河南省人免疫缺陷病毒流行株的基因亚型分析
作者：韩卫国 苏玲 王哲 邵一鸣 王春俭 李宏
单位：韩卫国、王哲、王春俭、李宏 450003 郑州，河南省卫生防疫站；；苏玲、邵一鸣 卫生部艾滋病预防与控制中心
关键词：人获得性免疫缺陷病毒Ⅰ型；基因亚型；变异
中华传染病杂志990410 【摘要】 目的 研究流行于河南省献血员中的人免疫缺陷病毒(HIV)外膜蛋白(env)基因亚型。方法 提取HIV感染者外周血单个核白细胞(PBMC)的DNA，经套式-聚合酶链反应(Nested-PCR)扩增env基因片断，对C2-V3区350～450核苷酸顺序进行测定和分析。结果 20份样品的env基因序列与B亚型最为接近，基因离散率为8.34%，与其它国际亚型的基因离散率在20%以上；与流行于云南的B亚型毒株基因离散率为4.18%；样品间的基因离散率为3.4%。结论 流行于河南省献血员中的HIV属B亚型，并与云南的流行株密切相关；其在河南的流行时间在3～6年间。
, 百拇医药
Genomic subtypes of HIV-1 in Henan province
HAN Weiguo, SU Ling, WANG Zhe, et al.
Henan Health and Anti-Epidemic Center, Zhengzhou 450003
【Abstract】 Objective To identify HIV-1 envelope sequence subtypes in infected blood donors from Henan province. Methods DNA extracted from PBMC were amplified in the presence of env fragment by nested-PCR. The C2-V3 region was sequenced and a phylogenetic tree was constructed. Results The overall env gene divergence is 8.34% between samples with HIV-1 B subtype, and 4.18% with reference strains of Yunnan origin. The sample gene divergence with other subtypes A, C, D, E is over 23%. The innergroup gene divergence of samples is 3.4%. The globally predominant GPGQ sequence at the tip of V3 motif is found in 11 strains (55%), typical European GPGR sequence were found in 7 strains (35%). Two strains contain a GPGK sequence. Conclusion These findings suggest the epidemic of subtype B of HIV-1 in Henan province and it is closely related to those identified in Yunnan province.
, 百拇医药
【Key words】 HIV-1 Genomic subtype Variability
根据人免疫缺陷病毒(HIV-1)基因组中变异性最大的膜蛋白基因(env)的核酸和其编码的氨基酸序列的同源性，目前已确定了由A-I，O至少10种HIV亚型，具有一定的地区性分布特点[1-3]。
自1995年起，河南省部分地区发现了一定数量的HIV感染的献血员，但对其所感染的HIV种类和来源均不清楚。为此，我们于1998年1～3月在部分地区采集了30例献血员的血样，对其中的20份血样进行了HIV亚型分析，现报告如下。
材料与方法
一、病例选择
30例献血员为1996～1997年间发现并经确证的HIV感染者，均无吸毒史，分别来自河南省三个地区。
, http://www.100md.com
二、样品收集和处理
每例采集静脉血5ml，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，常规方法提取细胞DNA，溶于TE液，置4℃备用。
三、膜蛋白基因扩增
按套式-聚合酶链反应(Nested-PCR)法[4]，设计合成多对PCR引物(表1)，以env-L/env-i为外侧扩增引物，进行第1次PCR反应，条件为：95℃ 1分钟变性；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 120秒，30个循环；72℃ 10分钟，取十分之一PCR产物，以env-C/env-k为内侧引物，按上述条件进行第2次PCR，扩增env基因C2-V3区。
表1 PCR和测序引物 引物
用途
, http://www.100md.com 序 列
在env基因
的定位
env-L
PCR
TGGGGTACCTGTGTGGAAA
192
env-i
PCR
TATCCCTGCCTAACTCTATT
2056
env-k
, 百拇医药
PCR
GCCCATAGTGCTTCCTGCTGCTCC
1536
env-C
PCR
CCAATTCCCATACATTATTG
607
env-D3
Seq
CTGTTAAATGGCAGTCTAGCAG
782
env-f2
, http://www.100md.com
Seq
GTGGAGGGGAATTTTTCTACTG
1109
四、PCR产物的纯化
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，与marker对照判定无误后，切下特异扩增带，用Qiagen公司的Qiaex试剂，按说明提纯扩增的HIV-1 DNA片断，回收得的DNA溶于10mmol/L Tris-HCl(pH8.7)，经琼脂糖凝胶电泳与分子量标准比较估算核酸浓度。
五、核苷酸序列测定
分别使用env-D3和env-f2(见表1)为测序引物，以提纯的PCR产物为模板，用ABI公司的荧光标记末端中止物循环测序试剂盒，在PE公司9600型PCR仪上进行测序反应，模板用量约1μg，引物用量为6pmol。反应产物经提纯后用自动DNA序列分析仪进行序列测定。
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六、序列分析
测得的序列用SeqEd和DNA软件进行编辑校正，每个样品C2-V3区核苷酸的最终序列根据两个同向测序引物所测结果重叠校正后确定。序列的排列、比较和同源性分析，使用威斯康星GCG公司软件完成，具体包括：(1) 用Piluep程序对样品及国际标准序列的排列和比较；(2) 用Pretty程序计算一组序列的公享序列(consensus sequence)；(3) 用distance计算一组序列之间的基因离散率；(4) 用groutree程序做系统树(phylogenetic tree)。结果
对20份可用于序列测定的HIV-1 env基因目的片段PCR产物，经引物env-D3与env-f2进行序列分析，测定envC2-V3及其相邻区的450个碱基长的核苷酸序列，对该段DNA对应的氨基酸序列进行多种分析，用GCG软件包Pileup和Pretty程序计算其共享序列，得到同源序列，见图1。将样品的序列分别与国际A-E亚型的共享序列进行比较，并用distance程序计算相互间的基因离散率，发现样品相互间的平均离散率为3.44%，与国际B亚型共享序列间相距较近(7.8%)，与云南流行株距离最近，在8.34%左右，而与A、C、D、E亚型共享序列间的离散率均在23%以上(离A亚型23.88%，离C亚型27.37%，离D亚型24.65%，离E亚型25.03%)。进一步的系统树分析也显示，该批样品与YN-B和B聚集在一起，而与其它国际亚型距离很远，见图2。
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HEN-为样本，A，B，C，D，E-CON为国际代表株，HEN-BCON为河南样本B亚型代表株，96YN-BCON为云南B代表株，Consensus为共享序列
图1 河南省HIV-1毒株C2-V3区的氨基酸序列及其共享序列
图2 河南省HIV-1B亚型毒株的系统树分析
讨论
通过对20例HIV-1阳性感染者PBMC中HIV-1 env-C2-V3及其邻近区序列进行分析后说明河南省存在B亚型的HIV-1毒株的流行。从本研究中HIV-1基因离散率的结果来看，样品间的基因离散率为3.44%，其外膜蛋白的V3环内变化也很小，根据HIV-1毒株基因平均每年以0.5%～1%[5，6]的速度变异速度计算，可以认为B亚型毒株在河南省内的流行时间大约在3～6年之间。
, 百拇医药
从与国际其它地区及我国云南流行毒株比较结果看，河南B亚型毒株与属泰国B亚型的我国云南德宏B亚型毒株间的离散率非常小(4.18%)，在系统树分析中亦聚集在一起，表明这些毒株之间有非常密切的关系。对毒株的env中最重要的中和抗体决定簇所在的V3环多肽序列进行的分析也支持这一结论，典型的泰国基因型B亚型HIV-1毒株其V3环顶端部四肽主要是GPGQ，在20份样品中，我们发现有11个毒株(55%)具有这一四肽序列特征，而带有GPGR这一典型欧美B亚型V3环顶端四肽序列特征的毒株只有7例(35%)，且其精氨酸(R)由多见于泰国B亚型的CGA而不是多见于欧美B亚型的AGA编码；邵一鸣等[4，7]在云南得宏瑞丽HIV1株中发现，HIV1毒株V3环顶端四肽序列可随时间推移而发生漂移，由GPGR这一典型国际B亚型HIV-1序列，向GPGQ这一泰国基因型B型HIV-1转变的明显趋向。他们在1990年和1993年所发现的GPGQ型和GPGR型所占比例分别为20%与80%，33%与57%；在我们的样品中，泰国GPGQ所占比例超过了国际GPGR型(55%vs35%)，与邵一鸣等[4]的预测相一致。另外还发现2株(10%)其V3环顶端四肽序列特征为GPGK，该特征也曾在云南发现过，其生物学意义还不清楚。
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参考文献
1 Riccheit M, Buc H. Reverse transcriptases and genomic variability: the accuracy of DNA replication is enzyme specific and sequence dependent. EMBO J, 1990, 9:1583-1593.
2 Myers G. HIV between past and future. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994,10:1317-1324.
3 Janons W, Heyndrickx J, Fransen K, et al. Genetic analysis of ENV subtype G and H in Central Africa. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994,10:877-879.
, 百拇医药
4 邵一鸣，赵全壁，王斌，等.我国云南得宏地区HIV感染者HIV毒株膜蛋白基因的序列测定和分析.病毒学报，1994，4：291-299.
5 Murphy E, Korber B, Georges-Courbot MC, et al. Diversity of V3 region sequence of human immunodeficiency viruses type 1 from the Central African Republic. AIDS Res Hum Retroviruses, 1993, 9:997-1006.
6 Weniger BG. The molecular epidemiology of HIV in Asia. AIDS, 1994,8(Suppl 2):1-14.
7 邵一鸣，苏玲，陈钧，等.1995年云南瑞丽HIV毒株的基因变异和分析.病毒学报，1996，12：9-17.
(收稿：1998-11-25 修回：1999-06-30), 百拇医药
单位：韩卫国、王哲、王春俭、李宏 450003 郑州，河南省卫生防疫站；；苏玲、邵一鸣 卫生部艾滋病预防与控制中心
关键词：人获得性免疫缺陷病毒Ⅰ型；基因亚型；变异
中华传染病杂志990410 【摘要】 目的 研究流行于河南省献血员中的人免疫缺陷病毒(HIV)外膜蛋白(env)基因亚型。方法 提取HIV感染者外周血单个核白细胞(PBMC)的DNA，经套式-聚合酶链反应(Nested-PCR)扩增env基因片断，对C2-V3区350～450核苷酸顺序进行测定和分析。结果 20份样品的env基因序列与B亚型最为接近，基因离散率为8.34%，与其它国际亚型的基因离散率在20%以上；与流行于云南的B亚型毒株基因离散率为4.18%；样品间的基因离散率为3.4%。结论 流行于河南省献血员中的HIV属B亚型，并与云南的流行株密切相关；其在河南的流行时间在3～6年间。
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Genomic subtypes of HIV-1 in Henan province
HAN Weiguo, SU Ling, WANG Zhe, et al.
Henan Health and Anti-Epidemic Center, Zhengzhou 450003
【Abstract】 Objective To identify HIV-1 envelope sequence subtypes in infected blood donors from Henan province. Methods DNA extracted from PBMC were amplified in the presence of env fragment by nested-PCR. The C2-V3 region was sequenced and a phylogenetic tree was constructed. Results The overall env gene divergence is 8.34% between samples with HIV-1 B subtype, and 4.18% with reference strains of Yunnan origin. The sample gene divergence with other subtypes A, C, D, E is over 23%. The innergroup gene divergence of samples is 3.4%. The globally predominant GPGQ sequence at the tip of V3 motif is found in 11 strains (55%), typical European GPGR sequence were found in 7 strains (35%). Two strains contain a GPGK sequence. Conclusion These findings suggest the epidemic of subtype B of HIV-1 in Henan province and it is closely related to those identified in Yunnan province.
, 百拇医药
【Key words】 HIV-1 Genomic subtype Variability
根据人免疫缺陷病毒(HIV-1)基因组中变异性最大的膜蛋白基因(env)的核酸和其编码的氨基酸序列的同源性，目前已确定了由A-I，O至少10种HIV亚型，具有一定的地区性分布特点[1-3]。
自1995年起，河南省部分地区发现了一定数量的HIV感染的献血员，但对其所感染的HIV种类和来源均不清楚。为此，我们于1998年1～3月在部分地区采集了30例献血员的血样，对其中的20份血样进行了HIV亚型分析，现报告如下。
材料与方法
一、病例选择
30例献血员为1996～1997年间发现并经确证的HIV感染者，均无吸毒史，分别来自河南省三个地区。
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二、样品收集和处理
每例采集静脉血5ml，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，常规方法提取细胞DNA，溶于TE液，置4℃备用。
三、膜蛋白基因扩增
按套式-聚合酶链反应(Nested-PCR)法[4]，设计合成多对PCR引物(表1)，以env-L/env-i为外侧扩增引物，进行第1次PCR反应，条件为：95℃ 1分钟变性；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 120秒，30个循环；72℃ 10分钟，取十分之一PCR产物，以env-C/env-k为内侧引物，按上述条件进行第2次PCR，扩增env基因C2-V3区。
表1 PCR和测序引物 引物
用途
, http://www.100md.com 序 列
在env基因
的定位
env-L
PCR
TGGGGTACCTGTGTGGAAA
192
env-i
PCR
TATCCCTGCCTAACTCTATT
2056
env-k
, 百拇医药
PCR
GCCCATAGTGCTTCCTGCTGCTCC
1536
env-C
PCR
CCAATTCCCATACATTATTG
607
env-D3
Seq
CTGTTAAATGGCAGTCTAGCAG
782
env-f2
, http://www.100md.com
Seq
GTGGAGGGGAATTTTTCTACTG
1109
四、PCR产物的纯化
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，与marker对照判定无误后，切下特异扩增带，用Qiagen公司的Qiaex试剂，按说明提纯扩增的HIV-1 DNA片断，回收得的DNA溶于10mmol/L Tris-HCl(pH8.7)，经琼脂糖凝胶电泳与分子量标准比较估算核酸浓度。
五、核苷酸序列测定
分别使用env-D3和env-f2(见表1)为测序引物，以提纯的PCR产物为模板，用ABI公司的荧光标记末端中止物循环测序试剂盒，在PE公司9600型PCR仪上进行测序反应，模板用量约1μg，引物用量为6pmol。反应产物经提纯后用自动DNA序列分析仪进行序列测定。
, http://www.100md.com
六、序列分析
测得的序列用SeqEd和DNA软件进行编辑校正，每个样品C2-V3区核苷酸的最终序列根据两个同向测序引物所测结果重叠校正后确定。序列的排列、比较和同源性分析，使用威斯康星GCG公司软件完成，具体包括：(1) 用Piluep程序对样品及国际标准序列的排列和比较；(2) 用Pretty程序计算一组序列的公享序列(consensus sequence)；(3) 用distance计算一组序列之间的基因离散率；(4) 用groutree程序做系统树(phylogenetic tree)。结果
对20份可用于序列测定的HIV-1 env基因目的片段PCR产物，经引物env-D3与env-f2进行序列分析，测定envC2-V3及其相邻区的450个碱基长的核苷酸序列，对该段DNA对应的氨基酸序列进行多种分析，用GCG软件包Pileup和Pretty程序计算其共享序列，得到同源序列，见图1。将样品的序列分别与国际A-E亚型的共享序列进行比较，并用distance程序计算相互间的基因离散率，发现样品相互间的平均离散率为3.44%，与国际B亚型共享序列间相距较近(7.8%)，与云南流行株距离最近，在8.34%左右，而与A、C、D、E亚型共享序列间的离散率均在23%以上(离A亚型23.88%，离C亚型27.37%，离D亚型24.65%，离E亚型25.03%)。进一步的系统树分析也显示，该批样品与YN-B和B聚集在一起，而与其它国际亚型距离很远，见图2。
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HEN-为样本，A，B，C，D，E-CON为国际代表株，HEN-BCON为河南样本B亚型代表株，96YN-BCON为云南B代表株，Consensus为共享序列
图1 河南省HIV-1毒株C2-V3区的氨基酸序列及其共享序列
图2 河南省HIV-1B亚型毒株的系统树分析
讨论
通过对20例HIV-1阳性感染者PBMC中HIV-1 env-C2-V3及其邻近区序列进行分析后说明河南省存在B亚型的HIV-1毒株的流行。从本研究中HIV-1基因离散率的结果来看，样品间的基因离散率为3.44%，其外膜蛋白的V3环内变化也很小，根据HIV-1毒株基因平均每年以0.5%～1%[5，6]的速度变异速度计算，可以认为B亚型毒株在河南省内的流行时间大约在3～6年之间。
, 百拇医药
从与国际其它地区及我国云南流行毒株比较结果看，河南B亚型毒株与属泰国B亚型的我国云南德宏B亚型毒株间的离散率非常小(4.18%)，在系统树分析中亦聚集在一起，表明这些毒株之间有非常密切的关系。对毒株的env中最重要的中和抗体决定簇所在的V3环多肽序列进行的分析也支持这一结论，典型的泰国基因型B亚型HIV-1毒株其V3环顶端部四肽主要是GPGQ，在20份样品中，我们发现有11个毒株(55%)具有这一四肽序列特征，而带有GPGR这一典型欧美B亚型V3环顶端四肽序列特征的毒株只有7例(35%)，且其精氨酸(R)由多见于泰国B亚型的CGA而不是多见于欧美B亚型的AGA编码；邵一鸣等[4，7]在云南得宏瑞丽HIV1株中发现，HIV1毒株V3环顶端四肽序列可随时间推移而发生漂移，由GPGR这一典型国际B亚型HIV-1序列，向GPGQ这一泰国基因型B型HIV-1转变的明显趋向。他们在1990年和1993年所发现的GPGQ型和GPGR型所占比例分别为20%与80%，33%与57%；在我们的样品中，泰国GPGQ所占比例超过了国际GPGR型(55%vs35%)，与邵一鸣等[4]的预测相一致。另外还发现2株(10%)其V3环顶端四肽序列特征为GPGK，该特征也曾在云南发现过，其生物学意义还不清楚。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Riccheit M, Buc H. Reverse transcriptases and genomic variability: the accuracy of DNA replication is enzyme specific and sequence dependent. EMBO J, 1990, 9:1583-1593.
2 Myers G. HIV between past and future. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994,10:1317-1324.
3 Janons W, Heyndrickx J, Fransen K, et al. Genetic analysis of ENV subtype G and H in Central Africa. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994,10:877-879.
, 百拇医药
4 邵一鸣，赵全壁，王斌，等.我国云南得宏地区HIV感染者HIV毒株膜蛋白基因的序列测定和分析.病毒学报，1994，4：291-299.
5 Murphy E, Korber B, Georges-Courbot MC, et al. Diversity of V3 region sequence of human immunodeficiency viruses type 1 from the Central African Republic. AIDS Res Hum Retroviruses, 1993, 9:997-1006.
6 Weniger BG. The molecular epidemiology of HIV in Asia. AIDS, 1994,8(Suppl 2):1-14.
7 邵一鸣，苏玲，陈钧，等.1995年云南瑞丽HIV毒株的基因变异和分析.病毒学报，1996，12：9-17.
(收稿：1998-11-25 修回：1999-06-30), 百拇医药