重离子辐射对体外支气管上皮细胞的失活效应*
作者：袁雄 叶常青 杨梅英 刘雷华 路秀琴
单位：袁雄 叶常青 杨梅英 刘雷华 北京放射医学研究所，北京 100850；路秀琴 中国原子能科学院核物理研究所，北京 102413
关键词：重离子辐射；危险截面；细胞失活
航天医学与医学工程990402摘要：目的 观察Li、C、F三种重离子辐射诱发的细胞失活效应。方法 用中国原子能科学院核物理研究所的HI-13串列加速器产生的 Li(Z=3，LET=100keV/μm)、C(Z=6，LET=300keV/μm)、F(Z=9，LET=1000keV/μm)三种离子束以0.5～6.0Gy剂量设计值照射人支气管上皮细胞系(BEAS-2B),以1000个细胞/瓶接种，计算存活分数。结果 三种重离子照射细胞后的细胞存活分数与照射剂量呈指数负相关关系,存活分数(SF,无量纲 )与剂量(D,Gy)关系的拟合方程分别为S=EXP(-D/1.28)(Li),S=EXP(-D/1.18)(C),S=EXP(-D/2.09)(F)；辐射敏感参数D0为1.28、1.18、2.09Gy,呈单击单靶模型。以60Coγ射线的D0为参比,Li、C及F离子的相对生物效应值相继是2.54、2.67和1.55。失活截面(σi )分别为12.5、40.6、76.5μm2。结论 Li、C、F对体外细胞的失活效应大于60Coγ射线,细胞失活至少需要一次以上的离子打击。
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中图分类号：R852.7 文献标识码：A 文章编号：1002-0837(1999)04-0240-05
Heavy Ion Radiation Induced Inactivation of Human Bronchial Epithelial Cells
YUAN Xiong,YE Chang-qing,YANG Mei-ying,LIU Lei-hua,LU Xiu-qin
Abstracts：Objective To observe the cell inactivating effects of Li,C and F ions. Method Li(Z=3),C(Z=6) and F(Z=9) ion beams,with LETs of 100 keV/μm,300 keV/μm and 1000 keV/μm,respectively were produced by HI-13 tandem accelerator at the Department of Nuclear Physics,China Institute of Atomic Energy.The human bronchial epithelium cell line(BEAS-2B) was irradiated with the designed doses ranging from 0.5 Gy to 6.0 Gy. After irradiation,the cells were cultured at 1000/flask and the survival fractions were calculated. Result The cell survival fraction (SF,non-unit) have negative exponential relations with dose(D,Gy) as shown by the fitted equations：SF=EXP(-D/1.28)(Li)；SF=EXP(-D/1.18)(C);SF=EXP(-D/2.09)(F),respectively. The sensitive parameters(D0,Gy) of radiation were D0=1.28; D0=1.18;D0=2.09,respectively.The patterns of cell survival were fitted to single target model. The relative biological effectiveness (RBE) for Li,C and F ions were 2.54,2.67,1.55,repectively,compared with D0 of γ-ray irradiation.The inactivation cross sections for these ions were 12.5，40.6 and 76.5μm2 respectively. Conclusion The effectiveness of radiation induced by heavy ions of Li,C and F was more serious than that of 60Co γ-ray,and more than one particle traversal are needed to kill a cell on the average.
, 百拇医药
Key words：heavy ion radiation;risk cross section;cell killing
Address reprint requests to：YE Chang-qing.Institute of Radiation Medicine,Beijing,27 Taiping Road,Beijing 100850,China
电离辐射对体外细胞的失活效应是放射生物学研究的一个重要方面，它可以在一定程度上反映电离辐射的急性杀伤效应。相关的结果可以为进一步研究提供必要的数据。重离子辐射是一种高LET辐射，它在空间电离辐射致航天员的危害中占重要地位,与低LET的X射线和γ射线诱发的损伤相比表现出更高的损伤效应。国外学者用哺乳动物非上皮细胞进行的实验结果表明重离子辐射最大失活效应值出现在LET值为100～200 keV/μm时,如果LET进一步增大,即出现所谓“ 过杀效应 ”的能量浪费[1～2]。危险截面是单位注量所致给定生物终点的概率[3]，Todd[4]认为细胞失活截面最大值可达到相当于细胞核的投影截面积。另有学者认为失活截面依赖于径迹结构,如果离子及其δ射线的范围超出细胞核范围,失活截面值也可大于细胞核截面积[5]。由于重离子辐射的离子种类、 各种辐射参数以及实验细胞的敏感性不同，迄今对其杀伤效应与辐射参数的关系未完全阐明。此类效应的模型也因实验不同解释也不同。本实验用BEAS-2B细胞为模型研究Li、 C、 F三种重离子对其的杀伤效应,以期能为空间电离辐射的危害评估和生物物理模型解释提供新的有价值的实验结果。
, 百拇医药
方 法
细胞培养与照射前处理 腺病毒12-SV40病毒的联合杂交病毒(Ad12SV40)永生化的人支气管上皮细胞系BEAS-2B,购自美国国家组织细胞库(ATCC)。用LHC-8(Biofluids,USA)无血清培养液培养,接种密度约为(1.5～3.0)×103/cm2。每隔2～3d换液,约一星期传代一次。待传代细胞用HBS缓冲液清洗1～2次,用0.25% EDTA—胰蛋白酶联合消化液消化脱落后,加胎牛血清终止消化,1000rpm离心6～10min,计数，按前述细胞密度重新悬浮于新的培养瓶中。培养环境为：37℃，5%CO2。取指数生长期的BEAS-2B细胞，用0.25% EDTA—胰蛋白酶联合消化液消化 以1×105/皿密度接种于自制的无菌培养皿内,培养24h后照射。
培养皿的制备 在无底玻璃环(d=30mm，侧有接种用小孔)顶底两边涂混合胶，平放于2.5μm厚Mylar膜上，经135℃烤3h，使膜与环粘牢，并达到干热灭菌的目的。
, 百拇医药
照射条件 用中国原子能研究院核物理研究所的HI-13串列加速器所生成的加速带电粒子束(粒子种类、注量、剂量等辐射参数详见表1)以法线方向自真空管道透过3×30cm薄膜窗(厚度0.12μm)照射培养皿底垂直放置的贴底薄层细胞样本,有5个平行孔位,同时放置5皿供照射用。另一孔位用半导体探测器探测相当于细胞层位置受照的粒子数，用记录的总计数控制每个剂量点所需的照射时间,设计剂量点为0.5～6.0Gy。用60Coγ射线做为低LET参照辐射源，源强为2.6×1015Bq(北京放射医学研究所)，在距源4m处剂量率为1.04Gy/min。新收集的BEAS-2B细胞以1×103细胞/瓶接种于25cm2塑料培养瓶中，分别以 0.5、1.0、3.0、5.0及6.0Gy剂量进行照射。
表1 三种照射离子的参数表
Table 1 Parameters of the three ions 组别
, 百拇医药
(groups)
7Li(100 keV/μm)
12C(300 keV/μm)
19F(1000 keV/μm)
D,Gy
Φ,10-6cm-2
D,Gy
Φ,10-6cm-2
D,Gy
Φ,10-6.cm-2
, 百拇医药
1
0
0
0
0
0
0
2
0.36
2.17
0.49
1.02
0.89
0.56
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3
0.67
4.05
0.93
1.94
1.01
0.63
4
1.91
11.60
1.78
3.71
2.67
, 百拇医药
1.67
5
3.31
20.10
3.60
7.51
4.16
2.60
6
6.33
38.40
4.85
10.10
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5.47
3.42
克隆形成实验 经重离子照射后细胞培养皿平放，细胞在含培养液状态下于2h内运回到实验室，经胰蛋白酶消化后，将所得受照细胞以1000个细胞/瓶的密度接种于50ml的培养瓶中，用10d克隆形成法测定克隆形成率,第10d将细胞固定、Gimsa染色，在镜下计数大于30个细胞的集落数。按下列公式计算细胞接种效率、相对存活分数。经60Coγ射线照射的细胞，于照后30min作上述接种处理，10d后计数细胞克隆数。
结果计算 细胞接种效率(colony forming efficiency,CFE)和受照细胞相对存活分数(survival fraction,SF)分别按下计算:
(1)
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(2)
当存活分数(SF,无量纲)与粒子注量(Φ,cm-2)呈指数依赖关系时,失活截面(σi,μm2) 及相对生物效应(RBE)按下式计算:
∵SF(Φ)=SF(0)*exp(-10-8σiΦ)(3)
∴σi=-108ln[SF(Φ)/SF(0)]/Φ=-108ln[SF(Φ)]/Φ(4)
RBE=D0(γ)/D0(ion)(5)
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SF(D)=EXP(-D/D0)(6)
D=1.6×10-9×LET×Φ(7)
σi=1.6×10-9×LET/D0(8)
式中:SF(Φ),SF(0)—分别为给定注量及未照射时的细胞存活分数,SF(0)=1.0;108,10-8为μm2与cm2的互换系数;γ,ion分别表示γ射线和重离子;D0—在半对数坐标图的量效关系曲线的直线段范围内存活分数自设定值下降至设定值的37%处所需剂量;1.6×10-9—在给定参数定义及量纲的前提下,由Φ推算D及由D0推算σi的换算系数;LET—传能线密度,keV/μm。Φ、σi已定义。
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结 果
细胞存活分数 不同剂量7Li、12C、19F和γ射线照射BEAS-2B细胞的存活分数如表2,3所示。剂量-效应关系如图1,2。
表2 三种离子照射BEAS-2B细胞的接种效率和存活分数
Table 2 The CEF and SF of BEAS-2B cells irradiated with the three ions 组别
(groups)
7Li
12C
19F
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CEF(%)
SF
CEF(%)
SF
CEF(%)
SF
1
48.4±2.6
1.00
51.4±3.8
1.00
46.0±1.2
1.00
, 百拇医药
2
18.2±1.6
0.37±0.03
23.8±1.5
0.46±0.03
30.8±1.8
0.67±0.04
3
13.8±1.4
0.28±0.03
19.0±1.4
0.37±0.02
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19.8±1.2
0.43±0.02
4
8.18±1.2
0.17±0.05
15.4±1.3
0.30±0.02
14.7±2.4
0.32±0.05
5
3.12±3.0
0.06±0.06
, 百拇医药
5.14±0.8
0.10±0.01
5.52±1.2
0.12±0.02
6
0.48±1.6
0.01±0.03
0.51±0.7
0.01±0.01
3.68±1.6
0.08±0.03
表3 γ射线照射BEAS-2B细胞的接种效率和存活分数
, 百拇医药
Table 3 The CFE and SF of BEAS-2B cells exposed to γ-ray 剂量(dose)(Gy)
CFE(%)
SF
0
64.1±4.3
1.00
0.5
59.6±3.3
0.93±0.23
1.0
55.1±3.8
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0.86±0.22
1.5
44.9±2.2
0.70±0.27
2.0
25.6±3.4
0.40±0.12
3.0
18.6±3.3
0.29±0.10
4.0
8.97±1.8
, 百拇医药
0.14±0.04
6.0
1.1±0.4
0.017±0.006
图1 Li、C、F离子照射后剂量—细胞存活曲线
Fig.1 Survival v.s. dosage of the three ions
图2 γ射线照射后剂量—细胞存活曲线
Fig.2 Survival v.s. dosage of the γ ray
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细胞存活拟合方程(SF),失活截面(σi)及相对生物效应(RBE)经不同剂量的三种离子及γ射线照射后,细胞的相对存活率随剂量的增大而下降。参考文献的一般规律,依据指数线性方程拟合了Li,C,F三种离子所致存活分数,其拟合系数(R)依次为0.900,0.966,0.973,可以认为它们均属于单靶模型；γ射线所致的细胞存活曲线在低剂量时有一平肩期,随照射剂量增加,细胞存活率也呈指数下降,R=0.993。各组D0、σi、RBE及与LET等参数如表4所示。
表4 三种离子和γ射线致细胞失活的辐射敏感参数比较
Table 4 Sensitive parameters of the cells to the three ions and γ-ray 参数(parameters)
7Li
, 百拇医药
12C
19F
D0(Gy)
1.28
1.18
2.09
SF
EXP(-D/1.28)
EXP(-D/1.18)
EXP(-D/2.09)
R
0.900
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0.966
0.973
RBE
2.54
2.76
1.55
σ1iμm2
23.6±14.6
47.2±18.3
86.0±27.3
σ2iμm2
, 百拇医药
12.5
40.6
76.5
LET(keV/μm)
100
300
1000
注：γ射线D0=3.26Gy,存活曲线拟合方程为SF=1-[1-EXP(-D/3.26)]1.33,R=0.993,属多靶模型。1—由式4导出，2—由SF方程斜率导出
Note:γ-ray D0=3.26Gy,survival fraction fitted function:SF=1-[1-EXP(-D/3.26)]1.33,R=0.993,multi-target model.1—derived from function 4,2—derived from the slope of SF function讨 论
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各种电离辐射对细胞均有杀伤能力,受辐照处理的体外培养哺乳动物细胞在分裂、集落形成能力上低于同类型、同样培养条件下未受过处理的细胞。这表明辐照处理可有效地抑制体外培养细胞的分裂,使其失去增殖能力,即细胞失活。辐射对高等动物的致死效应可在体外培养系统中以细胞的增殖性死亡(失活)形式在一定程度上表现出来,为辐射的急性杀伤作用提供相关的数据,弥补整体动物实验的不足。
本实验用不同LET的Li、C和F离子及γ射线照射人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)，三种离子致细胞存活分数与离子的剂量和注量呈指数线性负相关关系，拟合的存活曲线为单靶型，与α粒子等高LET辐射的细胞失活效应相一致。γ射线致细胞存活曲线为多靶模型，在半对数坐标上呈典型的有肩部的曲线，在低剂量时，低LET辐射致细胞存活分数较高，随剂量的增高，存活分数呈指数式下降。上述现象被认为与DNA损伤类型及修复有关。低LET辐射所致的损伤简单，大多数损伤易被修复；而高LET辐射的损伤类型复杂，不易被修复，所以对重离子辐射，随粒子LET的增高，存活曲线的肩部逐渐变窄，乃至消失[6]。
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放射生物学中，应用相对生物效应系数(RBE)来比较不同类型辐射引起生物效应的效能[7]。 以Li、C、F等三种离子的D0值(Gy)导出的 RBE 显示,随LET的增高,RBE值下降,对应这三种离子100keV/μm、300keV/μm、1000keV/μm的LET值,符合重离子的细胞失活效应规律。在LET值较低时,RBE-LET呈正相关关系,当 LET值大于100～200keV/μm时,RBE值达到一坪值,随着LET值进一步增大,RBE值趋向减小。这是因为在LET值较低时,离子的杀伤效应随LET值增加而增大,逐渐达到饱和状态,此时如LET值继续增大并不能增加杀伤效应,大多数沉积的能量被浪费了,即产生“ 过杀效应 ”。本实验得出的 RBE值与大量实验的结果相近，但与Tsuboi等[8]用相似LET的铁离子照射正常人皮肤成纤维细胞所得的RBE值相比偏低,可能与细胞系的不同有关,也提示可能每种离子有特异的辐射径迹。
危险截面是对粒子与生物组织相互作用后，引起的生物终点的定量描述。细胞失活截面(σi)是上述指标中研究得最多的一项。本实验Li、C及F三种离子的细胞失活截面分别为12.5μm2、40.6μm2及76.5μm2,其对应的LET值分别是100keV/μm、300keV/μm及1000keV/μm。细胞失活截面与LET的一般规律是随LET增加,σi也略成正比地增加,当LET达到几百keV/μm时呈坪状,达到饱和。LET值再增加,σi反而下降,形成 “σi”钩。因客观条件限制，本实验只得到了三个细胞失活截面值，但分析失活截面增长趋势，可以初步看出，100～300keV/μm细胞失活截面增长趋势较快，而300～1000keV/μm时，增长趋势明显趋缓，提示出现坪值的LET值可能在此区间。本实验无论是用斜率计算得到的σi(2)值,还是通过Φ获得的σi(1),均呈现了上述趋势,通过斜率计算得到的σi值反映了总体趋势下的失活截面,而通过Φ获得的是不同照射剂量时的平均值,易受实验时粒子注量上下涨落的影响。很显然，本实验所获得的失活截面积均小于细胞核截面积，提示需有≥2个粒子的穿越才可能杀死细胞。Hei等[9]用α单粒子致哺乳动物细胞失活效应已证实上述观点。
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重离子的细胞杀伤效应是一极其复杂的过程，它涉及到物理、化学、生化等多种变化，所以迄今尚没有一种统一的理论模型可以较完整地解释实验所观察到的现象。今后可以通过对某一重离子不同LET的生物效应研究或同一LET条件下不同离子对生物体系作用的系统研究，获得相对较精确的数据，从而为生物物理模型提供更好的实验计算参数。
*基金项目：国家自然科学基金(39670236)
参考文献
[1]Raju MR,Carpenter SG.A heavy particle comparative study[J].Br J Radiol,1978，51(609): 720～727
[2]Tao F,Medvedovsky C,David J et al.Accelerated heavy ions and lens[J].Int J Radiat Biol,1993，64(1): 103～111
, http://www.100md.com
[3]Curtis SB,Nealy JE,Wilson JW.Risk cross sections and their application to risk estimation in the galactic cosmic-ray environment[J].Radiat Res,1995，141: 57～65
[4]Todd P.Multiple cell hits by particle tracks in solid tissue[J].Adv Space Res,1992，12(2): 393～401
[5]Goodhead DT.Molecular and cell models of biological effects of heavy ion radiation[J].Radiat Environ Biophys，1995，34(2): 67～72
[6]Bertsche U,Iliakis G.Modifications in repair and expression of potentially lethal damage(α-PLD ) as measured by delayed plating or treatment with β-araA in plateau-phase Ehrlich ascites tumor cells after exposure to charged particles of various specific energies[J].Radiat Res,1987，111(1): 26～46
, http://www.100md.com
[7]李士骏等.电离辐射剂量学[M].北京：原子能出版社,1981: 61～62
[8]Tsuboi K,Yang TC,Chen DJ.Charged-Particle Mutagenesis[J].Radiat Res,1992，129: 171～176
[9]Hei TK,Wu LJ,Liu SX et al.Mutagenic effects of a single and an exact number of alpha particles in mammalian cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(8):3765～3770
收稿日期：1998-10-08, http://www.100md.com
单位：袁雄 叶常青 杨梅英 刘雷华 北京放射医学研究所，北京 100850；路秀琴 中国原子能科学院核物理研究所，北京 102413
关键词：重离子辐射；危险截面；细胞失活
航天医学与医学工程990402摘要：目的 观察Li、C、F三种重离子辐射诱发的细胞失活效应。方法 用中国原子能科学院核物理研究所的HI-13串列加速器产生的 Li(Z=3，LET=100keV/μm)、C(Z=6，LET=300keV/μm)、F(Z=9，LET=1000keV/μm)三种离子束以0.5～6.0Gy剂量设计值照射人支气管上皮细胞系(BEAS-2B),以1000个细胞/瓶接种，计算存活分数。结果 三种重离子照射细胞后的细胞存活分数与照射剂量呈指数负相关关系,存活分数(SF,无量纲 )与剂量(D,Gy)关系的拟合方程分别为S=EXP(-D/1.28)(Li),S=EXP(-D/1.18)(C),S=EXP(-D/2.09)(F)；辐射敏感参数D0为1.28、1.18、2.09Gy,呈单击单靶模型。以60Coγ射线的D0为参比,Li、C及F离子的相对生物效应值相继是2.54、2.67和1.55。失活截面(σi )分别为12.5、40.6、76.5μm2。结论 Li、C、F对体外细胞的失活效应大于60Coγ射线,细胞失活至少需要一次以上的离子打击。
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中图分类号：R852.7 文献标识码：A 文章编号：1002-0837(1999)04-0240-05
Heavy Ion Radiation Induced Inactivation of Human Bronchial Epithelial Cells
YUAN Xiong,YE Chang-qing,YANG Mei-ying,LIU Lei-hua,LU Xiu-qin
Abstracts：Objective To observe the cell inactivating effects of Li,C and F ions. Method Li(Z=3),C(Z=6) and F(Z=9) ion beams,with LETs of 100 keV/μm,300 keV/μm and 1000 keV/μm,respectively were produced by HI-13 tandem accelerator at the Department of Nuclear Physics,China Institute of Atomic Energy.The human bronchial epithelium cell line(BEAS-2B) was irradiated with the designed doses ranging from 0.5 Gy to 6.0 Gy. After irradiation,the cells were cultured at 1000/flask and the survival fractions were calculated. Result The cell survival fraction (SF,non-unit) have negative exponential relations with dose(D,Gy) as shown by the fitted equations：SF=EXP(-D/1.28)(Li)；SF=EXP(-D/1.18)(C);SF=EXP(-D/2.09)(F),respectively. The sensitive parameters(D0,Gy) of radiation were D0=1.28; D0=1.18;D0=2.09,respectively.The patterns of cell survival were fitted to single target model. The relative biological effectiveness (RBE) for Li,C and F ions were 2.54,2.67,1.55,repectively,compared with D0 of γ-ray irradiation.The inactivation cross sections for these ions were 12.5，40.6 and 76.5μm2 respectively. Conclusion The effectiveness of radiation induced by heavy ions of Li,C and F was more serious than that of 60Co γ-ray,and more than one particle traversal are needed to kill a cell on the average.
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电离辐射对体外细胞的失活效应是放射生物学研究的一个重要方面，它可以在一定程度上反映电离辐射的急性杀伤效应。相关的结果可以为进一步研究提供必要的数据。重离子辐射是一种高LET辐射，它在空间电离辐射致航天员的危害中占重要地位,与低LET的X射线和γ射线诱发的损伤相比表现出更高的损伤效应。国外学者用哺乳动物非上皮细胞进行的实验结果表明重离子辐射最大失活效应值出现在LET值为100～200 keV/μm时,如果LET进一步增大,即出现所谓“ 过杀效应 ”的能量浪费[1～2]。危险截面是单位注量所致给定生物终点的概率[3]，Todd[4]认为细胞失活截面最大值可达到相当于细胞核的投影截面积。另有学者认为失活截面依赖于径迹结构,如果离子及其δ射线的范围超出细胞核范围,失活截面值也可大于细胞核截面积[5]。由于重离子辐射的离子种类、 各种辐射参数以及实验细胞的敏感性不同，迄今对其杀伤效应与辐射参数的关系未完全阐明。此类效应的模型也因实验不同解释也不同。本实验用BEAS-2B细胞为模型研究Li、 C、 F三种重离子对其的杀伤效应,以期能为空间电离辐射的危害评估和生物物理模型解释提供新的有价值的实验结果。
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方 法
细胞培养与照射前处理 腺病毒12-SV40病毒的联合杂交病毒(Ad12SV40)永生化的人支气管上皮细胞系BEAS-2B,购自美国国家组织细胞库(ATCC)。用LHC-8(Biofluids,USA)无血清培养液培养,接种密度约为(1.5～3.0)×103/cm2。每隔2～3d换液,约一星期传代一次。待传代细胞用HBS缓冲液清洗1～2次,用0.25% EDTA—胰蛋白酶联合消化液消化脱落后,加胎牛血清终止消化,1000rpm离心6～10min,计数，按前述细胞密度重新悬浮于新的培养瓶中。培养环境为：37℃，5%CO2。取指数生长期的BEAS-2B细胞，用0.25% EDTA—胰蛋白酶联合消化液消化 以1×105/皿密度接种于自制的无菌培养皿内,培养24h后照射。
培养皿的制备 在无底玻璃环(d=30mm，侧有接种用小孔)顶底两边涂混合胶，平放于2.5μm厚Mylar膜上，经135℃烤3h，使膜与环粘牢，并达到干热灭菌的目的。
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照射条件 用中国原子能研究院核物理研究所的HI-13串列加速器所生成的加速带电粒子束(粒子种类、注量、剂量等辐射参数详见表1)以法线方向自真空管道透过3×30cm薄膜窗(厚度0.12μm)照射培养皿底垂直放置的贴底薄层细胞样本,有5个平行孔位,同时放置5皿供照射用。另一孔位用半导体探测器探测相当于细胞层位置受照的粒子数，用记录的总计数控制每个剂量点所需的照射时间,设计剂量点为0.5～6.0Gy。用60Coγ射线做为低LET参照辐射源，源强为2.6×1015Bq(北京放射医学研究所)，在距源4m处剂量率为1.04Gy/min。新收集的BEAS-2B细胞以1×103细胞/瓶接种于25cm2塑料培养瓶中，分别以 0.5、1.0、3.0、5.0及6.0Gy剂量进行照射。
表1 三种照射离子的参数表
Table 1 Parameters of the three ions 组别
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(groups)
7Li(100 keV/μm)
12C(300 keV/μm)
19F(1000 keV/μm)
D,Gy
Φ,10-6cm-2
D,Gy
Φ,10-6cm-2
D,Gy
Φ,10-6.cm-2
, 百拇医药
1
0
0
0
0
0
0
2
0.36
2.17
0.49
1.02
0.89
0.56
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3
0.67
4.05
0.93
1.94
1.01
0.63
4
1.91
11.60
1.78
3.71
2.67
, 百拇医药
1.67
5
3.31
20.10
3.60
7.51
4.16
2.60
6
6.33
38.40
4.85
10.10
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5.47
3.42
克隆形成实验 经重离子照射后细胞培养皿平放，细胞在含培养液状态下于2h内运回到实验室，经胰蛋白酶消化后，将所得受照细胞以1000个细胞/瓶的密度接种于50ml的培养瓶中，用10d克隆形成法测定克隆形成率,第10d将细胞固定、Gimsa染色，在镜下计数大于30个细胞的集落数。按下列公式计算细胞接种效率、相对存活分数。经60Coγ射线照射的细胞，于照后30min作上述接种处理，10d后计数细胞克隆数。
结果计算 细胞接种效率(colony forming efficiency,CFE)和受照细胞相对存活分数(survival fraction,SF)分别按下计算:
(1), 百拇医药
(2)当存活分数(SF,无量纲)与粒子注量(Φ,cm-2)呈指数依赖关系时,失活截面(σi,μm2) 及相对生物效应(RBE)按下式计算:
∵SF(Φ)=SF(0)*exp(-10-8σiΦ)(3)
∴σi=-108ln[SF(Φ)/SF(0)]/Φ=-108ln[SF(Φ)]/Φ(4)
RBE=D0(γ)/D0(ion)(5)
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SF(D)=EXP(-D/D0)(6)
D=1.6×10-9×LET×Φ(7)
σi=1.6×10-9×LET/D0(8)
式中:SF(Φ),SF(0)—分别为给定注量及未照射时的细胞存活分数,SF(0)=1.0;108,10-8为μm2与cm2的互换系数;γ,ion分别表示γ射线和重离子;D0—在半对数坐标图的量效关系曲线的直线段范围内存活分数自设定值下降至设定值的37%处所需剂量;1.6×10-9—在给定参数定义及量纲的前提下,由Φ推算D及由D0推算σi的换算系数;LET—传能线密度,keV/μm。Φ、σi已定义。
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结 果
细胞存活分数 不同剂量7Li、12C、19F和γ射线照射BEAS-2B细胞的存活分数如表2,3所示。剂量-效应关系如图1,2。
表2 三种离子照射BEAS-2B细胞的接种效率和存活分数
Table 2 The CEF and SF of BEAS-2B cells irradiated with the three ions 组别
(groups)
7Li
12C
19F
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CEF(%)
SF
CEF(%)
SF
CEF(%)
SF
1
48.4±2.6
1.00
51.4±3.8
1.00
46.0±1.2
1.00
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2
18.2±1.6
0.37±0.03
23.8±1.5
0.46±0.03
30.8±1.8
0.67±0.04
3
13.8±1.4
0.28±0.03
19.0±1.4
0.37±0.02
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19.8±1.2
0.43±0.02
4
8.18±1.2
0.17±0.05
15.4±1.3
0.30±0.02
14.7±2.4
0.32±0.05
5
3.12±3.0
0.06±0.06
, 百拇医药
5.14±0.8
0.10±0.01
5.52±1.2
0.12±0.02
6
0.48±1.6
0.01±0.03
0.51±0.7
0.01±0.01
3.68±1.6
0.08±0.03
表3 γ射线照射BEAS-2B细胞的接种效率和存活分数
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Table 3 The CFE and SF of BEAS-2B cells exposed to γ-ray 剂量(dose)(Gy)
CFE(%)
SF
0
64.1±4.3
1.00
0.5
59.6±3.3
0.93±0.23
1.0
55.1±3.8
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0.86±0.22
1.5
44.9±2.2
0.70±0.27
2.0
25.6±3.4
0.40±0.12
3.0
18.6±3.3
0.29±0.10
4.0
8.97±1.8
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0.14±0.04
6.0
1.1±0.4
0.017±0.006
图1 Li、C、F离子照射后剂量—细胞存活曲线
Fig.1 Survival v.s. dosage of the three ions
图2 γ射线照射后剂量—细胞存活曲线
Fig.2 Survival v.s. dosage of the γ ray
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细胞存活拟合方程(SF),失活截面(σi)及相对生物效应(RBE)经不同剂量的三种离子及γ射线照射后,细胞的相对存活率随剂量的增大而下降。参考文献的一般规律,依据指数线性方程拟合了Li,C,F三种离子所致存活分数,其拟合系数(R)依次为0.900,0.966,0.973,可以认为它们均属于单靶模型；γ射线所致的细胞存活曲线在低剂量时有一平肩期,随照射剂量增加,细胞存活率也呈指数下降,R=0.993。各组D0、σi、RBE及与LET等参数如表4所示。
表4 三种离子和γ射线致细胞失活的辐射敏感参数比较
Table 4 Sensitive parameters of the cells to the three ions and γ-ray 参数(parameters)
7Li
, 百拇医药
12C
19F
D0(Gy)
1.28
1.18
2.09
SF
EXP(-D/1.28)
EXP(-D/1.18)
EXP(-D/2.09)
R
0.900
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0.966
0.973
RBE
2.54
2.76
1.55
σ1iμm2
23.6±14.6
47.2±18.3
86.0±27.3
σ2iμm2
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12.5
40.6
76.5
LET(keV/μm)
100
300
1000
注：γ射线D0=3.26Gy,存活曲线拟合方程为SF=1-[1-EXP(-D/3.26)]1.33,R=0.993,属多靶模型。1—由式4导出，2—由SF方程斜率导出
Note:γ-ray D0=3.26Gy,survival fraction fitted function:SF=1-[1-EXP(-D/3.26)]1.33,R=0.993,multi-target model.1—derived from function 4,2—derived from the slope of SF function讨 论
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各种电离辐射对细胞均有杀伤能力,受辐照处理的体外培养哺乳动物细胞在分裂、集落形成能力上低于同类型、同样培养条件下未受过处理的细胞。这表明辐照处理可有效地抑制体外培养细胞的分裂,使其失去增殖能力,即细胞失活。辐射对高等动物的致死效应可在体外培养系统中以细胞的增殖性死亡(失活)形式在一定程度上表现出来,为辐射的急性杀伤作用提供相关的数据,弥补整体动物实验的不足。
本实验用不同LET的Li、C和F离子及γ射线照射人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)，三种离子致细胞存活分数与离子的剂量和注量呈指数线性负相关关系，拟合的存活曲线为单靶型，与α粒子等高LET辐射的细胞失活效应相一致。γ射线致细胞存活曲线为多靶模型，在半对数坐标上呈典型的有肩部的曲线，在低剂量时，低LET辐射致细胞存活分数较高，随剂量的增高，存活分数呈指数式下降。上述现象被认为与DNA损伤类型及修复有关。低LET辐射所致的损伤简单，大多数损伤易被修复；而高LET辐射的损伤类型复杂，不易被修复，所以对重离子辐射，随粒子LET的增高，存活曲线的肩部逐渐变窄，乃至消失[6]。
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放射生物学中，应用相对生物效应系数(RBE)来比较不同类型辐射引起生物效应的效能[7]。 以Li、C、F等三种离子的D0值(Gy)导出的 RBE 显示,随LET的增高,RBE值下降,对应这三种离子100keV/μm、300keV/μm、1000keV/μm的LET值,符合重离子的细胞失活效应规律。在LET值较低时,RBE-LET呈正相关关系,当 LET值大于100～200keV/μm时,RBE值达到一坪值,随着LET值进一步增大,RBE值趋向减小。这是因为在LET值较低时,离子的杀伤效应随LET值增加而增大,逐渐达到饱和状态,此时如LET值继续增大并不能增加杀伤效应,大多数沉积的能量被浪费了,即产生“ 过杀效应 ”。本实验得出的 RBE值与大量实验的结果相近，但与Tsuboi等[8]用相似LET的铁离子照射正常人皮肤成纤维细胞所得的RBE值相比偏低,可能与细胞系的不同有关,也提示可能每种离子有特异的辐射径迹。
危险截面是对粒子与生物组织相互作用后，引起的生物终点的定量描述。细胞失活截面(σi)是上述指标中研究得最多的一项。本实验Li、C及F三种离子的细胞失活截面分别为12.5μm2、40.6μm2及76.5μm2,其对应的LET值分别是100keV/μm、300keV/μm及1000keV/μm。细胞失活截面与LET的一般规律是随LET增加,σi也略成正比地增加,当LET达到几百keV/μm时呈坪状,达到饱和。LET值再增加,σi反而下降,形成 “σi”钩。因客观条件限制，本实验只得到了三个细胞失活截面值，但分析失活截面增长趋势，可以初步看出，100～300keV/μm细胞失活截面增长趋势较快，而300～1000keV/μm时，增长趋势明显趋缓，提示出现坪值的LET值可能在此区间。本实验无论是用斜率计算得到的σi(2)值,还是通过Φ获得的σi(1),均呈现了上述趋势,通过斜率计算得到的σi值反映了总体趋势下的失活截面,而通过Φ获得的是不同照射剂量时的平均值,易受实验时粒子注量上下涨落的影响。很显然，本实验所获得的失活截面积均小于细胞核截面积，提示需有≥2个粒子的穿越才可能杀死细胞。Hei等[9]用α单粒子致哺乳动物细胞失活效应已证实上述观点。
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重离子的细胞杀伤效应是一极其复杂的过程，它涉及到物理、化学、生化等多种变化，所以迄今尚没有一种统一的理论模型可以较完整地解释实验所观察到的现象。今后可以通过对某一重离子不同LET的生物效应研究或同一LET条件下不同离子对生物体系作用的系统研究，获得相对较精确的数据，从而为生物物理模型提供更好的实验计算参数。
*基金项目：国家自然科学基金(39670236)
参考文献
[1]Raju MR,Carpenter SG.A heavy particle comparative study[J].Br J Radiol,1978，51(609): 720～727
[2]Tao F,Medvedovsky C,David J et al.Accelerated heavy ions and lens[J].Int J Radiat Biol,1993，64(1): 103～111
, http://www.100md.com
[3]Curtis SB,Nealy JE,Wilson JW.Risk cross sections and their application to risk estimation in the galactic cosmic-ray environment[J].Radiat Res,1995，141: 57～65
[4]Todd P.Multiple cell hits by particle tracks in solid tissue[J].Adv Space Res,1992，12(2): 393～401
[5]Goodhead DT.Molecular and cell models of biological effects of heavy ion radiation[J].Radiat Environ Biophys，1995，34(2): 67～72
[6]Bertsche U,Iliakis G.Modifications in repair and expression of potentially lethal damage(α-PLD ) as measured by delayed plating or treatment with β-araA in plateau-phase Ehrlich ascites tumor cells after exposure to charged particles of various specific energies[J].Radiat Res,1987，111(1): 26～46
, http://www.100md.com
[7]李士骏等.电离辐射剂量学[M].北京：原子能出版社,1981: 61～62
[8]Tsuboi K,Yang TC,Chen DJ.Charged-Particle Mutagenesis[J].Radiat Res,1992，129: 171～176
[9]Hei TK,Wu LJ,Liu SX et al.Mutagenic effects of a single and an exact number of alpha particles in mammalian cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(8):3765～3770
收稿日期：1998-10-08, http://www.100md.com