变形链球菌牙面粘附唾液受体的筛选和纯化
作者：詹玲 傅明德 刘天佳 岳松龄 周学东
单位：610041 华西医科大学口腔医学院(詹 玲,刘天佳,岳松龄,周学东),基础医学院(傅明德)
关键词：变形链球菌；粘附；粘附唾液受体
华西口腔学杂志990406 摘要 目的:筛选和纯化变形链球菌血清型c(简称变链)的牙面粘附唾液受体。方法:用全唾液包被羟基磷灰石形成实验性获得性膜(SAP),后用1 mol/L NaCl和0.5 mol/L磷酸盐缓冲液分步洗脱,再用Sephadex G75分子筛层析和DEAE-Sephadex A25离子交换层析对SAP组分进行分离纯化,用细菌粘附实验和细菌粘附竞争抑制实验筛选受体,经聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、淀粉酶活性测定等实验鉴定。结果:IgA降解片段、淀粉酶和分子量为13 kD的蛋白是变链的牙面粘附唾液受体,其中IgA降解片段和分子量为13 kD的蛋白为隐匿受体,淀粉酶组份在变链粘附中具双重作用。结论:变性链球菌对牙面的粘附是变链表面粘接素与多种牙面唾液受体作用的结果。
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Separation and Selection of Salivary Adhesion Receptors of Streptococcu s mutans to Tooth Surface
Zhan Ling, Liu Tianjia, Yue Songling, et al
College of Stomatology, West China University of Medical Sciences
Fu Mingde
Department of Biochemistry,West China University of Medical Sciences
Abstract
, 百拇医药
Objective: To select and purify salivary receptors of Streptococcus mutans from experimental salivary acquired pellicle.Methods: Experimental salivary acquired pellicle (SAP) was performed by coating hydroxyapatite (HA) with whole saliva. Then SAP was washed from HA by 1 mol/L NaCl and 0.5 mol/L phosphate buffer sequentially. The proteins were further separated by chromatography of Sephadex G75 and DEAE-Sephadex A25. Receptors of Streptococcus mutans were selected by bacterial adhesion test and competitive inhibition adhesion test. Identification was performed by PAGE, SDS-PAGE,IP-PAGE and detection of amylase activity and inmunodifusion test. Results: IgA degraded fragments, a protein of 13 kD and amylases were the receptors of S.mutans. The first two only promote the adhesion but the amylases can both promote and inhibit S.mutans adhesion.Conclusion: The adhesion of S.mutans to tooth surface is a result of interaction between adhesins of S.mutans and multiple salivary receptors.
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Key words: Streptococcus mutans adhesion adhesion salivary receptor
唾液蛋白对变链球菌(血清型c)(下称变链)在牙面的粘附有重要的调节作用,某些唾液组分吸附于牙面后可与细菌表面粘结素发生特异性结合而促进细菌粘附。因此筛选和纯化变链牙面特异粘附唾液蛋白受体对龋病防治有重要作用[1～3]。本实验旨在分离纯化实验性获得性膜(salivary acquired pellicle,SAP)中的变链粘附唾液受体,并对其理化及生物学性质进行鉴定。
1 材料和方法
1.1 实验性全唾液获得性膜的形成、分步洗脱和盐析
收集一健康成人的非刺激性全唾液300 ml(冰浴保存),20000 g 4℃离心20 min,上清加12 g蛋白质分离纯化用球形羟基磷灰石(HA,北京冶金化工研究所)旋转混匀2 h形成SAP,用1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次备用。用120 ml 1 mol/L NaCl与上述HA旋转30 min2次(6 r/min),离心收集上清液,洗涤3次后,再用120 ml 0.5 mol/L PBS液洗脱2次(条件同前)。分别用硫酸铵沉淀两步洗脱液中所含的全部蛋白组分,沉淀溶解,透析,冻干。
, 百拇医药
1.2 Sephadex G75层析(2.5 cm×75 cm)
将上述冻干组分分别溶解于0.025 mol/L NaCl和0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl中,上样,洗脱,流速20 ml/h,每管收集15 ml, 280 nm测光吸收值,绘制洗脱曲线,分别收集各组分,聚乙二醇20000浓缩透析,4℃保存。
1.3 DEAE-Sephadex A25柱层析(1.5 cm×75 cm)
将Sephadex G75层析组分分别上样,用含0.025 mol/L NaCl的Tris-HCl液洗脱至A280nm=0,再用含0.025～1.2 mol/L NaCl的起始缓冲液(500 ml+500 ml)进行线性梯度洗脱,流速25 ml/h,每管收集5 ml,测ABS280nm值,绘制洗脱曲线,分别收集各组份,透析冻干。
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1.4 PAGE、SDS-PAGE和等电聚焦电泳
PAGE、SDS-PAGE均采用Tris-甘氨酸系统,按LKB211Y多相Ⅱ型电泳系统操作手册进行电泳,浓缩胶、分离胶浓度分别为3.75%,7.5%和3.75%,12.5%。等电聚焦电泳按郭尧君的方法进行[4],pH范围3.5～10。蛋白染色用考马斯亮蓝法,糖蛋白染色用Schiff试剂进行。
1.5 淀粉酶活性测定
用Bernfield的方法进行[5]。
1.6 琼脂糖免疫双向扩散实验
用纯化SAP组分与羊抗人IgA血清(上海生物制品研究所)进行常规免疫双向扩散实验。
1.7 氨基酸组份分析
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将纯化蛋白组分冻干样品在精密电子天平(十万分之一,Starus 200 D型)称重,溶于6 mol/L HCl溶液中,110℃水解24 h,真空干燥,日立835-5D氨基酸自动分析仪检测纯化蛋白氨基酸组成。
1.8 细菌粘附实验
细菌粘附实验 用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TDR)标记临床分离的变链血清型c菌株WD9463 A,洗菌后调菌浓度OD550nm=0.52。用纯化的SAP蛋白包被HA(分别以KCl缓冲液和全唾液作为阴性和阳性对照),洗涤后用人血清白蛋白封闭,加入细菌6 r/min旋转1 h,洗3次,进行液闪测量细菌粘附量[6]。
细菌粘附竞争抑制实验 实验步骤基本同前,但菌液浓度为OD550nm=0.62,实验组和阳性对照组用纯化SAP组份(0.01 mg/ml)包被HA,阴性对照组用KCl缓冲液包被,实验组在加入80 μl菌悬液同时加入20 μl纯化SAP组份,对照组则加入20 μl KCl缓冲液。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 Sephadex G75层析结果
1 mol/L NaCl洗脱的SAP组份(SA)经Sephadex G75层析后可得3个组份(SAG1～SAG3)(图1,A);0.5 mol/L LPB洗脱的SAP组份(SB)可得4个组份(SBG1～SBG4)(图1,B)。SBG4为单一电泳组份未作进一步纯化。
图1 Sephadex A25层析(2.5 cm×75 cm)
A 1.0 mol/L NaCl洗脱蛋白组份 B 0.1 mol/L LPS洗脱SAP组份
, 百拇医药
2.2 DEAE-Sephadex A25层析
经DEAE-Sphadex A25层析后SAG1可得2个组份(SAG1D1、SAG1D2);SAG2、SAG3主要为一组份;SBG1、SBG2、SBG3为3个组份(SBG1D1-SBG1D3、SBG2D1-SBG2D3、SBG3D1-SBG3D3)。起始缓冲液:0.025 mol/L NaCl和0.05 mol/L Tris-HCl pH8.0,梯度洗脱:0.025～1.200 mol/L NaCl和0.05 mol/L Tris-HCl pH8.0,流速为25 ml/h,每管收集5 ml(图2)。
图2 DEAE-Sephadex A25层析洗脱曲线
, 百拇医药
A SAG1, B SAG2, C SAG3, D SBG1, E SBG2, F SBG3
2.3 细菌粘附实验结果
细菌粘附实验结果显示淀粉酶组份SAG2、SAG3促粘附作用最强,其它淀粉酶组份、IgA降解片段SBG1D1、SBG2D1和MW为13 kD的蛋白SBG3D2也可促进细菌粘附(图3)。
图3 变链WD9463A对纯化SAP组份的粘附实验结果
细菌粘附竞争抑制实验显示,淀粉酶组份可不同程度地竞争抑制细菌粘附,其中SAG3、SBG4作用最强,可完全抑制细菌粘附,而IgA降解片段和分子量为13 kD的蛋白则无此作用(图4)。
2.4 各促变链粘附SAP组份理化和生化性能鉴定
, 百拇医药
图4 变链WD9463粘附抑制实验结果
各促变链粘附SAP组份的理化和生物化学性质总结见表1,此8种组份在PAGE中均为单一条带(图5)。
表1 促变链粘附各组份理化和生物化学特性 名称
分子量
(kD)
pI
PAS染色
与sIgA
抗体结合
淀粉酶
活性
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SAG1D1
65.60
6.88
-
-
1.57
SAG2
60.60
6.88
+
-
2.41
SAG3
, 百拇医药
57.00
6.88
+
-
2.34
SBG1D1
23.15
Nt
-
+
-
SBG2D1
23.15
, 百拇医药
Nt
-
+
-
SBG3D1
57.00
6.88
+
-
0.84
SBG3D2
13.00
4.73～4.85
, 百拇医药
-
-
-
SBG4
63.00
6.88
+
-
7.49
图5 SAP纯化组份PAGE图谱
1.SBG3D1 2.SGB4 3.SAG1D1 4.SAG2 5.SAG3
, 百拇医药
6.SGB3D2 7.SGB3D3 8.SGB1D1 9.SGB1D2 10.SGB1D3
11.SGB2D1 12.SGB2D2 13.SGB2D3 14.SAG1D2
2.5 氨基酸组份分析
结果表明,SAG1D1、SBG4含有较多的天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸和甘氨酸;SBG2D3酸性氨基酸天门冬氨酸和谷氨酸含量较高;SBG3D2中天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸和谷氨酸含量较高。
综上结果,可认为SAG1D1为非糖酰化淀粉酶,SAG2、SAG3、SBG3D1、SBG4为糖酰化淀粉酶,SBG1D1,SBG2D1为IgA降解片段,SBG3D2是一种小分子量酸性蛋白。
3 讨 论
, 百拇医药 由于口内唾液获得性膜取材困难、量少,而收集足量SAP标本是分离纯化变链牙面受体的必要条件,本实验用HA作为吸附介质,以全唾液包被HA形成实验组性SAP,这就为研究牙面唾液受体的种类、组成和生理功能提供了充足的材料。不同种类蛋白对HA的吸附机理不同,酸性蛋白主要通过钙桥吸附其上,中性蛋白、碱性蛋白则主要通过静电作用吸附其上[7]。实验采用1 mol/L NaCl洗脱于HA上的中性及碱性蛋白,再用0.5 mol/L PBS洗脱潴留的酸性蛋白。而后Sephadex G75分子筛层析和DEAE-Sephadex A25离子交换层析进一步纯化。结果表明各促变链粘附组份均达PAGE纯,说明分离方法较好。
变链牙面粘附唾液受体是近期防龋研究的热点之一。多数研究都是采用纯化腺体唾液蛋白组份包被HA,通过细菌粘附实验寻找变链的牙面粘附唾液受体。但唾液蛋白对牙面的吸附有高度的选择性,仅有少数唾液蛋白组份可与牙面特异性的结合,而参与获得性膜的形成,因此直接从SAP中分离纯化出与变链粘附有关的唾液蛋白受体是研究变链牙面粘附机理有效而可靠的方法。本实验通过对纯化SAP组份的粘附实验结果表明几种淀粉酶成分和两种IgA降解片段可明显促进变链地方株WD9463A对HA的粘附。这一结果与刘天佳[6]用纯化颌下腺唾液蛋白组份进行粘附实验所得结果相似。实验还发现一种分子量为13 kD的酸性小分子蛋白SBG3D2,其氨基酸组成、等电点及分子量均与Juriaane AC报道的3种对HA有高度亲和力的下颌唾液酸性蛋白相似,它也可促进变链粘附。此3种组份均为实验性全唾液获得性膜的重要组成部分,提示它们是变链在牙面粘附的唾液受体。
, 百拇医药
值得注意的是本实验发现IgA降解片段和分子量为13 kD的蛋白只可促进变链的粘附,却不能竞争抑制其粘附,提示其为变链的牙面隐匿受体。这一粘附具有极高的特异性,作者根据ELISA实验原理设计进行了酶联免疫受体结合实验(ELISA),结果表明当吸附于聚苯乙烯板上时,此3种组份不能与各纯化变链表面蛋白有效结合(结果未报道)。实验结果还表明可促进变链粘附的IgA组份SBG1D1和SBG2D1均是IgA的降解片段,且主要由IgA的J链和H链组成,而其它含有IgA全分子的组份则促粘附作用很弱,提示IgA降解片段的促粘附作用不是通过抗原抗体反应进行的。对唾液中sIgA在变链粘附中的作用不同学者观点不一。近期研究发现sIgA既可促进细菌粘附,又可竞争抑制粘附,经酶解后其抗粘附作用消失,而酶解片段的促粘附能力却高于全分子[8]。本实验结果支持此观点。这提示口内细菌产生的IgA酶的降解作用可减少sIgA的抗粘附作用,并增强其促粘附作用。而几种淀粉酶组份则既可促进细菌粘附,又可竞争抑制细菌粘附,有两种组份在低浓度时即可完全阻止细菌粘附,提示其在细菌粘附中有双重作用,且抗粘附作用更强。
, 百拇医药
本课题为国家自然科学基金资助项目(编号 39270717)
(本文图5见中心插页14)
4 参考文献
1 詹 玲,刘天佳,岳松龄.变形链球菌对牙面粘附机理的研究进展.牙体牙髓牙周病学杂志,1995,5(4):240～242
2 Gibbons RJ. Microbial ecology: Adherent interactions which may affect microbial ecology in the mouth. J Dent Res,1984,63(3):378～385
3 Gibbons RJ. Bacterial adhesion to oral tissue: A model for infectious diseases. J Dent Res,1989,68(5):756～762
, 百拇医药
4 郭尧君.薄层(0.5 mm)聚丙烯酰胺和琼脂糖等电聚焦电泳技术.生物化学生物物理进展,1983,6:50～55
5 Scannapieco, FA, Bergey EJ, Reddy MS, et al. Characte-rization of salivary α-amylase binding to Streptococcus sanguis. Infect Immun,1989,57(9):2853～2863
6 刘天佳.变形链球菌对唾液成分的选择性结合.华西口腔医学杂志,1991,9(2):82～84
7 孙志贤主编.现代生物化学理论与研究技术.北京:军事医学科学出版社,1995:380～381
8 Hajshengallis G, Nikolova E, Russell MW. Inhibition of Streptococcus mutans adherence to saliva coated hydroxyapitite by human secretory IgA(sIgA) antibodies to cell surface protein antigen Ⅰ/Ⅱ:Reversal by IgAⅠ protease cleavage. Infect Immun, 1992,60(12):5057～5064
(1998-10-05收稿,1999-09-28修回), 百拇医药
单位：610041 华西医科大学口腔医学院(詹 玲,刘天佳,岳松龄,周学东),基础医学院(傅明德)
关键词：变形链球菌；粘附；粘附唾液受体
华西口腔学杂志990406 摘要 目的:筛选和纯化变形链球菌血清型c(简称变链)的牙面粘附唾液受体。方法:用全唾液包被羟基磷灰石形成实验性获得性膜(SAP),后用1 mol/L NaCl和0.5 mol/L磷酸盐缓冲液分步洗脱,再用Sephadex G75分子筛层析和DEAE-Sephadex A25离子交换层析对SAP组分进行分离纯化,用细菌粘附实验和细菌粘附竞争抑制实验筛选受体,经聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、淀粉酶活性测定等实验鉴定。结果:IgA降解片段、淀粉酶和分子量为13 kD的蛋白是变链的牙面粘附唾液受体,其中IgA降解片段和分子量为13 kD的蛋白为隐匿受体,淀粉酶组份在变链粘附中具双重作用。结论:变性链球菌对牙面的粘附是变链表面粘接素与多种牙面唾液受体作用的结果。
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Separation and Selection of Salivary Adhesion Receptors of Streptococcu s mutans to Tooth Surface
Zhan Ling, Liu Tianjia, Yue Songling, et al
College of Stomatology, West China University of Medical Sciences
Fu Mingde
Department of Biochemistry,West China University of Medical Sciences
Abstract
, 百拇医药
Objective: To select and purify salivary receptors of Streptococcus mutans from experimental salivary acquired pellicle.Methods: Experimental salivary acquired pellicle (SAP) was performed by coating hydroxyapatite (HA) with whole saliva. Then SAP was washed from HA by 1 mol/L NaCl and 0.5 mol/L phosphate buffer sequentially. The proteins were further separated by chromatography of Sephadex G75 and DEAE-Sephadex A25. Receptors of Streptococcus mutans were selected by bacterial adhesion test and competitive inhibition adhesion test. Identification was performed by PAGE, SDS-PAGE,IP-PAGE and detection of amylase activity and inmunodifusion test. Results: IgA degraded fragments, a protein of 13 kD and amylases were the receptors of S.mutans. The first two only promote the adhesion but the amylases can both promote and inhibit S.mutans adhesion.Conclusion: The adhesion of S.mutans to tooth surface is a result of interaction between adhesins of S.mutans and multiple salivary receptors.
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Key words: Streptococcus mutans adhesion adhesion salivary receptor
唾液蛋白对变链球菌(血清型c)(下称变链)在牙面的粘附有重要的调节作用,某些唾液组分吸附于牙面后可与细菌表面粘结素发生特异性结合而促进细菌粘附。因此筛选和纯化变链牙面特异粘附唾液蛋白受体对龋病防治有重要作用[1～3]。本实验旨在分离纯化实验性获得性膜(salivary acquired pellicle,SAP)中的变链粘附唾液受体,并对其理化及生物学性质进行鉴定。
1 材料和方法
1.1 实验性全唾液获得性膜的形成、分步洗脱和盐析
收集一健康成人的非刺激性全唾液300 ml(冰浴保存),20000 g 4℃离心20 min,上清加12 g蛋白质分离纯化用球形羟基磷灰石(HA,北京冶金化工研究所)旋转混匀2 h形成SAP,用1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次备用。用120 ml 1 mol/L NaCl与上述HA旋转30 min2次(6 r/min),离心收集上清液,洗涤3次后,再用120 ml 0.5 mol/L PBS液洗脱2次(条件同前)。分别用硫酸铵沉淀两步洗脱液中所含的全部蛋白组分,沉淀溶解,透析,冻干。
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1.2 Sephadex G75层析(2.5 cm×75 cm)
将上述冻干组分分别溶解于0.025 mol/L NaCl和0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl中,上样,洗脱,流速20 ml/h,每管收集15 ml, 280 nm测光吸收值,绘制洗脱曲线,分别收集各组分,聚乙二醇20000浓缩透析,4℃保存。
1.3 DEAE-Sephadex A25柱层析(1.5 cm×75 cm)
将Sephadex G75层析组分分别上样,用含0.025 mol/L NaCl的Tris-HCl液洗脱至A280nm=0,再用含0.025～1.2 mol/L NaCl的起始缓冲液(500 ml+500 ml)进行线性梯度洗脱,流速25 ml/h,每管收集5 ml,测ABS280nm值,绘制洗脱曲线,分别收集各组份,透析冻干。
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1.4 PAGE、SDS-PAGE和等电聚焦电泳
PAGE、SDS-PAGE均采用Tris-甘氨酸系统,按LKB211Y多相Ⅱ型电泳系统操作手册进行电泳,浓缩胶、分离胶浓度分别为3.75%,7.5%和3.75%,12.5%。等电聚焦电泳按郭尧君的方法进行[4],pH范围3.5～10。蛋白染色用考马斯亮蓝法,糖蛋白染色用Schiff试剂进行。
1.5 淀粉酶活性测定
用Bernfield的方法进行[5]。
1.6 琼脂糖免疫双向扩散实验
用纯化SAP组分与羊抗人IgA血清(上海生物制品研究所)进行常规免疫双向扩散实验。
1.7 氨基酸组份分析
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将纯化蛋白组分冻干样品在精密电子天平(十万分之一,Starus 200 D型)称重,溶于6 mol/L HCl溶液中,110℃水解24 h,真空干燥,日立835-5D氨基酸自动分析仪检测纯化蛋白氨基酸组成。
1.8 细菌粘附实验
细菌粘附实验 用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TDR)标记临床分离的变链血清型c菌株WD9463 A,洗菌后调菌浓度OD550nm=0.52。用纯化的SAP蛋白包被HA(分别以KCl缓冲液和全唾液作为阴性和阳性对照),洗涤后用人血清白蛋白封闭,加入细菌6 r/min旋转1 h,洗3次,进行液闪测量细菌粘附量[6]。
细菌粘附竞争抑制实验 实验步骤基本同前,但菌液浓度为OD550nm=0.62,实验组和阳性对照组用纯化SAP组份(0.01 mg/ml)包被HA,阴性对照组用KCl缓冲液包被,实验组在加入80 μl菌悬液同时加入20 μl纯化SAP组份,对照组则加入20 μl KCl缓冲液。
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2 结 果
2.1 Sephadex G75层析结果
1 mol/L NaCl洗脱的SAP组份(SA)经Sephadex G75层析后可得3个组份(SAG1～SAG3)(图1,A);0.5 mol/L LPB洗脱的SAP组份(SB)可得4个组份(SBG1～SBG4)(图1,B)。SBG4为单一电泳组份未作进一步纯化。
图1 Sephadex A25层析(2.5 cm×75 cm)
A 1.0 mol/L NaCl洗脱蛋白组份 B 0.1 mol/L LPS洗脱SAP组份
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2.2 DEAE-Sephadex A25层析
经DEAE-Sphadex A25层析后SAG1可得2个组份(SAG1D1、SAG1D2);SAG2、SAG3主要为一组份;SBG1、SBG2、SBG3为3个组份(SBG1D1-SBG1D3、SBG2D1-SBG2D3、SBG3D1-SBG3D3)。起始缓冲液:0.025 mol/L NaCl和0.05 mol/L Tris-HCl pH8.0,梯度洗脱:0.025～1.200 mol/L NaCl和0.05 mol/L Tris-HCl pH8.0,流速为25 ml/h,每管收集5 ml(图2)。
图2 DEAE-Sephadex A25层析洗脱曲线
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A SAG1, B SAG2, C SAG3, D SBG1, E SBG2, F SBG3
2.3 细菌粘附实验结果
细菌粘附实验结果显示淀粉酶组份SAG2、SAG3促粘附作用最强,其它淀粉酶组份、IgA降解片段SBG1D1、SBG2D1和MW为13 kD的蛋白SBG3D2也可促进细菌粘附(图3)。
图3 变链WD9463A对纯化SAP组份的粘附实验结果
细菌粘附竞争抑制实验显示,淀粉酶组份可不同程度地竞争抑制细菌粘附,其中SAG3、SBG4作用最强,可完全抑制细菌粘附,而IgA降解片段和分子量为13 kD的蛋白则无此作用(图4)。
2.4 各促变链粘附SAP组份理化和生化性能鉴定
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图4 变链WD9463粘附抑制实验结果
各促变链粘附SAP组份的理化和生物化学性质总结见表1,此8种组份在PAGE中均为单一条带(图5)。
表1 促变链粘附各组份理化和生物化学特性 名称
分子量
(kD)
pI
PAS染色
与sIgA
抗体结合
淀粉酶
活性
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SAG1D1
65.60
6.88
-
-
1.57
SAG2
60.60
6.88
+
-
2.41
SAG3
, 百拇医药
57.00
6.88
+
-
2.34
SBG1D1
23.15
Nt
-
+
-
SBG2D1
23.15
, 百拇医药
Nt
-
+
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SBG3D1
57.00
6.88
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0.84
SBG3D2
13.00
4.73～4.85
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-
-
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SBG4
63.00
6.88
+
-
7.49
图5 SAP纯化组份PAGE图谱
1.SBG3D1 2.SGB4 3.SAG1D1 4.SAG2 5.SAG3
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6.SGB3D2 7.SGB3D3 8.SGB1D1 9.SGB1D2 10.SGB1D3
11.SGB2D1 12.SGB2D2 13.SGB2D3 14.SAG1D2
2.5 氨基酸组份分析
结果表明,SAG1D1、SBG4含有较多的天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸和甘氨酸;SBG2D3酸性氨基酸天门冬氨酸和谷氨酸含量较高;SBG3D2中天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸和谷氨酸含量较高。
综上结果,可认为SAG1D1为非糖酰化淀粉酶,SAG2、SAG3、SBG3D1、SBG4为糖酰化淀粉酶,SBG1D1,SBG2D1为IgA降解片段,SBG3D2是一种小分子量酸性蛋白。
3 讨 论
, 百拇医药 由于口内唾液获得性膜取材困难、量少,而收集足量SAP标本是分离纯化变链牙面受体的必要条件,本实验用HA作为吸附介质,以全唾液包被HA形成实验组性SAP,这就为研究牙面唾液受体的种类、组成和生理功能提供了充足的材料。不同种类蛋白对HA的吸附机理不同,酸性蛋白主要通过钙桥吸附其上,中性蛋白、碱性蛋白则主要通过静电作用吸附其上[7]。实验采用1 mol/L NaCl洗脱于HA上的中性及碱性蛋白,再用0.5 mol/L PBS洗脱潴留的酸性蛋白。而后Sephadex G75分子筛层析和DEAE-Sephadex A25离子交换层析进一步纯化。结果表明各促变链粘附组份均达PAGE纯,说明分离方法较好。
变链牙面粘附唾液受体是近期防龋研究的热点之一。多数研究都是采用纯化腺体唾液蛋白组份包被HA,通过细菌粘附实验寻找变链的牙面粘附唾液受体。但唾液蛋白对牙面的吸附有高度的选择性,仅有少数唾液蛋白组份可与牙面特异性的结合,而参与获得性膜的形成,因此直接从SAP中分离纯化出与变链粘附有关的唾液蛋白受体是研究变链牙面粘附机理有效而可靠的方法。本实验通过对纯化SAP组份的粘附实验结果表明几种淀粉酶成分和两种IgA降解片段可明显促进变链地方株WD9463A对HA的粘附。这一结果与刘天佳[6]用纯化颌下腺唾液蛋白组份进行粘附实验所得结果相似。实验还发现一种分子量为13 kD的酸性小分子蛋白SBG3D2,其氨基酸组成、等电点及分子量均与Juriaane AC报道的3种对HA有高度亲和力的下颌唾液酸性蛋白相似,它也可促进变链粘附。此3种组份均为实验性全唾液获得性膜的重要组成部分,提示它们是变链在牙面粘附的唾液受体。
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值得注意的是本实验发现IgA降解片段和分子量为13 kD的蛋白只可促进变链的粘附,却不能竞争抑制其粘附,提示其为变链的牙面隐匿受体。这一粘附具有极高的特异性,作者根据ELISA实验原理设计进行了酶联免疫受体结合实验(ELISA),结果表明当吸附于聚苯乙烯板上时,此3种组份不能与各纯化变链表面蛋白有效结合(结果未报道)。实验结果还表明可促进变链粘附的IgA组份SBG1D1和SBG2D1均是IgA的降解片段,且主要由IgA的J链和H链组成,而其它含有IgA全分子的组份则促粘附作用很弱,提示IgA降解片段的促粘附作用不是通过抗原抗体反应进行的。对唾液中sIgA在变链粘附中的作用不同学者观点不一。近期研究发现sIgA既可促进细菌粘附,又可竞争抑制粘附,经酶解后其抗粘附作用消失,而酶解片段的促粘附能力却高于全分子[8]。本实验结果支持此观点。这提示口内细菌产生的IgA酶的降解作用可减少sIgA的抗粘附作用,并增强其促粘附作用。而几种淀粉酶组份则既可促进细菌粘附,又可竞争抑制细菌粘附,有两种组份在低浓度时即可完全阻止细菌粘附,提示其在细菌粘附中有双重作用,且抗粘附作用更强。
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本课题为国家自然科学基金资助项目(编号 39270717)
(本文图5见中心插页14)
4 参考文献
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6 刘天佳.变形链球菌对唾液成分的选择性结合.华西口腔医学杂志,1991,9(2):82～84
7 孙志贤主编.现代生物化学理论与研究技术.北京:军事医学科学出版社,1995:380～381
8 Hajshengallis G, Nikolova E, Russell MW. Inhibition of Streptococcus mutans adherence to saliva coated hydroxyapitite by human secretory IgA(sIgA) antibodies to cell surface protein antigen Ⅰ/Ⅱ:Reversal by IgAⅠ protease cleavage. Infect Immun, 1992,60(12):5057～5064
(1998-10-05收稿,1999-09-28修回), 百拇医药