几种常见花生病毒血清学关系的研究
作者：刘文斌 陈坤荣 张宗义 许泽永
单位：刘文斌 湖北大学生命科学学院，武汉 430062；陈坤荣 张宗义 许泽永 中国农业科学院油料作物研究所，武汉 430062
关键词：花生病毒；免疫双扩散；酶联免疫反应；血清学关系
中国病毒学990413 Serological Relationships of Several Kinds of Peanut Viruses
Liu Wenbin1 Chen Kunrong2 Zhang Zhongyi2 Xu Zeyong2
1 (College of Life Science, Hubei University, Wuhan 430062)
, 百拇医药
2 (Institute of Oil plant Research of Chinese Agriculture Academy, Wuhan 430062)
Abstract The serological relationships of several kinds of peanut viruses were analyzed by using techniques of agar diffusion test and ELISA. The results show that, among four main kinds of viruses that infect peanut (PSV, PStV,TS and CMV),PSV, TS and PStV have strong infecting abilities, but CMV has poor infecting ability. TAV,TS-13, Mi and TS-7 have good relationship with each other, but CA is different from them.
, 百拇医药
Key words Peanut virus, Agar diffusion, ELISA, Serological relationship
花生是世界上重要的经济作物，中国也是个花生消费大国，但是常有8种重要的花生病毒危害，包括花生斑驳病毒(PMV)、花生条纹病毒(PStV)、花生丛簇病毒(GRV)、花生丛矮病毒(PCV)、蕃茄斑萎病毒(TSWV)、花生芽枯病毒(BNN)、花生矮化病毒(PSV)和黄瓜花叶病毒(CMV)。70年代以来在全国各地多次爆发花生病毒病，并引起大面积减产，经济损失巨大，因而花生病毒的检测和转基因花生抗毒株的选育变得尤为重要[1～3]。本研究应用免疫双扩散和酶联免疫法(ELISA)对几种花生病毒的血清学关系进行了研究。
1 材料与方法
1.1 病毒 受试毒株为PSV-Mi、PSV-1、TS-7、TS-13、CMV-CA、PStV-广州、PStV-唐山、TAV。
, http://www.100md.com
1.2 抗血清 PStV-AS、PSV-AS、PSV-Mi抗血清为实验室贮存品。
1.3 接种 以摩擦接种方法将各毒株接种于花生叶面。
1.4 免疫双扩散 参照文献[4]、[5]、[6]的方法。用于球状病毒的试剂： 0.5%PBS缓冲液(pH7.4)，0.01% NaN3，1%琼脂糖；用于线状病毒的试剂： 0.5%PBS缓冲液(pH7.4)，0.01%NaN3，1%琼脂糖，0.5%SDS。
1.5 酶联免疫反应 参照文献[4]、[5]、[6]的方法进行ELISA实验。所用试剂如下，包被缓冲液： Na2CO3 1.5 g,NaHCO3 2.93 g,NaN3 0.2 g,无离子水1 000 mL,pH9.6;冲洗缓冲液： NaCl 8 g,NaH2PO4 0.2 g，Na2HPO4 2.9 g,吐温-20 0.5 mL，无离子水1 000 mL,pH7.4；底物配制缓冲液： 24%柠檬酸，26% Na2HPO4，临用时用无离子水稀释一倍；邻苯二胺底物液：邻苯二胺40 mg,H2O2(30%)0.15 mL,稀释了100倍的底物配制缓冲液1 000 mL。
, http://www.100md.com
2 结果与讨论
2.1 接种情况观察 接种2周后，PSV-1、CMV-CA出现较轻症状，TS-7、TS-13出现中度感染，其余极不明显或未表现。4周后，前述病株病症明显恶化，PSV-广州，PSV-唐山，TAV较重感染。
2.2 免疫双扩散 如图1所示进行，中心孔为PSV-Mi抗血清，周围孔抗原顺序为A：CK，TS-7，CA，TS-13，Mi,TAV;B:CK,TS-13,TAV,CA,Mi,TS-7,得到如下结果： TAV与TS-13沉淀线很好融合，同样Mi与TS-7，TAV与Mi也是如此，这可初步推测此四种病毒之间有很好的血清学关系；CA与TS-13、TS-7均产生模糊或清晰的刺突，且CA与Mi无融合，表明CA与它们的血清学关系差。
图1 免疫双扩散结果
, http://www.100md.com
Fig.1 Detecting result of immunodifusion
2.3 酶联免疫反应 本实验所用抗原分别为PSV-Mi,PSV-1、CMV-CA、TS-7、PSV-广州、PSV-唐山(依次简缩为Mi,PSV-1、CA、TS-7、PSV-G、PSV-T)，且每抗原为1，1/5，1/25三个稀释浓度；抗血清为PSV-AS和PStV-AS。结果如表1、表2所示，Mi与PSV-AS出现强阳性反应，OD值平均在1.2以上，证明Mi为PSV系列病毒，且病株内含大量病毒，对于PSV-1，同样如此。CA稍弱，OD值平均在0.8左右，说明该病毒在病株内极少，即对花生感染能力稍差，证明它和PSV系列病毒血清学关系较差。D组中PSV-G、PSV-T均出现了极强阳性反应，如前可知，该两抗原为花生条纹病毒系列。B组中TS-7为极弱阳性反应，OD值平均在0.5左右，高于其它阴性反应平均OD值(0.3)，因植株为新接种病株，距采毒日期仅为7d，远少于其发病低限(14 d)，考虑到这些因素，当属阳性反应。表格中C7的OD值为0.82，但C8、C9分别为0.35、0.28，在阴性水平，且C7亦未表现阳性颜色反应，故为操作误差，从前述免疫扩散实验结果看，CMV-CA与PSV-Mi有一定血清学关系，PSV与PStV属截然不同株系，因而可证明CA与PStV-AS无阳性反应。
, 百拇医药
表1 酶联免疫反应次序
Table 1 ELISA experiment order 组别
Groups
抗 原
Antigens
1
2
3
4
5
6
7
, 百拇医药 8
9
10
A
Mi
-1
-2
PSV-1
-1
-2
CA
-1
-2
CK
, http://www.100md.com
B
TS-7
-1
-2
PSV-G
-1
-2
PSV-T
-1
-2
CK
C
Mi
, 百拇医药 -1
-2
PSV-1
-1
-2
CA
-1
-2
CK
D
TS-7
-1
-2
PSV-G
, 百拇医药
-1
-2
PSV-T
-1
-2
CK
-1 and -2 indicate that dilutions are 5-1 and 5-2; PSV-AS antiserum is added to groups A and B; PStV-AS antiserum is added to groups C and D.表2 酶联免疫反应OD值
Table 2 OD value of ELISA 组别
, 百拇医药
Groups
OD 值
OD values
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A
, http://www.100md.com
1.30
1.14
1.18
1.10
1.17
1.24
, 百拇医药
1.01
+
0.73
+
0.71
0.30
B
0.54
0.40
0.29
0.31
0.27
0.28
, http://www.100md.com
0.38
0.34
0.31
0.28
C
0.59
0.28
0.29
0.53
0.53
0.34
0.80
0.35
, http://www.100md.com
0.28
0.24
D
0.47
0.30
0.35
1.33
1.44
1.33
, http://www.100md.com
1.21
1.40
1.30
0.34indicates that positive reaction is very strong;and + indicate that positive reactions become faint gradually.
由此可知，侵染花生的四大病毒PSV、PStV、TS、CMV系列中CMV侵染能力稍差，PSV、TS、PStV均具有较强的侵染能力，且PSV与TS系列血清学关系较密切。 参考文献
, http://www.100md.com
1 许泽永. 国内外花生病毒病研究概述. 中国油料，1994，16(1)：82～85
2 张宗义，陈坤荣，许泽永等. 花生普通花叶病毒病发生和流行规律研究. 中国油料作物学报，1998，20(1)： 78～82
3 董炜博，严敦余. 花生条纹病毒病的研究进展. 中国油料，1997，19(1)： 85～89
4 姚华健，于嘉林，金元等. 甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因的表达及其表达产物抗血清的制备. 病毒学报，1994，10(1)：39～43
5 周常勇，赵学源，蒋元晖. 温州密柑萎缩病毒提纯与抗血清制作及其应用. 病毒学报，1996，12(1)：55～61
6 赵永芳. 生物化学技术原理及其应用. 武汉： 武汉大学出版社，1988：365～420
*收稿日期：1998-07-10，修回日期：1998-10-16, 百拇医药
单位：刘文斌 湖北大学生命科学学院，武汉 430062；陈坤荣 张宗义 许泽永 中国农业科学院油料作物研究所，武汉 430062
关键词：花生病毒；免疫双扩散；酶联免疫反应；血清学关系
中国病毒学990413 Serological Relationships of Several Kinds of Peanut Viruses
Liu Wenbin1 Chen Kunrong2 Zhang Zhongyi2 Xu Zeyong2
1 (College of Life Science, Hubei University, Wuhan 430062)
, 百拇医药
2 (Institute of Oil plant Research of Chinese Agriculture Academy, Wuhan 430062)
Abstract The serological relationships of several kinds of peanut viruses were analyzed by using techniques of agar diffusion test and ELISA. The results show that, among four main kinds of viruses that infect peanut (PSV, PStV,TS and CMV),PSV, TS and PStV have strong infecting abilities, but CMV has poor infecting ability. TAV,TS-13, Mi and TS-7 have good relationship with each other, but CA is different from them.
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Key words Peanut virus, Agar diffusion, ELISA, Serological relationship
花生是世界上重要的经济作物，中国也是个花生消费大国，但是常有8种重要的花生病毒危害，包括花生斑驳病毒(PMV)、花生条纹病毒(PStV)、花生丛簇病毒(GRV)、花生丛矮病毒(PCV)、蕃茄斑萎病毒(TSWV)、花生芽枯病毒(BNN)、花生矮化病毒(PSV)和黄瓜花叶病毒(CMV)。70年代以来在全国各地多次爆发花生病毒病，并引起大面积减产，经济损失巨大，因而花生病毒的检测和转基因花生抗毒株的选育变得尤为重要[1～3]。本研究应用免疫双扩散和酶联免疫法(ELISA)对几种花生病毒的血清学关系进行了研究。
1 材料与方法
1.1 病毒 受试毒株为PSV-Mi、PSV-1、TS-7、TS-13、CMV-CA、PStV-广州、PStV-唐山、TAV。
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1.2 抗血清 PStV-AS、PSV-AS、PSV-Mi抗血清为实验室贮存品。
1.3 接种 以摩擦接种方法将各毒株接种于花生叶面。
1.4 免疫双扩散 参照文献[4]、[5]、[6]的方法。用于球状病毒的试剂： 0.5%PBS缓冲液(pH7.4)，0.01% NaN3，1%琼脂糖；用于线状病毒的试剂： 0.5%PBS缓冲液(pH7.4)，0.01%NaN3，1%琼脂糖，0.5%SDS。
1.5 酶联免疫反应 参照文献[4]、[5]、[6]的方法进行ELISA实验。所用试剂如下，包被缓冲液： Na2CO3 1.5 g,NaHCO3 2.93 g,NaN3 0.2 g,无离子水1 000 mL,pH9.6;冲洗缓冲液： NaCl 8 g,NaH2PO4 0.2 g，Na2HPO4 2.9 g,吐温-20 0.5 mL，无离子水1 000 mL,pH7.4；底物配制缓冲液： 24%柠檬酸，26% Na2HPO4，临用时用无离子水稀释一倍；邻苯二胺底物液：邻苯二胺40 mg,H2O2(30%)0.15 mL,稀释了100倍的底物配制缓冲液1 000 mL。
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2 结果与讨论
2.1 接种情况观察 接种2周后，PSV-1、CMV-CA出现较轻症状，TS-7、TS-13出现中度感染，其余极不明显或未表现。4周后，前述病株病症明显恶化，PSV-广州，PSV-唐山，TAV较重感染。
2.2 免疫双扩散 如图1所示进行，中心孔为PSV-Mi抗血清，周围孔抗原顺序为A：CK，TS-7，CA，TS-13，Mi,TAV;B:CK,TS-13,TAV,CA,Mi,TS-7,得到如下结果： TAV与TS-13沉淀线很好融合，同样Mi与TS-7，TAV与Mi也是如此，这可初步推测此四种病毒之间有很好的血清学关系；CA与TS-13、TS-7均产生模糊或清晰的刺突，且CA与Mi无融合，表明CA与它们的血清学关系差。
图1 免疫双扩散结果
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Fig.1 Detecting result of immunodifusion
2.3 酶联免疫反应 本实验所用抗原分别为PSV-Mi,PSV-1、CMV-CA、TS-7、PSV-广州、PSV-唐山(依次简缩为Mi,PSV-1、CA、TS-7、PSV-G、PSV-T)，且每抗原为1，1/5，1/25三个稀释浓度；抗血清为PSV-AS和PStV-AS。结果如表1、表2所示，Mi与PSV-AS出现强阳性反应，OD值平均在1.2以上，证明Mi为PSV系列病毒，且病株内含大量病毒，对于PSV-1，同样如此。CA稍弱，OD值平均在0.8左右，说明该病毒在病株内极少，即对花生感染能力稍差，证明它和PSV系列病毒血清学关系较差。D组中PSV-G、PSV-T均出现了极强阳性反应，如前可知，该两抗原为花生条纹病毒系列。B组中TS-7为极弱阳性反应，OD值平均在0.5左右，高于其它阴性反应平均OD值(0.3)，因植株为新接种病株，距采毒日期仅为7d，远少于其发病低限(14 d)，考虑到这些因素，当属阳性反应。表格中C7的OD值为0.82，但C8、C9分别为0.35、0.28，在阴性水平，且C7亦未表现阳性颜色反应，故为操作误差，从前述免疫扩散实验结果看，CMV-CA与PSV-Mi有一定血清学关系，PSV与PStV属截然不同株系，因而可证明CA与PStV-AS无阳性反应。
, 百拇医药
表1 酶联免疫反应次序
Table 1 ELISA experiment order 组别
Groups
抗 原
Antigens
1
2
3
4
5
6
7
, 百拇医药 8
9
10
A
Mi
-1
-2
PSV-1
-1
-2
CA
-1
-2
CK
, http://www.100md.com
B
TS-7
-1
-2
PSV-G
-1
-2
PSV-T
-1
-2
CK
C
Mi
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-2
PSV-1
-1
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CA
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CK
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TS-7
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-2
PSV-G
, 百拇医药
-1
-2
PSV-T
-1
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CK
-1 and -2 indicate that dilutions are 5-1 and 5-2; PSV-AS antiserum is added to groups A and B; PStV-AS antiserum is added to groups C and D.表2 酶联免疫反应OD值
Table 2 OD value of ELISA 组别
, 百拇医药
Groups
OD 值
OD values
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A
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1.30
1.14
1.18
1.10
1.17
1.24
, 百拇医药
1.01
+
0.73
+
0.71
0.30
B
0.54
0.40
0.29
0.31
0.27
0.28
, http://www.100md.com
0.38
0.34
0.31
0.28
C
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0.28
0.29
0.53
0.53
0.34
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0.35
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0.28
0.24
D
0.47
0.30
0.35
1.33
1.44
1.33
, http://www.100md.com
1.21
1.40
1.30
0.34
indicates that positive reaction is very strong;and + indicate that positive reactions become faint gradually.由此可知，侵染花生的四大病毒PSV、PStV、TS、CMV系列中CMV侵染能力稍差，PSV、TS、PStV均具有较强的侵染能力，且PSV与TS系列血清学关系较密切。 参考文献
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1 许泽永. 国内外花生病毒病研究概述. 中国油料，1994，16(1)：82～85
2 张宗义，陈坤荣，许泽永等. 花生普通花叶病毒病发生和流行规律研究. 中国油料作物学报，1998，20(1)： 78～82
3 董炜博，严敦余. 花生条纹病毒病的研究进展. 中国油料，1997，19(1)： 85～89
4 姚华健，于嘉林，金元等. 甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因的表达及其表达产物抗血清的制备. 病毒学报，1994，10(1)：39～43
5 周常勇，赵学源，蒋元晖. 温州密柑萎缩病毒提纯与抗血清制作及其应用. 病毒学报，1996，12(1)：55～61
6 赵永芳. 生物化学技术原理及其应用. 武汉： 武汉大学出版社，1988：365～420
*收稿日期：1998-07-10，修回日期：1998-10-16, 百拇医药