分别在90%和95%以上；(2)一定浓度胰岛素使心肌细胞蛋白含量增高，且在10-10～10-7mol呈量效关系，但心肌细胞数量、BrdU掺入、WST-1代谢活性及S+G2+M期细胞百分比无明显变化(P>0.05)；(3)一定浓度胰岛素使心肌成纤维细胞数量、BrdU掺入、WST-1代谢活性及S+G-2+M期细胞百分比均明显升高；(10-7～10-6)mol胰岛素尚增加其细胞蛋白含量(P<0.01或0.05)；(4)胰岛素(10-7mol)作用后，两种细胞的FN、TGF β1和心肌细胞LN表达增强；作用2 h，两种细胞的c-fos、c-myc蛋白表达均增强，但24 h c-fos表达基本消失。 结论 在体外培养的心脏细胞模型上，胰岛素可通过如下途径诱导心肌肥厚的发生：(1)增加心肌细胞蛋白含量从而促进心肌细胞肥大；(2)促进心肌成纤维细胞增殖；(3)增加FN、LN的表达，而可能参与细胞外基质的改建。作用机制可能与其诱导TGF β1合成及早期反应基因蛋白c-fos、c-myc表达有关。
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关键词 胰岛素; 心肌肥厚; 细胞培养
(现在福建医科大学附属协和医院)
氟伐他汀对高血压大鼠血管结构和功能的影响及机制
硕士研究生 林志鸿
专 业 内科学(心血管病学)
导 师 吴可贵教授,谢良地副教授
目的 探讨内源性胆固醇合成途径的限速酶-HMG-CoA还原酶的抑制剂一氟伐他汀对高血压血管肥厚、血管功能和高血压进程的影响，并揭示其可能的作用机制。 方法 (1)雄性SHR(n=26)，从8周龄起予氟伐他汀(fluvastatin,Flu)20 mg.kg-1.d-1灌胃，分别治疗8周和16周，年龄、性别配对的未治疗的SHR(n=20)和WKY(n=18)作对照。分别测定收缩压(SBP),血脂(TC、TG和LDL-C)(CHOD-PAP和GPO-PAP法);进行血管组织形态学观察，测定血管壁(中膜)/腔面积(W/L)比；应用离体动脉环试验观察血管的功能变化。(2)以培养8周龄的SHR和WKY大鼠胸主动脉平滑肌细胞(ASMCs)为模型，观察(l)两种不同的有丝分裂原-血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和血小板源生长因子(PDGF)对ASMCs增殖(细胞计数)和DNA合成(3H-TdR掺入率)的影响。(2)Flu对20%FCS、AngⅡ和PDGF促ASMCs分裂增殖的抑制作用及(3)胆固醇合成代谢中间产物甲羟戊酸(mevalonic acid，Meva)对Flu抑制ASMCs增殖和DNA合成的逆转效果。 结果 (1)短期Flu治疗4周，即明显延缓SHR的血压进程(175.32±10.90 vs 192.63±4.23 mmHg，P<0.05)，随治疗时间的延长(16周)，Flu使SHR的血压调定在相对低下的水平(193.75±15.03 vs 212.57±l2.01 mmHg，P<0.05).Flu治疗8周后，明显降低SHR的血脂，尤其是TC水平;治疗16周，Flu治疗组的血脂水平虽仍低于对照组，但较治疗8周并无进一步下降。短期Flu治疗(8周)，明显减轻SHR肠系膜动脉阻力血管的肥厚(0.44±0.09 vs 0.79±0.09,P<0.05),治疗至16周时，无论是阻力动脉(肠系膜动脉分支第三级)还是弹性动脉(胸主动脉)，其血管壁的肥厚均得到不同程度的改善(肠系膜动脉0.44±0.02 vs 0.50±0.03，P<0.05；胸主动脉0.25±0.02 vs 0.32±0.02，P<0.05).离体动脉环试验表明，Flu治疗明显改善SHR胸主动脉和肠系膜动脉对硝普钠(SNP)舒张的敏感性，降低对去甲肾上腺素(NE)收缩的反应;而且随着治疗的持续，这种有益效应得到巩固并达到WKY水平，而此时血脂并无进一步下降。(2)在2%FCS培养基条件下，AngⅡ和PDGF均明显的呈浓度依赖性的促进SHR和WKY ASMCs增殖和DNA合成，且作用在SHR表现得更为显著；Flu干预，呈浓度依赖性的抑制20%FCS、AngⅡ(10-6mol/L)和PDGF(10 ng/ml)促ASMCs增殖的作用，且对两种细胞的抑制效应无明显区别。10 μmol/L的Flu使20%FCS诱导的SHR和WKY细胞数分别减少83%和81%，3H-TdR掺入率减少61%和72%；抑制AngⅡ(10-6mol/L)和PDGF(10 ng/ml)诱导两种细胞增殖的作用，细胞数分别减少73%和76%,75%h和75%,3H-TdR掺入率分别减少64%和69%,81%和85%.10-3mol/L的Meva基本上(70%～100%)逆转了Flu所诱导的ASMCs细胞数和3H-TdR掺入率的减少，且这种逆转作用在两个细胞系相似。 结论 Flu治疗延缓了SHR血压发展进程，减轻血管壁的肥厚程度；改善或纠正了SHR血管的异常舒缩功能。其有益作用与显著抑制ASMCs增殖的效应有关，也表明了Meva代谢途径可能参与ASMCs的增殖过程。
, 百拇医药
关键词 氟伐他汀; 高血压; 血管肥厚; 血管平滑肌细胞; 甲羟戊酸
(现在福建医科大学附属第一医院)
普萘洛尔预处理对肥厚心肌再灌注损伤的保护作用
硕士研究生 郑理玲
专 业 外科学(胸心外科)
导 师 廖崇先教授,陈道中副教授
目的 肥厚心肌在心脏外科领域普遍存在，其对缺血再灌注损伤的敏感性较正常心肌明显增加，目前肥厚心肌保护尚不满意。本课题研究普萘洛尔预处理对大鼠肥厚心肌的保护作用并探讨其机制。 方法 实验选用健康8周龄雄性SD大鼠38只，2只用于正常心肌组织的超微结构观察，36只随机分为正常心肌(对照组)、肥厚心肌组(H组)、普萘洛尔组(P组)，每组12只。建立经典压力负荷性心肌肥厚模型。予H组、P组行腹主动脉缩窄术后饲养5周，对照组行假手术。围手术期P组日灌服普萘洛尔10 mg/kg,预处理共10天，对照组、H组灌服生理盐水。采用离体鼠心顺行灌注左心做功模型，观察各组心功能指标(AP，LVSP，LVEDP，AF，CF，CO,MVO2，CVR)；测定各组心肌代谢指标：心肌酶(LDH，CPK，CPK-MB)释放量、MDA含量；测定心肌含水量(MWC)；测定心脏重量指数：全心重量/体重、左心室重量/体重;取心肌组织观察超微结构并形态学定量测定线粒体损伤程度。 结果 (1)各组大鼠全部存活，切口无感染、渗血，服药期间无死亡。(2)H组、P组心脏重量指数明显高于对照组(P<0.01)，H组与P组无明显差异。(3)P组在再灌注15,30,60 min LVSP、AP、CF、AF、CO、MVO2均明显高于H组(P<0.05或P<0.01)；CVR、LVedp则明显低于H组(P<0.05或P<0.01)。(4)H组在再灌注15 min内心肌酶(LDH、CPK、CPK-MB)释放量明显高于P组(P<0.01)。(5)H组心肌组织MDA高于P组(P<0.01)。(6)各组心肌组织含水量无明显差异(P>0.05)。(7)心肌细胞线粒体形态学定量测定显示：P组心肌细胞线粒体损伤较H组明显减轻(P<0.01)；超微结构显示P组心肌细胞损伤比H组轻。 结论 (1)普萘洛尔预处理可明显改善肥厚心肌再灌注的血流动力学，减少再灌注时心肌酶释放，保护肥厚心肌。(2)普萘洛尔预处理以减轻心肌线粒体损伤，明显保护再灌注期间线粒体良好的呼吸功能，是减轻肥厚心肌再灌注损伤的一个重要机制。
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关键词 普萘洛尔; 预处理; 心肌肥厚; 再灌注损伤
(现在福建医科大学附属协和医院)
甲状腺乳头状癌端粒酶活性的表达
硕士研究生 黄雄飞
专 业 病理学
导 师 张鹏飞,杨代兴教授,程金妹副教授
目的 观察端粒酶在甲状腺良恶性组织中的表达情况，探讨端粒酶表达在甲状腺乳头状癌的潜在临床价值。 方法 采用TRAP酶标定量检测法和TRAP凝胶电泳定性分析法，对23例甲状腺乳头状癌组织,8例甲状腺滤泡性腺瘤，8例甲状腺肿和10例正常甲状腺组织进行端粒酶活性的检测。 结果 (1)甲状腺乳头状癌组，甲状腺滤泡性腺瘤组，甲状腺肿组和正常甲状腺组织组中端粒酶阳性检出率分别为86.7%，12.5%，12.5%，0%。甲状腺乳头状癌组较其他组差异有显著性(P<0.05)。(2)甲状腺乳头状癌中端粒酶活性检出率与病灶大小、年龄、淋巴结转移及组织学分级无关,病理分期晚期的检出率较早期的高(P<0.05)。(3)甲状腺乳头状癌组的端粒酶活性水平明显高于甲状腺良性病变组和甲状腺正常组织组(P<0.05)。(4)甲状腺乳头状癌端粒酶活性水平与组织学分级无关。病灶越大，年龄越大，病期越晚，端粒酶活性水平越高，伴淋巴结转移的高于无淋巴结转移者(P<0.05)。 结论 端粒酶是特异性较强的恶性肿瘤标记物，可作为甲状腺乳头状癌鉴别诊断和预后评估的良好的参考指标，深入研究端粒酶有助于发展新的肿瘤诊断方法。
关键词 甲状腺乳头状癌; 端粒酶活性; 检测
(现在福建医科大学), http://www.100md.com