一种新的重组腺病毒的构建及其对人肿瘤细胞的影响
作者：苏 霏 齐兵 齐义鹏
单位：武汉大学病毒学研究所，武汉 430072
关键词：肿瘤基因治疗；腺病毒；E1A基因；E1B基因
中国病毒学990403 摘 要 腺病毒E1A基因诱导细胞凋亡，E1B19K基因及E1B55K基因抑制细胞凋亡，前者被克隆到腺病毒转移载体pCA13的HCMV IE启动子下游，构建成转移载体pCAE1A。采用lipofectin法将pCAE1A和含腺病毒基因组(E1区、E3区缺失)的质粒pBHG11共转染293细胞，7～10 d后得到重组病毒v5Ad4。用v5Ad4感染人肺腺癌细胞系A549，结果表明v5Ad4有明显杀伤和裂解肿瘤细胞功能。在人胚肺正常二倍体细胞中，v5Ad4没有表现出可见的细胞毒效应。
Construction of a New Kind of Recombinant
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Adenovirus and Its effect on Tumor Cells
Su Fei Qi Bing Qi Yipeng
(Institute of Virology, Wuhan University, Wuhan 430072)
Abstract E1A gene of adenovirus is an apoptosis-inducing gene and E1B gene of adenovirus is an apoptosis-inhibiting gene. The former one was cloned into adenovirus transfer vector pCA13 under the control of HCMV IE1 promoter, which resulted into transfer vector pCAE1A. Plasmid pCAE1A and pBHG11, which includes almost all the adenovirus genome but E1 region and E3 region were deleted, were cotransfected into 293 cell line. After 7-10 days, recombinant virus v5Ad4(E1B-E3-) was obtained. v5Ad4 was used to infect A549 cell line. The results showed that v5Ad4 can kill and lysis tumor cells. In the normal cells, v5Ad4 didn't show visible cytotoxicity effect.
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Key words Gene therapy for tumor, Adenovirus, E1A gene, E1B gene
迄今为止，恶性肿瘤治疗的主要策略仍然是手术、放疗和化疗。然而基于对肿瘤分子生物学的深入研究，近年来癌症的基因治疗作为一种新的治疗手段得到迅速发展。腺病毒(Adenovirus)载体由于基因组结构简单，遗传背景比较清楚，易于改造和操作，而且转染率高，又有较好的靶细胞特异性，因而作为向癌细胞导入外源基因的工具而备受嘱目。
腺病毒属DNA肿瘤病毒，基因组为线状双链DNA，长约36 kb。位于腺病毒5型194～358 bp处的Ψ因子为cis-元件，是包装病毒DNA必需的信号，它的缺失造成病毒基因组不能被包装，但不影响病毒基因组在被感染细胞中复制的可能性[1]。早期基因E1A、E1B是复制必须基因，它们的缺失造成流产感染，但在293细胞(整合有腺病毒的E1区)中可以复制并形成病毒粒子。E3为病毒复制非必须区，常被缺失以提高腺病毒载体的克隆容量。目前，腺病毒主要被用作外源基因如抑癌基因Rb、p53,细胞毒性基因HSVtk[2]，各种免疫刺激因子IL-2[3]、IL-4[4]、IL-6[5]、GM-CSF[5，6]、TNF、核酶等的瞬时表达载体。最近研究发现，缺失E1B55K基因的腺病毒能在p53基因突变的肿瘤细胞中选择性繁殖并裂解杀死肿瘤细胞，而在正常细胞中只能发生流产感染[7]。为选择性杀死肿瘤细胞的腺病毒基因治疗载体的研究开辟了一条全新的途径。
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研究表明，腺病毒E1A一方面具有转化功能，另一方面它的表达会延长抑癌基因p53的半衰期等，提高p53的表达量，引发p53依赖或不依赖的癌细胞凋亡[8]，并显著降低多种人恶性肿瘤细胞系的致瘤性[9]。近来研究证明，E1A的表达能下调在卵巢癌、乳腺癌、肺癌等常伴有的原癌基因HER-2/neu的过量表达，并抑制肿瘤及其转移，增加肿瘤对化疗的敏感性[10]。E1B的两个表达产物19 k和55 k蛋白均可抑制p53依赖的凋亡，前者还可抑制p53非依赖的凋亡，并具有与bcl-2等同的凋亡抑制功效[11]。E1B55k-19k+的重组腺病毒12型引起p53表达量增高，半衰期延长，但不能引起人肺腺癌细胞系A549的凋亡[8]。因而我们假设E1B的完全缺失可以使E1A的凋亡诱导效应不被抵消反而更显著，构建了仅缺失E1B和E3区的重组腺病毒v5Ad4，其中E1A的表达被增强，就其在癌细胞表达E1A，研究其对正常细胞与肿瘤细胞的影响。
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1 材料与方法
1.1 菌株、细胞、病毒与质粒 E.coli.TG1,DH5α为本室保存。人胚肾293细胞购自武汉大学典型培养物保藏中心，DMEM培养基加10%小牛血清常规培养。人肺腺癌细胞系A549购自上海细胞所细胞库，RPMI 1640培养基加10%小牛血清常规培养。正常人胚肺细胞由湖北医科大学董长垣教授惠赠，DMEM培养基加10%马血清常规培养。野生型腺病毒5型由南京军事医学科学研究所邓小昭教授惠赠。含E1A基因的质粒pCMVE1A由美国Pxutgers大学Elleen White博士惠赠。质粒pBHG11 [E1-E3-Ψ-。腺病毒5型基因组E1区的核苷酸序列188～1 339 bp(0.5～3.7 mu)被缺失，一个氨卞抗性基因(Apr)和一个细菌的复制起始位点(Ori)取代了这区域，同时缺失了病毒DNA必需的包装信号顺式元件Ψ因子，因而在单独感染293细胞时没有感染性。另外，此质粒中腺病毒5型E3区亦被缺失]、pCA13[E1-E3-Ψ+。含有腺病毒5型基因组22～5 790 bp(0～16.1 mu)核苷酸序列，但其中包含一个342～3 523 bp(1.0～9.8 mu)的序列缺失。缺失区内是一个用于外源片段插入的置于HCMV IE启动子(-299～+72 bp)控制下的多克隆位点，并跟随有SV40 poly(A)信号]，购自加拿大Microbix Biosystoms INC。
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1.2 酶和化学试剂 lipofectin、T4连接酶、IPTG、X-gal购自GIBCO公司。限制性内切酶、马血清、RPMI 1640培养基、DMEM培养基购自华美生物制品公司。一般化学试剂均为国产分析纯。
1.3 质粒DNA的提取、酶切、DNA片段的回收与连接 按分子克隆的常规程序，稍作改动。
1.4 重组DNA的转化和阳性重组子的筛选 连接产物CaCl2法转化大肠杆菌TG1。通过限制性酶切消化鉴定插入片段大小来筛选阳性重组体。
1.5 共转染 通过lipofectin介导，将含有E1A表达盒的转移载体pCAE1A和pBHG11共转染293细胞。具体操作为：将lipofectin 17 μL与pCAE1A 20 μg及pBHG11 20 μg分别用200 μL无血清无双抗(青霉素、链霉素)DMEM培养基稀释，室温静置15～30 min后，将lipofectin逐滴加入稀释好的质粒中并轻轻混合均匀。室温静置30～45 min使lipofectin包裹DNA。补加1.3 mL DMEM培养基，使转染混合液体积能均匀覆盖细胞层，混匀。将此lipofectin-DNA转染混合液缓慢加入经无血清无双抗DMEM培养基轻洗过的293细胞。温浴6～8 h，弃去旧培养基，换为含5%马血清的DMEM培养基继续培养2～4 d，观察细胞致病效应(CPE)。7 d后，取上清再次感染293细胞以扩增重组病毒。
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1.6 重组腺病毒和野生型腺病毒的感染 分别取收获的上清3 mL加入A549细胞及正常人胚肺细胞中，37 ℃吸附1 h后，弃去旧培养基，加入新鲜的培养基，继续培养。
1.7 电镜观察 取pBHG11和pCAE1A共转染7 d后的293细胞上清，2 000 r/min离心，取上清制样。用2% pH6.2的磷钨酸溶液以滴染法对样品进行负染，220 000倍电镜观察。
2 结果与讨论
2.1 重组转移载体pCAE1A的构建与鉴定 将pCMVE1A中含E1A基因编码区的EcoRI/BamHI 1.3 kb片段切下插入pCA13相应的多克隆位点，得到重组转移载体pCAE1A。pCAE1A经EcoRI/BamHI限制性酶切消化，释放出一条1.3 kb的小带，载体片段与pCA13/EcoRI和pCA13/BamHI单酶切所呈带形相等，证明是所需阳性重组体。酶切鉴定结果如图1所示；转移载体pCAE1A的构建过程如图3所示。
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图1 重组转移载体pCAE1A的酶切鉴定
Fig.1 Restricted enzyme degistion of recombinant
transfer vector pCAE1A
b and c: one 1.3 kb small fragment was released.
图2 重组病毒v5Ad4的电镜观察
Fig.2 Electron microscopy of the recombinant virus v5Ad4
lcosahedron virus particle (arrow indicated) can be seen in supernatant of 293 cells cotransfected with pCAE1A and pBHG11 by the 220 000×electron microscope.
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图3 重组转移载体pCAE1A及重组病毒v5Ad4的构建
Fig.3 Construction of recombinant transfer vector pCAE1A and recombinant virus v5Ad4
E: EcoRI, B:BamHI, 1.3 kb open reading frame of E1A gene digested from pCMVE1A was inserted into EcoRI/BamHI site of vector pCA13, which resulted into recombinant transfer vector pCAE1A. 293 cells were cotransfected with pCAE1A and pBHG11, homologous recombination between pCAE1A and pBHG11 in 293 cells resulted into recombinant virus v5Ad4.
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2.2 重组病毒v5Ad4的构建与病毒颗粒的包装 质粒pBHG11由于腺病毒5型基因组E1区的核苷酸序列188～1 339 bp(0.5～3.7 mu)缺失，一个氨卞抗性基因(Apr)和一个细菌的复制起始位点(Ori)取代了该区域，即同时缺失了病毒DNA必需的包装信号顺式元件Ψ因子，因而在单独感染293细胞时没有感染性。另外，此质粒中腺病毒5型E3区亦缺失。pBHG11必须与左臂带有腺病毒包装信号序列的穿梭载体共转染，才能产生有感染性的重组载体。质粒pCAE1A含有腺病毒5型基因组22～5 790 bp(0～16.1 mu)核苷酸序列，但其中包含一个342～3 523 bp(1.0～9.8 mu)的序列缺失；E1区内有一个置于HCMV IE启动子(-299～+72 bp)控制下的多克隆位点中的E1A表达盒，并有SV40 poly(A)信号。pBHG11-Apr-ori-的左臂为腺病毒5型基因组0～188 bp，其右臂为腺病毒5型基因组1 337～27 865 bp，pCAE1A中E1A表达盒左臂为腺病毒5型基因组22～342 bp，右臂为腺病毒5型基因组3 523～5 790 bp。两者的左右臂具有足够的同源区域，可以在共转染的293细胞内发生同源重组。由于pBHG11无Ψ因子，pCAE1A虽然有Ψ因子，但仅有极短的腺病毒5型基因组序列，所以pBHG11不能被包装，pCAE1A不能形成病毒粒子，只有带Ψ因子和大部分腺病毒5型基因组的重组病毒才可能被包装。重组病毒v5Ad4的构建如图3所示。
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经pCAE1A和pBHG11共转染的293细胞6 d后开始变圆肿胀，部分裂解死亡，有明显CPE症状。透射电镜观察，在共转染7 d后的293细胞上清可见球状(二十面体)病毒粒子(图2)，命名为v5Ad4。
2.3 重组病毒v5Ad4对人肿瘤细胞的影响 v5Ad4感染人肺腺癌细胞系A549，19 h后80%细胞变圆悬浮，有明显CPE症状，5%裂解，3 d后，100%细胞变圆悬浮，60%裂解(图4A)。而经等量v5Ad4感染的正常人胚肺细胞中，3 d至两周，存活细胞比率一直保持100%(图4B)，表现了对v5Ad4诱导的细胞裂解的高度抗性。
图4A 重组病毒v5Ad4对人肿瘤细胞A549的感染
Fig.4A The infection of recombinant virus v5Ad4 in human tumor cell line A549
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(a) A549 cell without the infection of v5Ad4 or wide type adenovirus (200×) (b) A549 cell with the infection of v5Ad4 (400×) (c) A549 cell with the infection of wt-Ad (400×)
图4B 重组病毒v5Ad4对人胚肺正常二倍体细胞的感染
Fig.4B The infection of recombinant virus v5Ad4 in human normal cells
(a) HL cell without the infection of v5Ad4 or wt-Ad (400×) (b) HL cell with the infection of v5Ad4 (400×) (c) HL cell with the infection of wt-Ad (400×)
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野生型腺病毒感染人肺腺癌细胞系A549，36 h后2%细胞变圆；3 d后40%细胞变圆悬浮；7 d后，90%细胞变圆悬浮，并可见细胞裂解(图4A)。经等量野生型腺病毒感染的正常人胚肺细胞中，3 d后60%细胞变圆并聚集成团，4 d后解聚，圆形细胞悬浮在培养基中(图4B)。
以上实验说明，作为对照的野生型腺病毒对人肺腺癌细胞和正常人胚肺细胞均有一定毒害作用，我们构建的重组腺病毒v5Ad4对人肺腺癌细胞的存活率有明显影响，而对正常人胚肺细胞几乎毫无影响(图4B)。这可能是因为E1A的引入及超强表达，诱发了肿瘤细胞对凋亡的强烈敏感性。我们认为缺失了E1B 19k与E1B 55k的重组缺损型腺病毒v5Ad4可能对人类恶性肿瘤的治疗有重要意义，并且可以作为有价值的肿瘤基因治疗载体。
*国家自然科学基金高技术新探索项目资助课题(39880031)
**联系与负责作者
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参考文献
1 Andrew J Bett, Wael Haddara, Ludvik Prevec et al. An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early region 1 and 3. Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:8802～8806
2 Torao Tanaka, Falnihikikanai Satoein Okabe, Yoco Y et al. Adenovirus-midiated prodrug gene therapy for carcinoembryonic antigen-producing human gastric carcinoma cells in vitro. Canncer Reserch, 1996,56(6):1341～1345
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3 Leimig T,Brenner M, Ramsey J et al. High-efficiency transduction of freshly isolated human tumor cells using adenoviral interleukin-2 vectors. Hum Gene Ther, 1996,7(10):1233～1239
4 Addison C L, Gauldie J, Muller W J et al. An adenoviral vector expressing interleukin-4 modulates tumorigenicity and induces regression in a murine breast cancer model. Int J Oncol, 1995,7(6):1253～1260
5 Foley R, Ellis R, Walker I et al. Intramarrow cytokine gene transfer by adenoviral vectors in dogs. Hum Gene Ther, 1997,8(2):545～553
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6 Lee Choo Taek, Wu Shan, Ciernik I F et al. Genetic immunotherapy of established tumors with adenovirus-murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Hum Gene Ther, 1997,8(2):187～193
7 James R Bischoff, David H Kim, Angelica Williams et al. An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells. Science, 1996,274:375～378
8 Roger J A Grand, Darerca Owen, Susan M Rookes et al. Control of p53 expression by adenovirus 12 early region 1A and early region 1B 54k proteins. Virology, 1996,218:23～24
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9 Martin Duque P, Sanchez-Prieto R, Quintanilla M et al. Antitumoral effect of E1B delective adenoviruses in human malignant cells. Gene Therapy, 1998,5:286～287
10 陆浩钧.E1A对HER-2/neu过度表达肿瘤治疗作用的研究进展.国外医学*肿瘤学分册，1997，24(6)：321～322
11 Chang JY, Xia W, Shao R et al. The tumor suppression activity of E1A in HER-2/neu-overexpressing breast cancer. Oncogene, 1997, 14(5):561～568
*收稿日期：1998-07-02，修回日期：1998-11-27, 百拇医药
单位：武汉大学病毒学研究所，武汉 430072
关键词：肿瘤基因治疗；腺病毒；E1A基因；E1B基因
中国病毒学990403 摘 要 腺病毒E1A基因诱导细胞凋亡，E1B19K基因及E1B55K基因抑制细胞凋亡，前者被克隆到腺病毒转移载体pCA13的HCMV IE启动子下游，构建成转移载体pCAE1A。采用lipofectin法将pCAE1A和含腺病毒基因组(E1区、E3区缺失)的质粒pBHG11共转染293细胞，7～10 d后得到重组病毒v5Ad4。用v5Ad4感染人肺腺癌细胞系A549，结果表明v5Ad4有明显杀伤和裂解肿瘤细胞功能。在人胚肺正常二倍体细胞中，v5Ad4没有表现出可见的细胞毒效应。
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Adenovirus and Its effect on Tumor Cells
Su Fei Qi Bing Qi Yipeng
(Institute of Virology, Wuhan University, Wuhan 430072)
Abstract E1A gene of adenovirus is an apoptosis-inducing gene and E1B gene of adenovirus is an apoptosis-inhibiting gene. The former one was cloned into adenovirus transfer vector pCA13 under the control of HCMV IE1 promoter, which resulted into transfer vector pCAE1A. Plasmid pCAE1A and pBHG11, which includes almost all the adenovirus genome but E1 region and E3 region were deleted, were cotransfected into 293 cell line. After 7-10 days, recombinant virus v5Ad4(E1B-E3-) was obtained. v5Ad4 was used to infect A549 cell line. The results showed that v5Ad4 can kill and lysis tumor cells. In the normal cells, v5Ad4 didn't show visible cytotoxicity effect.
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Key words Gene therapy for tumor, Adenovirus, E1A gene, E1B gene
迄今为止，恶性肿瘤治疗的主要策略仍然是手术、放疗和化疗。然而基于对肿瘤分子生物学的深入研究，近年来癌症的基因治疗作为一种新的治疗手段得到迅速发展。腺病毒(Adenovirus)载体由于基因组结构简单，遗传背景比较清楚，易于改造和操作，而且转染率高，又有较好的靶细胞特异性，因而作为向癌细胞导入外源基因的工具而备受嘱目。
腺病毒属DNA肿瘤病毒，基因组为线状双链DNA，长约36 kb。位于腺病毒5型194～358 bp处的Ψ因子为cis-元件，是包装病毒DNA必需的信号，它的缺失造成病毒基因组不能被包装，但不影响病毒基因组在被感染细胞中复制的可能性[1]。早期基因E1A、E1B是复制必须基因，它们的缺失造成流产感染，但在293细胞(整合有腺病毒的E1区)中可以复制并形成病毒粒子。E3为病毒复制非必须区，常被缺失以提高腺病毒载体的克隆容量。目前，腺病毒主要被用作外源基因如抑癌基因Rb、p53,细胞毒性基因HSVtk[2]，各种免疫刺激因子IL-2[3]、IL-4[4]、IL-6[5]、GM-CSF[5，6]、TNF、核酶等的瞬时表达载体。最近研究发现，缺失E1B55K基因的腺病毒能在p53基因突变的肿瘤细胞中选择性繁殖并裂解杀死肿瘤细胞，而在正常细胞中只能发生流产感染[7]。为选择性杀死肿瘤细胞的腺病毒基因治疗载体的研究开辟了一条全新的途径。
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研究表明，腺病毒E1A一方面具有转化功能，另一方面它的表达会延长抑癌基因p53的半衰期等，提高p53的表达量，引发p53依赖或不依赖的癌细胞凋亡[8]，并显著降低多种人恶性肿瘤细胞系的致瘤性[9]。近来研究证明，E1A的表达能下调在卵巢癌、乳腺癌、肺癌等常伴有的原癌基因HER-2/neu的过量表达，并抑制肿瘤及其转移，增加肿瘤对化疗的敏感性[10]。E1B的两个表达产物19 k和55 k蛋白均可抑制p53依赖的凋亡，前者还可抑制p53非依赖的凋亡，并具有与bcl-2等同的凋亡抑制功效[11]。E1B55k-19k+的重组腺病毒12型引起p53表达量增高，半衰期延长，但不能引起人肺腺癌细胞系A549的凋亡[8]。因而我们假设E1B的完全缺失可以使E1A的凋亡诱导效应不被抵消反而更显著，构建了仅缺失E1B和E3区的重组腺病毒v5Ad4，其中E1A的表达被增强，就其在癌细胞表达E1A，研究其对正常细胞与肿瘤细胞的影响。
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1 材料与方法
1.1 菌株、细胞、病毒与质粒 E.coli.TG1,DH5α为本室保存。人胚肾293细胞购自武汉大学典型培养物保藏中心，DMEM培养基加10%小牛血清常规培养。人肺腺癌细胞系A549购自上海细胞所细胞库，RPMI 1640培养基加10%小牛血清常规培养。正常人胚肺细胞由湖北医科大学董长垣教授惠赠，DMEM培养基加10%马血清常规培养。野生型腺病毒5型由南京军事医学科学研究所邓小昭教授惠赠。含E1A基因的质粒pCMVE1A由美国Pxutgers大学Elleen White博士惠赠。质粒pBHG11 [E1-E3-Ψ-。腺病毒5型基因组E1区的核苷酸序列188～1 339 bp(0.5～3.7 mu)被缺失，一个氨卞抗性基因(Apr)和一个细菌的复制起始位点(Ori)取代了这区域，同时缺失了病毒DNA必需的包装信号顺式元件Ψ因子，因而在单独感染293细胞时没有感染性。另外，此质粒中腺病毒5型E3区亦被缺失]、pCA13[E1-E3-Ψ+。含有腺病毒5型基因组22～5 790 bp(0～16.1 mu)核苷酸序列，但其中包含一个342～3 523 bp(1.0～9.8 mu)的序列缺失。缺失区内是一个用于外源片段插入的置于HCMV IE启动子(-299～+72 bp)控制下的多克隆位点，并跟随有SV40 poly(A)信号]，购自加拿大Microbix Biosystoms INC。
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1.2 酶和化学试剂 lipofectin、T4连接酶、IPTG、X-gal购自GIBCO公司。限制性内切酶、马血清、RPMI 1640培养基、DMEM培养基购自华美生物制品公司。一般化学试剂均为国产分析纯。
1.3 质粒DNA的提取、酶切、DNA片段的回收与连接 按分子克隆的常规程序，稍作改动。
1.4 重组DNA的转化和阳性重组子的筛选 连接产物CaCl2法转化大肠杆菌TG1。通过限制性酶切消化鉴定插入片段大小来筛选阳性重组体。
1.5 共转染 通过lipofectin介导，将含有E1A表达盒的转移载体pCAE1A和pBHG11共转染293细胞。具体操作为：将lipofectin 17 μL与pCAE1A 20 μg及pBHG11 20 μg分别用200 μL无血清无双抗(青霉素、链霉素)DMEM培养基稀释，室温静置15～30 min后，将lipofectin逐滴加入稀释好的质粒中并轻轻混合均匀。室温静置30～45 min使lipofectin包裹DNA。补加1.3 mL DMEM培养基，使转染混合液体积能均匀覆盖细胞层，混匀。将此lipofectin-DNA转染混合液缓慢加入经无血清无双抗DMEM培养基轻洗过的293细胞。温浴6～8 h，弃去旧培养基，换为含5%马血清的DMEM培养基继续培养2～4 d，观察细胞致病效应(CPE)。7 d后，取上清再次感染293细胞以扩增重组病毒。
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1.7 电镜观察 取pBHG11和pCAE1A共转染7 d后的293细胞上清，2 000 r/min离心，取上清制样。用2% pH6.2的磷钨酸溶液以滴染法对样品进行负染，220 000倍电镜观察。
2 结果与讨论
2.1 重组转移载体pCAE1A的构建与鉴定 将pCMVE1A中含E1A基因编码区的EcoRI/BamHI 1.3 kb片段切下插入pCA13相应的多克隆位点，得到重组转移载体pCAE1A。pCAE1A经EcoRI/BamHI限制性酶切消化，释放出一条1.3 kb的小带，载体片段与pCA13/EcoRI和pCA13/BamHI单酶切所呈带形相等，证明是所需阳性重组体。酶切鉴定结果如图1所示；转移载体pCAE1A的构建过程如图3所示。
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图1 重组转移载体pCAE1A的酶切鉴定
Fig.1 Restricted enzyme degistion of recombinant
transfer vector pCAE1A
b and c: one 1.3 kb small fragment was released.
图2 重组病毒v5Ad4的电镜观察
Fig.2 Electron microscopy of the recombinant virus v5Ad4
lcosahedron virus particle (arrow indicated) can be seen in supernatant of 293 cells cotransfected with pCAE1A and pBHG11 by the 220 000×electron microscope.
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图3 重组转移载体pCAE1A及重组病毒v5Ad4的构建
Fig.3 Construction of recombinant transfer vector pCAE1A and recombinant virus v5Ad4
E: EcoRI, B:BamHI, 1.3 kb open reading frame of E1A gene digested from pCMVE1A was inserted into EcoRI/BamHI site of vector pCA13, which resulted into recombinant transfer vector pCAE1A. 293 cells were cotransfected with pCAE1A and pBHG11, homologous recombination between pCAE1A and pBHG11 in 293 cells resulted into recombinant virus v5Ad4.
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2.2 重组病毒v5Ad4的构建与病毒颗粒的包装 质粒pBHG11由于腺病毒5型基因组E1区的核苷酸序列188～1 339 bp(0.5～3.7 mu)缺失，一个氨卞抗性基因(Apr)和一个细菌的复制起始位点(Ori)取代了该区域，即同时缺失了病毒DNA必需的包装信号顺式元件Ψ因子，因而在单独感染293细胞时没有感染性。另外，此质粒中腺病毒5型E3区亦缺失。pBHG11必须与左臂带有腺病毒包装信号序列的穿梭载体共转染，才能产生有感染性的重组载体。质粒pCAE1A含有腺病毒5型基因组22～5 790 bp(0～16.1 mu)核苷酸序列，但其中包含一个342～3 523 bp(1.0～9.8 mu)的序列缺失；E1区内有一个置于HCMV IE启动子(-299～+72 bp)控制下的多克隆位点中的E1A表达盒，并有SV40 poly(A)信号。pBHG11-Apr-ori-的左臂为腺病毒5型基因组0～188 bp，其右臂为腺病毒5型基因组1 337～27 865 bp，pCAE1A中E1A表达盒左臂为腺病毒5型基因组22～342 bp，右臂为腺病毒5型基因组3 523～5 790 bp。两者的左右臂具有足够的同源区域，可以在共转染的293细胞内发生同源重组。由于pBHG11无Ψ因子，pCAE1A虽然有Ψ因子，但仅有极短的腺病毒5型基因组序列，所以pBHG11不能被包装，pCAE1A不能形成病毒粒子，只有带Ψ因子和大部分腺病毒5型基因组的重组病毒才可能被包装。重组病毒v5Ad4的构建如图3所示。
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经pCAE1A和pBHG11共转染的293细胞6 d后开始变圆肿胀，部分裂解死亡，有明显CPE症状。透射电镜观察，在共转染7 d后的293细胞上清可见球状(二十面体)病毒粒子(图2)，命名为v5Ad4。
2.3 重组病毒v5Ad4对人肿瘤细胞的影响 v5Ad4感染人肺腺癌细胞系A549，19 h后80%细胞变圆悬浮，有明显CPE症状，5%裂解，3 d后，100%细胞变圆悬浮，60%裂解(图4A)。而经等量v5Ad4感染的正常人胚肺细胞中，3 d至两周，存活细胞比率一直保持100%(图4B)，表现了对v5Ad4诱导的细胞裂解的高度抗性。
图4A 重组病毒v5Ad4对人肿瘤细胞A549的感染
Fig.4A The infection of recombinant virus v5Ad4 in human tumor cell line A549
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(a) A549 cell without the infection of v5Ad4 or wide type adenovirus (200×) (b) A549 cell with the infection of v5Ad4 (400×) (c) A549 cell with the infection of wt-Ad (400×)
图4B 重组病毒v5Ad4对人胚肺正常二倍体细胞的感染
Fig.4B The infection of recombinant virus v5Ad4 in human normal cells
(a) HL cell without the infection of v5Ad4 or wt-Ad (400×) (b) HL cell with the infection of v5Ad4 (400×) (c) HL cell with the infection of wt-Ad (400×)
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野生型腺病毒感染人肺腺癌细胞系A549，36 h后2%细胞变圆；3 d后40%细胞变圆悬浮；7 d后，90%细胞变圆悬浮，并可见细胞裂解(图4A)。经等量野生型腺病毒感染的正常人胚肺细胞中，3 d后60%细胞变圆并聚集成团，4 d后解聚，圆形细胞悬浮在培养基中(图4B)。
以上实验说明，作为对照的野生型腺病毒对人肺腺癌细胞和正常人胚肺细胞均有一定毒害作用，我们构建的重组腺病毒v5Ad4对人肺腺癌细胞的存活率有明显影响，而对正常人胚肺细胞几乎毫无影响(图4B)。这可能是因为E1A的引入及超强表达，诱发了肿瘤细胞对凋亡的强烈敏感性。我们认为缺失了E1B 19k与E1B 55k的重组缺损型腺病毒v5Ad4可能对人类恶性肿瘤的治疗有重要意义，并且可以作为有价值的肿瘤基因治疗载体。
*国家自然科学基金高技术新探索项目资助课题(39880031)
**联系与负责作者
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*收稿日期：1998-07-02，修回日期：1998-11-27, 百拇医药