TTV重叠感染对慢性乙肝病情的影响研究
作者：李国坚 周桂英 吴继周 周元平 罗光汉 单晓阳 梁远
单位：李国坚 周桂英 吴继周 罗光汉 单晓阳 梁远 广西医科大学第一附院(南宁530021)；周元平 中山医科大学第三附院
关键词：TTV；HBV；重叠感染
广西预防医学990407 摘 要 应用套式PCR检测了69例各型慢性乙型肝炎病人血清中的TTVDNA。结果表明，慢性乙型肝炎轻度、中度、重度、重症肝炎和肝炎后肝硬变病人血清TTVDNA的阳性率分别为8.33%(1/12)，5.88%(1/17)，9.09%(1/11)，11.11%(1/9)和20.0%(4/20)。慢性乙型肝炎总的TTV重叠感染率为11.59%(8/69)。经统计学分析，各组间无明显差异(P>0.05)。提示：TTV与HBV的重叠感染可能易于发展为肝硬变，但未见与慢性乙型肝炎病情轻重有明显关系。
TTV是一种新发现的非肠道传播的肝炎病毒[1]，该病毒可以引起肝脏的急慢性损害。尽管该病毒流行广泛，但其致病性如何目前尚不清楚，也是研究者们关注的焦点[2]。本研究探讨TTV的重叠感染对慢性乙肝病情的影响，为了解TTV致病性及防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象 为1998年7月至10月在我科住院的慢性乙型肝炎病人，其诊断标准按1995年5月北京第五次全国传染病寄生虫病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案(试行)》[3]诊断标准诊断。共69例，其中慢性乙肝轻度12例，中度17例，重度11例，肝炎肝硬变20例，慢性重症肝炎9例。其中男性61例，女性8例，年龄19～63岁，平均为38.7岁。
1.2 检测方法 采取研究对象外周血5ml分离出血清，低温(-20℃)保存备测。采用套式PCR方法检测研究对象血清中的TTVDNA。套式PCR引物由中山医科大学第三附院根据Okamoto等[4]报道设计。PCR程序为：(1)模板制备：于0.5ml离心管中加入裂解液5.5μl和待测血清50μl进行裂解。裂解程序为：55℃30分，97℃15分钟，将温度降至4℃后取出，12000rpm离心5分钟，取上清液作为第一轮PCR模板。(2)第一轮PCR：取第一轮PCR反应体系含引物T1和T2各20pmol/L，2mmol/L，10×Taq酶Buffer2.1μl，dNTPs2.1μl，Taq酶2u，加入5μl模板于0.5ml离心管中，反应总体积为20μl，加1滴石蜡油覆盖，上PCR仪进行扩增。循环参数为94℃40秒，55℃40秒，72℃1分钟。扩增35个循环，72℃7分钟延长。(3)第二轮PCR：取第二轮PCR反应体系含引物T3和T4各20pmol/L，2mmol/L，10×Taq酶buffer2.1μl，dNTPs2.1μl，Taq酶2u，第一轮PCR扩增产物3μl，放入0.5ml离心管中，总反应体积20μl，再加一滴石蜡油覆盖，上PCR仪进行扩增。循环参数为：94℃30秒，55℃40秒，72℃50秒，扩增30个循环，72℃7分钟延长。(4)结果判断：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在紫外线透射分析仪上进行观察，在272bpDNA带出现一条亮带即为阳性。
1.3 统计学方法 采用华西医科大学卫生统计教研室设计的PEMS软件包中计数资料多样本率的比较程序，在电脑上进行运算。
2 结果与讨论
套式PCR检测各组病人TTVDNA的结果见表1。由表中可见肝硬变组阳性率最高为20.0%(4/20)，经统计学分析，各组间的阳性率均无显著性差异(P>0.05)。
表1 各组肝炎病人TTVDNA检出情况 组别
例数
阳性数
阳性率(%)
慢性乙肝轻度
12
1
8.33
慢性乙肝中度
17
1
5.88
慢性乙肝重度
11
1
9.09
慢性重症乙肝
9
1
11.11
肝炎肝硬变
20
4
20.00
合计
69
8
11.59
过去的一些研究结果表明，慢性肝炎和重症肝炎及预后受到多种因素的影响[5]。肝炎病毒的重叠感染将对肝炎的病情及预后产生不良影响。由于TTV是一种新型肝炎病毒，对它的研究还刚开始，因此，TTV的致病性以及重叠感染对慢性乙肝的病情以及预后影响如何目前尚不清楚。本研究结果发现，在慢性乙肝轻度、中度、重度、重症以及肝炎后肝硬化病人中，TTVDNA的阳性率分别为8.33%(1/12)，5.88%(1/17)，9.09%(1/11)，11.11%(1/9)和20.00%(4/20)。可见肝炎后肝硬化组的TTVDNA重叠感染率最高，但经统计学分析各组间无统计学差异(P>0.05)。此结果似乎提示，HBV重叠感染TTV可能易发展为肝硬变，在此基础上易发展为原发性肝细胞癌。但对慢性乙肝病情的轻度、中度、重度以及重症肝炎未见明显影响。本研究各组病人的TTVDNA阳性率与英国[6]的结果接近，但低于日本的调查结果[4]。可见各国慢性肝病病人中的TTV感染情况不同，在肝病中的作用也存在差别。但由于本研究的样本数量还不够大，因此，尚不能下结论，还应继续深入研究。
参考文献
1 Nishizawa T,Okamoto H,korishi K,et al.A novel DNA virus(TTV) associated with elevated transaminase level in posttransfusion hepatitis of unknown etiology.Biochem Biophy Res Commun,1997,241(1):92
2 Cossarty,TTV a common virus,but pathogenic?Lancet,1998,352:164
3 中华医学会传染病寄生虫病学会修订《病毒性肝炎防治方案(试行)》.中华传染病杂志，1995，13(4)：241
4 Okamoto H,Nishizawa T,kato N,et al.Molecular cloning and charaterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiolgy.Hepatol Res,1998,10:1
5 吴玉章，冷泰俊，李梦东.重型病毒性肝炎预后数学模型的建立.中华内科杂志，1992,31(1)：18
6 Naoumov NV,Petrova EP,Thomas MG,et al.Presence of a newly described human DNA virus(TTV) in patients with liver disease.Lancet,1998,352:195
1998-12-31收稿。1999-03-15修回。