导数同步荧光法测定血清色氨酸
作者：杨晋 吴惠毅 梁文学 陈晋 杨新玲 孙兴会
单位：连云港市第一人民医院中心实验室，江苏连云港222002
关键词：导数-同步荧光；色氨酸
临床检验杂志990402 摘要 为了排除酪氨酸、苯丙氨酸对荧光法测定色氨酸的干扰，建立了色氨酸导数-同步荧光测定法。结果表明，当Δλ为90 nm时，色氨酸的一阶导数-同步荧光峰在285 nm时不受酪氨酸、苯丙氨酸的干扰；色氨酸浓度在0～400 μmol/L与导数-同步荧光值成线性，Y＝0.287X±0.096，r＝0.999；批内、批间CV分别为2.57%、3.42%；回收率93.8%～97.2%；血红蛋白含量在0.25～5.0 g/L、胆红素含量在42.75～342 μmol/L对测定无干扰；30例健康成年人血清色氨酸测定结果为73.98±7.26(
±s) μmol/L；本法操作简单、快速，测定结果准确，是血清色氨酸常规测定较为理想的方法。
, 百拇医药
Determination of tryptophan in serum by derivative synchronous fluorescence method
YANG Jin,WU Huiyi,LIANG Wenxue,et al
.(The First Hospital of Lianyungang,Jiangsu Lianyungang 222002)
Abstract To remove the interference from tyrosine and phenylalanine in the determination of tryptophan by fluorescence method,The author established the determination method of free tryptophan in serum by derivative synchronous fluorescence.The results showed,when Δλ was 90 nm,the peak of derivative synchronous fluorescence wasn't disturbed by tyrosine and phenylalanine at λ285 nm. The linear rang is 0 to 400 μmol/L(Y＝0.287X±0.096,r＝0.999).The intra-and inter-assay CV are 2.57% and 3.42%，respectively.The analytical recovery is 93.8% to 97.2%. The determination wasn't disturbed by hemoglobin(0.25～5.0 g/L)and bilirubin(42.75～342 μmol/L).Reference value of the tryptophan in serum from 30 healthy individuals were 73.98±7.26(±s). The method is simple,rapid,and precise,so it is a reasonable method for detection of tryptophan in serum.
, 百拇医药
Key words derivative synchronous fluorescence; tryptophan
色氨酸(tryptophan)是一种人体必需氨基酸，血清中色氨酸含量与肝性脑病[1，2]及神经介质5-羟色胺密切相关，测定其含量可为肝性脑病的临床诊断、治疗和发生精神症状的机理研究提供依据。目前，色氨酸的测定方法通常采用荧光法[3]、高效液相色谱法(HPLC)和氨基酸分析仪法。前者操作复杂，时间长，干扰因素多；而后两者虽然快速，准确，但仪器价格昂贵，很难在临床普及应用。本文利用色氨酸的天然荧光特性以及导数-同步荧光光谱的特点[4]，建立了血清中色氨酸导数同步荧光光谱定量测定方法，消除了酪氨酸、苯丙氨酸的干扰，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 仪器 Hitachi F-4010型荧光分光光度计；DL-6000B冷冻离心机。
, 百拇医药
1.2 试剂 1.0 mol/L色氨酸标准贮存液：称取色氨酸(Sigma产品)10.21 mg，加蒸馏水溶解并稀释至50 ml；50 μmol/L色氨酸标准应用液：用蒸馏水将标准贮存液稀释20倍；0.1 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液；无水乙醇(AR，上海试剂总厂)；所有实验用水均为石英亚沸蒸馏水。
1.3 方法 取3支试管，标明测定、标准、空白，分别加入血清、标准应用液、水各25 μl，每管加无水乙醇1 ml，振荡混匀30 s静置5 min，3000 r/min离心12 min，取上清液0.5 ml，加1 ml pH 7.4的磷酸盐缓冲液，混匀静置10 min后进行荧光测定。仪器测定参数，Ex、Em带宽均为5 nm，灵敏度置HIGH PM GAIN，Both Scan(同步扫描)，扫描速度600 nm/min；Δλ＝90 nm，Ex波长从220～350 nm进行同步荧光扫描，将其同步荧光光谱转换成一阶导数光谱，读取285 nm波长处的导数值。
, 百拇医药 2 实验结果
2.1 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的荧光光谱 我们观察了浓度分别为100 μmol/L的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸标准液的激发、发射光谱，结果表明，它们的激发和发射光谱相互重叠，存在干扰，无法直接测定色氨酸，与国内外文献报道一致。
2.2 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的同步荧光光谱 观察这三种氨基酸在不同Δλ条件下同步荧光光谱，结果表明，随着Δλ的增加，苯丙氨酸、酪氨酸对色氨酸的干扰逐渐减小，当Δλ为90 nm时，酪氨酸、苯丙氨酸对色氨酸的干扰最小，见图1，但仍不能完全排除干扰。
Figure 1 1.Synchronous fluorescence spectroscopy of tryptophan，tyrosine and phenylalanine
, 百拇医药
图1 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸同步荧光光谱
2.3 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸导数-同步荧光光谱 分别绘制三种氨基酸一阶导数-同步荧光光谱，见图2A。从图2A可以看出，Δλ为90 nm时，在285 nm波长时，色氨酸的导数-同步荧光光谱不受酪氨酸、苯丙氨酸干扰。为了进一步验证酪氨酸、苯丙氨酸的同步荧光-导数光谱对色氨酸不产生干扰，我们观察了浓度分别为100 μmol/L色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸三种氨基酸混合标准液与单一的100 μmol/L色氨酸标准液一阶导数-同步荧光光谱，见图2B，从图中可以看出，三种氨基酸混合液一阶导数-同步荧光光谱与色氨酸的一阶导数-同步荧光光谱在285 nm时完全重合，同时我们观察了血清标本的一阶导数-同步荧光光谱，结果与色氨酸标准液一致，表明应用一阶导数-同步荧光法测定色氨酸是可行的，可以排除酪氨酸、苯丙氨酸的干扰。
Figure 2 Derivative synchronous fluorescence spectroscopy of tryptophan，tyrosine and phenylalanine
, 百拇医药
图2 三种氨基酸一阶导数-同步荧光光谱
2.4 干扰试验 将血红蛋白配成0.25～5.0 g/L、胆红素配制成42.75～342 μmol/L加入到混合血清标本中，然后测定色氨酸含量，结果与原血清测定结果完全一致，表明血红蛋白、胆红素对测定结果无影响。
2.5 线性范围 将色氨酸配制成不同的浓度，然后绘制标准曲线，结果色氨酸浓度在0～400 μmol/L范围内成线性关系，Y＝0.287X±0.096，r＝0.999。
2.6 回收试验 在2份色氨酸含量为70.2 μmol/L、66.5 μmol/L混合血清标本中分别加入浓度为78.4 μmol/L、39.2 μmol/L的色氨酸标准液，然后进行回收试验，结果回收率分别为93.8%、97.2%，平均95.5%。
2.7 重复性试验 两份混合血清标本分别进行批内、批间精密度试验(n＝10)，批内测定结果71.86±1.84(±s) μmol/L，CV2.57%；批间测定结果77.38±2.64(±s) μmol/L，CV3.42%。
, 百拇医药
2.8 参考范围 应用本法测定30例健康成年人，年龄19～54岁；其中男19例，女11例，血清色氨酸测定结果为73.98±7.26(±s) μmol/L，男、女之间无统计学差异(P>0.05)，结果与国内外报道基本一致。
3 讨论
在所有天然氨基酸中，仅有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸自身产生荧光，由于三者在普通荧光光谱中的激发和发射光谱互相重叠，测定中相互干扰。
自70年代Lioyd首次提出同步荧光光谱技术以来，由于其具有谱带窄化、灵敏度高、选择性好并可将在普通的激发和发射光谱上相互重叠的荧光峰分开等特点，近年来得到了广泛应用。 菊[5]等实验观察了细胞色素C同步荧光光谱，发现在Δλ＝80 nm时为色氨酸残基的荧光峰。我们研究了在不同Δλ条件下色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸同步荧光光谱，结果表明随着Δλ的增加，酪氨酸、苯丙氨酸对色氨酸的干扰逐渐减小，当Δλ＝90 nm时，干扰最小，但仍不能完全排除。
, http://www.100md.com
导数技术在解决荧光测定中的背景干扰和谱带重叠问题上收到了良好的效果，已被证明是一种提高荧光分析选择性的有效手段[4]。我们利用导数、同步荧光技术的特点，将两者结合起来用于色氨酸的测定，结果表明，当Δλ选择为90 nm(即激发波长与荧光波长相差90 nm)、在285 nm时，色氨酸导数-同步荧光光谱的导数值不受酪氨酸、苯丙氨酸干扰，因此建立了色氨酸导数同步荧光测定法，实验证明，本法操作简便、快速、结果准确可靠，是血清色氨酸常规测定的较为理想方法。
*镇江医学院94届本科实习生
参考文献
1 Ono J.Tryptophan and hepatic.Gastroenterology，1978，74：196
2 Hutson D G.A longitudinal study of tryptophan involvement in hepatic coma.Am J Surg，1979，139：235
, 百拇医药
3 Bloxam D L.Error in the determination of tryptophan by the method of Denckla and Dewey. Anal Bio Chem，1974，60：160
4 吴惠毅，沈来龙，陈晋，等.导数同步荧光法测定尿液中肾上腺素和去甲肾上腺素.分析化学，1997，25(4)：496
5
菊，曲晓刚，陆天虹，等.用同步荧光光谱法定量测定细胞色素C.分析化学，1994，22(12)：1238
(1998-10-29收稿，1999-05-06修回), http://www.100md.com
单位：连云港市第一人民医院中心实验室，江苏连云港222002
关键词：导数-同步荧光；色氨酸
临床检验杂志990402 摘要 为了排除酪氨酸、苯丙氨酸对荧光法测定色氨酸的干扰，建立了色氨酸导数-同步荧光测定法。结果表明，当Δλ为90 nm时，色氨酸的一阶导数-同步荧光峰在285 nm时不受酪氨酸、苯丙氨酸的干扰；色氨酸浓度在0～400 μmol/L与导数-同步荧光值成线性，Y＝0.287X±0.096，r＝0.999；批内、批间CV分别为2.57%、3.42%；回收率93.8%～97.2%；血红蛋白含量在0.25～5.0 g/L、胆红素含量在42.75～342 μmol/L对测定无干扰；30例健康成年人血清色氨酸测定结果为73.98±7.26(
±s) μmol/L；本法操作简单、快速，测定结果准确，是血清色氨酸常规测定较为理想的方法。, 百拇医药
Determination of tryptophan in serum by derivative synchronous fluorescence method
YANG Jin,WU Huiyi,LIANG Wenxue,et al
.(The First Hospital of Lianyungang,Jiangsu Lianyungang 222002)
Abstract To remove the interference from tyrosine and phenylalanine in the determination of tryptophan by fluorescence method,The author established the determination method of free tryptophan in serum by derivative synchronous fluorescence.The results showed,when Δλ was 90 nm,the peak of derivative synchronous fluorescence wasn't disturbed by tyrosine and phenylalanine at λ285 nm. The linear rang is 0 to 400 μmol/L(Y＝0.287X±0.096,r＝0.999).The intra-and inter-assay CV are 2.57% and 3.42%，respectively.The analytical recovery is 93.8% to 97.2%. The determination wasn't disturbed by hemoglobin(0.25～5.0 g/L)and bilirubin(42.75～342 μmol/L).Reference value of the tryptophan in serum from 30 healthy individuals were 73.98±7.26(
±s). The method is simple,rapid,and precise,so it is a reasonable method for detection of tryptophan in serum., 百拇医药
Key words derivative synchronous fluorescence; tryptophan
色氨酸(tryptophan)是一种人体必需氨基酸，血清中色氨酸含量与肝性脑病[1，2]及神经介质5-羟色胺密切相关，测定其含量可为肝性脑病的临床诊断、治疗和发生精神症状的机理研究提供依据。目前，色氨酸的测定方法通常采用荧光法[3]、高效液相色谱法(HPLC)和氨基酸分析仪法。前者操作复杂，时间长，干扰因素多；而后两者虽然快速，准确，但仪器价格昂贵，很难在临床普及应用。本文利用色氨酸的天然荧光特性以及导数-同步荧光光谱的特点[4]，建立了血清中色氨酸导数同步荧光光谱定量测定方法，消除了酪氨酸、苯丙氨酸的干扰，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 仪器 Hitachi F-4010型荧光分光光度计；DL-6000B冷冻离心机。
, 百拇医药
1.2 试剂 1.0 mol/L色氨酸标准贮存液：称取色氨酸(Sigma产品)10.21 mg，加蒸馏水溶解并稀释至50 ml；50 μmol/L色氨酸标准应用液：用蒸馏水将标准贮存液稀释20倍；0.1 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液；无水乙醇(AR，上海试剂总厂)；所有实验用水均为石英亚沸蒸馏水。
1.3 方法 取3支试管，标明测定、标准、空白，分别加入血清、标准应用液、水各25 μl，每管加无水乙醇1 ml，振荡混匀30 s静置5 min，3000 r/min离心12 min，取上清液0.5 ml，加1 ml pH 7.4的磷酸盐缓冲液，混匀静置10 min后进行荧光测定。仪器测定参数，Ex、Em带宽均为5 nm，灵敏度置HIGH PM GAIN，Both Scan(同步扫描)，扫描速度600 nm/min；Δλ＝90 nm，Ex波长从220～350 nm进行同步荧光扫描，将其同步荧光光谱转换成一阶导数光谱，读取285 nm波长处的导数值。
, 百拇医药 2 实验结果
2.1 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的荧光光谱 我们观察了浓度分别为100 μmol/L的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸标准液的激发、发射光谱，结果表明，它们的激发和发射光谱相互重叠，存在干扰，无法直接测定色氨酸，与国内外文献报道一致。
2.2 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的同步荧光光谱 观察这三种氨基酸在不同Δλ条件下同步荧光光谱，结果表明，随着Δλ的增加，苯丙氨酸、酪氨酸对色氨酸的干扰逐渐减小，当Δλ为90 nm时，酪氨酸、苯丙氨酸对色氨酸的干扰最小，见图1，但仍不能完全排除干扰。
Figure 1 1.Synchronous fluorescence spectroscopy of tryptophan，tyrosine and phenylalanine
, 百拇医药
图1 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸同步荧光光谱
2.3 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸导数-同步荧光光谱 分别绘制三种氨基酸一阶导数-同步荧光光谱，见图2A。从图2A可以看出，Δλ为90 nm时，在285 nm波长时，色氨酸的导数-同步荧光光谱不受酪氨酸、苯丙氨酸干扰。为了进一步验证酪氨酸、苯丙氨酸的同步荧光-导数光谱对色氨酸不产生干扰，我们观察了浓度分别为100 μmol/L色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸三种氨基酸混合标准液与单一的100 μmol/L色氨酸标准液一阶导数-同步荧光光谱，见图2B，从图中可以看出，三种氨基酸混合液一阶导数-同步荧光光谱与色氨酸的一阶导数-同步荧光光谱在285 nm时完全重合，同时我们观察了血清标本的一阶导数-同步荧光光谱，结果与色氨酸标准液一致，表明应用一阶导数-同步荧光法测定色氨酸是可行的，可以排除酪氨酸、苯丙氨酸的干扰。
Figure 2 Derivative synchronous fluorescence spectroscopy of tryptophan，tyrosine and phenylalanine
, 百拇医药
图2 三种氨基酸一阶导数-同步荧光光谱
2.4 干扰试验 将血红蛋白配成0.25～5.0 g/L、胆红素配制成42.75～342 μmol/L加入到混合血清标本中，然后测定色氨酸含量，结果与原血清测定结果完全一致，表明血红蛋白、胆红素对测定结果无影响。
2.5 线性范围 将色氨酸配制成不同的浓度，然后绘制标准曲线，结果色氨酸浓度在0～400 μmol/L范围内成线性关系，Y＝0.287X±0.096，r＝0.999。
2.6 回收试验 在2份色氨酸含量为70.2 μmol/L、66.5 μmol/L混合血清标本中分别加入浓度为78.4 μmol/L、39.2 μmol/L的色氨酸标准液，然后进行回收试验，结果回收率分别为93.8%、97.2%，平均95.5%。
2.7 重复性试验 两份混合血清标本分别进行批内、批间精密度试验(n＝10)，批内测定结果71.86±1.84(
±s) μmol/L，CV2.57%；批间测定结果77.38±2.64(±s) μmol/L，CV3.42%。, 百拇医药
2.8 参考范围 应用本法测定30例健康成年人，年龄19～54岁；其中男19例，女11例，血清色氨酸测定结果为73.98±7.26(
±s) μmol/L，男、女之间无统计学差异(P>0.05)，结果与国内外报道基本一致。3 讨论
在所有天然氨基酸中，仅有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸自身产生荧光，由于三者在普通荧光光谱中的激发和发射光谱互相重叠，测定中相互干扰。
自70年代Lioyd首次提出同步荧光光谱技术以来，由于其具有谱带窄化、灵敏度高、选择性好并可将在普通的激发和发射光谱上相互重叠的荧光峰分开等特点，近年来得到了广泛应用。 菊[5]等实验观察了细胞色素C同步荧光光谱，发现在Δλ＝80 nm时为色氨酸残基的荧光峰。我们研究了在不同Δλ条件下色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸同步荧光光谱，结果表明随着Δλ的增加，酪氨酸、苯丙氨酸对色氨酸的干扰逐渐减小，当Δλ＝90 nm时，干扰最小，但仍不能完全排除。
, http://www.100md.com
导数技术在解决荧光测定中的背景干扰和谱带重叠问题上收到了良好的效果，已被证明是一种提高荧光分析选择性的有效手段[4]。我们利用导数、同步荧光技术的特点，将两者结合起来用于色氨酸的测定，结果表明，当Δλ选择为90 nm(即激发波长与荧光波长相差90 nm)、在285 nm时，色氨酸导数-同步荧光光谱的导数值不受酪氨酸、苯丙氨酸干扰，因此建立了色氨酸导数同步荧光测定法，实验证明，本法操作简便、快速、结果准确可靠，是血清色氨酸常规测定的较为理想方法。
*镇江医学院94届本科实习生
参考文献
1 Ono J.Tryptophan and hepatic.Gastroenterology，1978，74：196
2 Hutson D G.A longitudinal study of tryptophan involvement in hepatic coma.Am J Surg，1979，139：235
, 百拇医药
3 Bloxam D L.Error in the determination of tryptophan by the method of Denckla and Dewey. Anal Bio Chem，1974，60：160
4 吴惠毅，沈来龙，陈晋，等.导数同步荧光法测定尿液中肾上腺素和去甲肾上腺素.分析化学，1997，25(4)：496
5
菊，曲晓刚，陆天虹，等.用同步荧光光谱法定量测定细胞色素C.分析化学，1994，22(12)：1238(1998-10-29收稿，1999-05-06修回), http://www.100md.com