妊娠期应激对大鼠子代神经行为发育的影响
作者：陆林 王学义 李静 黄明生 刘协和 Medick SA
单位：610041 华西医科大学附一院心理卫生研究所(陆林*,王学义,李静,黄明生,刘协和 *现在上海医科大学神经生物学国家重点实验室)美国南加利福尼亚大学(Medich SA)
关键词：妊娠；应激；子代；神经行为；发育
中国行为医学科学990401 【摘要】 目的 探索不同阶段的妊娠期应激对子代神经行为发育影响。方法 通过雌雄交配，获得40只孕鼠，随机分为妊娠早期、中期、晚期应激组及对照组；采用被动回避反应及开场行为测验等方法对不同母孕期应激组子鼠的一般指标、体重、发育成熟指标、早期反射和感觉功能、运动和协调功能、学习和记忆功能、开场行为进行评定。结果 妊娠中期应激对子代神经行为发育产生了广泛的影响，使开眼、出牙等生长发育时间提前，使某些运动协调、学习记忆及行为反应功能降低，而妊娠早期和晚期应激对子代神经行为发育的影响相对较小。结论 妊娠期应激对子代神经行为发育的影响具有特异性，妊娠中期应激对子代神经行为发育影响最为明显。进一步研究人体妊娠期应激对子代神经行为发育的影响可望找到精神分裂症神经发育缺陷的病因病理机制及对其开展早期治疗或干预的有效措施。
, 百拇医药
The effects on neurobehavioral development in offspring
by maternal stress in gestation
Lu Lin, Wang Xueyi, Li Jing, et al. Institute of Mental Health, West China University of Medical Science, Chengdu, 610041 P.R.China
【Abstract】 Objective To explore the effects on neurobehavioral development of offspring by stress in different gestation stage. Methods Pregnant mice were divided into normal control, early stage, moderate stage and later stage stress group in gestation. The general condition, body weight, physiological developmental landmarks, reflexes development and sensory function, movement coordination and learning-memory in different group offspring with maternal stress were observed or tested by one trial passive avoidance response and open field behavioral test, etc. Results Stress in moderate stage of gestation has widespread effects on the neurobehavioral development in offspring. Incisor eruption and eye opening in offspring with maternal stress in moderate stage of gestation began earlier than those of control group, and these offspring showed lower development in movement coordination, learning-memory and behavioral responses than those of control group. Maternal stress in early and later pregnant stage had mild effects on neurobehavioral development in offspring. Conclusion Maternal stress in gestation has specific effects on neurobehavioral development in offspring. Neurobehavioral development in offspring is affected easily by maternal stress in moderate stage of gestation. Further studies of effect on neurobehavioral development in human offspring by maternal stress in gestation would be helpful for understanding the etiopathologic mechanism of schizophrenia and finding effective measure to treat and prevent schizophrenia.
, 百拇医药
【Key words】 Gestation Stress Offspring Neurobehavioral Development
妊娠期应激对子代的影响，可能是通过HPA轴介导的[1]，应激诱导母体HPA轴兴奋性增强，释放ACTH、CRF，并进入胎儿体内作用于胎儿HPA轴，使胎儿神经内分泌功能出现异常，从而影响其生长发育，如给怀孕大鼠注射CRF可以导致子代体重下降[2]，而注射糖皮质激素可使子代死亡率增加[3]，所以这些研究均提示怀孕期应激对子代的生长发育存在明显影响，但妊娠期应激对子代神经行为的发育尚缺乏系统的研究。
材料和方法
一、 实验动物及分组
选择昆明品系小鼠雌性60只，雄性20只，体重分别为21.10±2.10g和38.40±2.40g，由华西医科大学动物实验中心提供；动物饲养在实验动物中心实验室，饲养条件：室温22-25℃，光照12D:12L。动物观察1周，每天测体重。
, 百拇医药
1周后开始动物交配，每笼雄性1只雌性3只，每日早晚各观察一次阴栓，发现阴栓日为孕期0天。共采用40只孕鼠，以区随机分为4组，即应激Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组及对照组。应激Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别于孕期第1～7天、8～14天及15～21天在15:00～16:00之间于水深25cm, 水温恒定在25℃的玻璃水缸中接受强迫游泳10min[4]。
二、神经行为评定方法
1.一般指标 仔鼠出生日记录每窝产仔数、仔活数、死亡数，观察外观有无畸形。
2.生长情况 记录产后0、3、7、14、28d每只仔鼠体重。
3.发育成熟指标 观察张耳、开眼、出牙、睾丸下降、阴道张开时间，分别从生后3、6、10、22、26d开始观察，记录每只达标天数。
4.早期反射和感觉功能 观察发生平面翻正、断崖回避、听觉惊厥、空中翻正、视觉定向的时间，分别从出生后3、4、7、9、12d开始观察，记录每只仔鼠达标的天数。
, 百拇医药
5.运动和协调功能 转体、前肢悬挂时间，分别于出生后6、11天观察。将仔鼠放在45℃斜面上，头朝下，记录放置至转身后头朝上的时间即为转体时间；将仔鼠前肢悬挂在直径约为0.5cm的铜棒上，记录其坠下时间即为前肢悬挂时间；足展开于14、28d观察，每天测2次。
6.学习记忆功能测定 采用一次性被动回避反应，检测小鼠的记忆保持力。实验前将小鼠放在暗箱外的通道上，记录其进入暗箱之前在通道上停留的时间，即电击前步入潜伏期(step-through latency, SLT)。当动物进入暗箱后，立即施以电击，电击参数为0.3mA、50Hz、3s, 由刺激控制仪控制。电击后取出小鼠，24h后检测其对电击的记忆保持力，STL越长说明记忆保持越好。检测以300s仍不进入暗箱者，均视为记忆保持良好。自仔鼠出生后41d开始，每只仔鼠每天测2次，连续10d。
7.开场行为观察 于仔鼠出后50天，逐个对仔鼠的开场行为(open field behavior)进行观察。观察时将单个仔鼠放入直径为40cm、高20cm的圆场中，圆场底面划分21格，记录小鼠在3min内由中央格开始跑动(ambulation)穿越的格数、在中央格停留的时间、竖立(rearing)次数、理毛(grooming)次数以及粪便粒数(defecation)。
, 百拇医药
结果
一、一般指标
实验各组的每窝产仔数、存活数、死亡数与对照组相比均无明显差异，而外观畸形发生率仅应激II组(8.31%)与对照组(3.34%)相比有显著性差异(χ2=4.16，P<0.05)。
二、生长指标体重
在早期应激组，除了♂d0仔鼠和♀d21仔鼠低于对照组外，其它时期两组无显著性差异；在中期应激组除了♂d3和♀d7外，其余与对照组相比，均有显著性差异，见表1。
表1 不同怀孕阶段应激对子代大鼠的体重发育的影响(g)
出生后时间
早期
, 百拇医药
中期
晚期
对照
d0
M
1.88±0.18*
1.74±0.20*
1.97±0.19
1.98±0.19
F
1.85±0.18
1.78±0.21*
, 百拇医药
1.98±0.20
1.94±0.18
d3
M
2.45±0.23
1.94±0.18*
2.12±0.21
2.20±0.21
F
2.12±0.20
1.93±0.19
2.10±0.20
, 百拇医药
1.98±0.20
d7
M
6.19±0.81
5.84±0.75
6.15±0.78
6.24±0.88
F
5.78±0.75
5.58±0.74*
6.10±0.75
6.12±0.98
, http://www.100md.com
d14
M
11.20±1.12
9.45±1.02*
10.90±1.13
11.10±1.20
F
10.12±1.10
9.25±0.98*
9.75±1.03
10.08±1.05
, 百拇医药 d21
M
15.59±2.00
14.78±2.01**
15.98±2.13
16.78±2.45
F
14.21±2.01*
14.42±1.95*
15.75±2.10
15.98±2.13
, 百拇医药
d28
M
20.12±3.18
18.12±3.15*
19.75±3.45
20.01±4.01
F
19.80±3.02
18.01±3.10*
19.65±3.18
19.78±3.78
, 百拇医药
与对照组相比， * P<0.05 ** P<0.01
三、发育成熟指标出牙
♂和♀仔鼠中期应激组均早于对照组，开眼；♀仔鼠中期应激组早于对照组，差异均有显著性，见表2。
表2 不同怀孕阶段应激对子代大鼠的发育成熟指标的影响(天)
成熟指标
早期
中期
晚期
对照
张耳
, 百拇医药
M
4.32±0.28
4.96±1.51
4.77±1.10
4.56±0.83
F
4.51±0.61
5.00±1.38
4.52±1.09
4.45±0.74
出牙
M
, http://www.100md.com
11.06±0.89
9.58±1.03*
10.89±0.74
11.07±0.68
F
11.00±0.89
9.08±0.84*
10.89±0.74
11.07±0.68
开眼
M
, 百拇医药 14.30±0.78
13.73±1.08
14.48±1.33
14.66±1.04
F
14.71±0.52
12.86±1.12**
14.25±1.34
14.66±1.04
睾丸下降
M
23.36±0.45
, 百拇医药
23.18±1.34
23.81±1.26
23.34±0.64
阴道张开
F
29.19±0.14
29.12±0.01
29.11±0.18
29.00±0.10
与对照组相比， * P<0.05 ** P<0.01
四、反射和感觉功能成熟指标平面翻正
, http://www.100md.com
♂中期应激组晚于对照组；视觉定向：♂和♀中期应激组均晚于对照组，有显著性差异，见表3。
表3 不同怀孕阶段应激对子代大鼠的早期反射和感觉功能发育的影响(天)
发育指标
早期
中期
晚期
对照
平面翻正
M
6.20±1.04
5.09±0.87*
, 百拇医药
6.79±1.40
6.34±1.04
F
5.81±1.15
5.61±1.30
6.53±1.36
6.12±0.86
断崖回避
M
6.57±1.60
6.91±1.41
6.94±1.72
, 百拇医药
6.39±1.60
F
6.97±1.77
6.62±1.77
6.57±1.25
6.92±1.44
听觉惊厥
M
11.06±0.83
10.86±0.89
11.23±1.28
11.04±1.13
, 百拇医药
F
11.86±0.64
10.77±1.18
11.18±1.09
11.18±1.08
空中翻正
M
11.20±1.25
11.18±0.96
11.00±1.32
11.26±1.06
F
, http://www.100md.com
11.05±1.39
11.31±1.05
11.31±1.07
11.67±1.07
视觉定向
M
18.06±1.06
16.50±1.57*
17.69±1.94
18.81±1.04
F
17.78±1.51
, http://www.100md.com
16.31±2.07*
17.78±1.66
17.64±2.08
与对照组相比， * P<0.05 ** P<0.01
五、运动协调功能发育指标转体
仔鼠各期应激组与对照组相比均有显著性差异；前肢悬挂：♂和♀仔鼠中期应激组与对照组相比亦有显著差异，见表4。
表4 不同怀孕阶段应激对子代大鼠运动协调功能发育的影响
发育指标
早期
, http://www.100md.com 中期
晚期
对照
转体功能
M
3.20±0.32*
3.13±0.24*
3.48±2.19*
2.63±0.66
F
3.08±0.14*
3.17±0.15*
, http://www.100md.com
3.55±2.28*
2.45±0.63
前肢悬挂
M
12.27±9.44
11.46±17.35*
12.60±7.06
13.85±8.93
F
12.00±6.66
8.81±5.56**
, 百拇医药
11.44±8.65
11.81±7.02
后肢展开
M
3.56±0.57
3.78±0.54
3.56±0.71
3.57±0.59
(d14)
F
3.52±0.50
3.55±0.72
, 百拇医药
3.39±0.71
3.60±0.74
后肢展开
M
3.76±0.64
3.71±0.54
3.69±0.49
3.54±0.52
(d24)
F
3.72±0.37
3.74±0.65
, 百拇医药
3.65±0.40
3.45±0.46
与对照组相比， * P<0.05 ** P<0.01
六、学习记忆功能发育指标
在中期应激组，d41,d46～50仔鼠与对照组相比均有显著性差异；而在早期应激组，仅d48♀仔鼠与对照组相比有显著性差异，见表5。
表5 不同怀孕阶段应激对子代大鼠学习记忆功能发育的影响(s)
出生后时间
早期
中期
, http://www.100md.com
晚期
对照
d41
M
298.34±44.94
211.94±56.16**
272.66±55.62
299.03±42.21
F
263.93±59.87
215.91±54.31**
, http://www.100md.com 274.44±63.17
298.60±45.10
d42
M
284.59±37.55
299.86±35.50
280.09±32.77
290.25±49.56
F
290.94±48.34
296.46±40.85
298.92±53.61
, 百拇医药
289.35±43.07
d43
M
267.92±20.01
278.36±44.64
288.05±45.09
287.02±49.24
F
287.60±29.90
271.61±48.04
278.29±31.59
291.54±45.98
, http://www.100md.com
d44
M
291.18±44.40
272.85±49.28
274.16±49.28
292.37±45.23
F
283.03±31.84
279.09±43.36
283.32±41.26
290.52±46.25
d45
, 百拇医药
M
290.40±33.50
280.80±44.44
291.54±46.33
290.56±43.82
F
280.54±45.64
278.53±42.51
290.04±45.00
291.18±41.97
d46
M
, 百拇医药
289.42±42.74
219.47±43.46*
271.02±35.22
299.09±42.51
F
280.68±42.96
219.25±49.57*
279.69±37.17
290.49±40.32
d47
M
, 百拇医药
278.37±42.00
209.72±43.72*
271.12±45.32
289.16±42.14
F
287.76±42.68
219.22±44.55
289.91±48.44
289.84±45.87
d8
M
, 百拇医药
258.46±32.79*
212.41±44.22*
272.14±37.07
298.59±42.49
F
257.93±33.60*
208.11±42.86*
289.85±37.25
298.87±44.86
d49
, 百拇医药
M
287.67±42.43
218.24±42.10*
288.44±42.54
288.05±42.15
F
277.68±42.81
228.57±46.23*
290.90±36.18
290.80±44.69
d50
, 百拇医药
M
298.46±43.20
218.42±41.86*
297.90±41.69
297.86±42.09
F
288.04±44.13
207.69±42.72*
280.17±45.96
290.38±49.96
与对照组相比， * P<0.05 ** P<0.01
, 百拇医药
七、开场行为观察结果
穿行格数：仅♂仔鼠中期应激低于对照组，差异有显著性。竖立次数：三个应激组均低于对照组；中央格时间：仅中期应激组仔鼠高于对照组，见表6。
表6 不同怀孕阶段应激对子代大鼠开场行为发育的影响
行为指标
早期
中期
晚期
对照
穿行格数
M
82.76±33.83
, 百拇医药
68.67±34.64*
84.71±36.74
97.38±35.01
F
76.47±39.00
83.07±34.70
89.39±76.06
80.19±19.40
竖立次数
M
8.29±7.37*
, 百拇医药
4.20±5.75**
6.94±6.09*
14.31±6.20
F
6.35±6.75*
5.07±4.37**
6.72±6.84*
13.44±5.15
粪便粒数
M
1.88±1.62
, 百拇医药
1.93±1.67
2.12±1.50
1.63±1.09
F
2.12±1.87
3.33±3.83
2.94±1.92
2.75±2.46
理毛次数
M
3.81±1.21
3.51±1.12
, 百拇医药
3.83±1.62
4.14±1.85
F
3.67±1.42
3.31±0.95
3.61±1.21
3.83±1.62
中央格时间
M
9.71±7.82
18.90±15.20*
11.21±7.80
, 百拇医药
10.45±7.42
F
10.78±9.24
19.42±11.41*
13.27±7.94
11.25±8.10
与对照组相比， * P<0.05 ** P<0.01
讨 论
本实验采用强迫游泳建立怀孕小鼠应激模型，通过对子代一般生长发育情况、反射和感觉功能、运动协调功能、学习记忆功能和开场行为进行检测，研究了妊娠期应激对子代神经行为发育影响的行为学改变特点，国内、外未见类似报道。本实验发现妊娠期应激对子代神经行为发育的影响具有特异性，即对某些神经行为功能呈现刺激性，如应激组的某些生长发育指标(开眼、出牙)比对照组发育提前；相反，妊娠期应激对另一些神经行为功能可以表现抑制作用，如中期应激组的运动协同功能、学习记忆功能和行为反应均比对照组下降。Thullier报道[5]，母鼠怀孕期间受伤后，其子代在发育过程中出现一些神经行为的异常，在出生后10天，实验组子鼠的转体功能和避地反应明显差于对照组，在生后22至30天，实验组子鼠视觉定向迟钝，在强迫游泳过程中，需要花更多的时间才能爬到安全杆上。Muneoka给怀孕大鼠注射尼古丁后，其子代的开场行为受到明显抑制，其抑制程度与前脑、海马及小脑的单胺类递质，如多巴胺和5-羟色胺的浓度成正相关[6]。
, 百拇医药
虽然早期的很多研究认为，越在妊娠早期阶段给母鼠伤害性刺激(如药物、损伤)，对胚胎发育的影响越大。但在本研究中，对胚胎发育影响最大的是妊娠中期给予强迫游泳的刺激，而妊娠早、晚期给予应激对子代神经行为发育影响相对较小。Shearman (1997)报道[7]，在小鼠怀孕的第10天和第20天给母体注射D1受体拮抗剂SKF38393，发现第10天给药诱导子代出生时中枢神经系统c-fos表达强于第20天给药；在第10天给药诱导D1受体mRNA表达分布更为广泛，因此导致的出生后神经行为发育异常更为明显，Shearman的发现与本研究结果具有一致的趋势。
很多研究证实[8，9]，精神分裂症存在着明显的神经发育缺陷，主要表现在：(1)脑影像学发现。病人存在脑室扩大，脑沟变浅，脑皮层萎缩，两大脑半球不对称，胼质体变薄；(2)认知功能检查。病人可表现先期视觉加工、持续注意试验、空间工作记忆、执行功能和IQ操作测验明显异常；(3)微小躯体异常及皮纹变异。所有这些神经发育缺陷都可出现在精神分裂症早期，甚至是在发病之前或童年时期，说明这些发育缺陷并不是疾病或药物造成的，多数研究认为是与母孕中期三个月的应激或创伤有关[10，11]。Arnold等研究了妊娠期患流感对胎儿成年后患精神分裂症的影响，结果发现孕妇在妊娠中三个月患流感，其胎儿成年后精神分裂症患病率最高，显著高于母孕期未患流感及母孕期前三个月或后三个月患流感的胎儿组[12]。除了感染，母孕期的心理创伤对胎儿后来的神经发育亦存在肯定的影响，Harrison曾报道，怀孕4～6个月时，丈夫死亡后，其胎儿成年后精神分裂症发病风险增加[13]， 王学义在研究唐山大地震对胎儿神经发育影响时发现，妊娠4～6个月经历大地震的孕母，其胎儿成年时(18～22岁)神经心理测验异常评分增加，如SCL-90中恐怖和精神病性因子评分明显高于对照组，与神经症患者接近。 以上研究均提示，妊娠期应激或感染是精神分裂症病人神经发育缺陷的根本原因之一。在本实验中，孕鼠妊娠中期应激对子代神经行为发育产生了广泛的影响，能否对妊娠期应激(特别是妊娠中期)进行有效预防或对精神分裂症高危人群在童年或发病前进行干预，从而减少精神分裂症的发病，值得进一步深入研究。
, 百拇医药
*本研究为国家自然科学启动基金(960179)及美国南加福尼亚大学合作项目部分资助
参考文献
1 Lui D, Diorio J, Tannenbaurn B, et al. Maternal care, hippocampal glucocorticoid receptors, and hypothalamic-pituitary adrenal response to stress. Science, 1997,227:1659～1662.
2 Fameli M, Kitraki E, Stylianoloulou F. Effects of hypoactivity of the maternal hypothalamic-pituitary adrenal(HPA) axis during pregnancy on the development of the HPA axis and brain monoamines of the offspring. Int J Dev Neurosci, 1994, 12:651～659.
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(收稿日期：1999-07-22), http://www.100md.com
单位：610041 华西医科大学附一院心理卫生研究所(陆林*,王学义,李静,黄明生,刘协和 *现在上海医科大学神经生物学国家重点实验室)美国南加利福尼亚大学(Medich SA)
关键词：妊娠；应激；子代；神经行为；发育
中国行为医学科学990401 【摘要】 目的 探索不同阶段的妊娠期应激对子代神经行为发育影响。方法 通过雌雄交配，获得40只孕鼠，随机分为妊娠早期、中期、晚期应激组及对照组；采用被动回避反应及开场行为测验等方法对不同母孕期应激组子鼠的一般指标、体重、发育成熟指标、早期反射和感觉功能、运动和协调功能、学习和记忆功能、开场行为进行评定。结果 妊娠中期应激对子代神经行为发育产生了广泛的影响，使开眼、出牙等生长发育时间提前，使某些运动协调、学习记忆及行为反应功能降低，而妊娠早期和晚期应激对子代神经行为发育的影响相对较小。结论 妊娠期应激对子代神经行为发育的影响具有特异性，妊娠中期应激对子代神经行为发育影响最为明显。进一步研究人体妊娠期应激对子代神经行为发育的影响可望找到精神分裂症神经发育缺陷的病因病理机制及对其开展早期治疗或干预的有效措施。
, 百拇医药
The effects on neurobehavioral development in offspring
by maternal stress in gestation
Lu Lin, Wang Xueyi, Li Jing, et al. Institute of Mental Health, West China University of Medical Science, Chengdu, 610041 P.R.China
【Abstract】 Objective To explore the effects on neurobehavioral development of offspring by stress in different gestation stage. Methods Pregnant mice were divided into normal control, early stage, moderate stage and later stage stress group in gestation. The general condition, body weight, physiological developmental landmarks, reflexes development and sensory function, movement coordination and learning-memory in different group offspring with maternal stress were observed or tested by one trial passive avoidance response and open field behavioral test, etc. Results Stress in moderate stage of gestation has widespread effects on the neurobehavioral development in offspring. Incisor eruption and eye opening in offspring with maternal stress in moderate stage of gestation began earlier than those of control group, and these offspring showed lower development in movement coordination, learning-memory and behavioral responses than those of control group. Maternal stress in early and later pregnant stage had mild effects on neurobehavioral development in offspring. Conclusion Maternal stress in gestation has specific effects on neurobehavioral development in offspring. Neurobehavioral development in offspring is affected easily by maternal stress in moderate stage of gestation. Further studies of effect on neurobehavioral development in human offspring by maternal stress in gestation would be helpful for understanding the etiopathologic mechanism of schizophrenia and finding effective measure to treat and prevent schizophrenia.
, 百拇医药
【Key words】 Gestation Stress Offspring Neurobehavioral Development
妊娠期应激对子代的影响，可能是通过HPA轴介导的[1]，应激诱导母体HPA轴兴奋性增强，释放ACTH、CRF，并进入胎儿体内作用于胎儿HPA轴，使胎儿神经内分泌功能出现异常，从而影响其生长发育，如给怀孕大鼠注射CRF可以导致子代体重下降[2]，而注射糖皮质激素可使子代死亡率增加[3]，所以这些研究均提示怀孕期应激对子代的生长发育存在明显影响，但妊娠期应激对子代神经行为的发育尚缺乏系统的研究。
材料和方法
一、 实验动物及分组
选择昆明品系小鼠雌性60只，雄性20只，体重分别为21.10±2.10g和38.40±2.40g，由华西医科大学动物实验中心提供；动物饲养在实验动物中心实验室，饲养条件：室温22-25℃，光照12D:12L。动物观察1周，每天测体重。
, 百拇医药
1周后开始动物交配，每笼雄性1只雌性3只，每日早晚各观察一次阴栓，发现阴栓日为孕期0天。共采用40只孕鼠，以区随机分为4组，即应激Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组及对照组。应激Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别于孕期第1～7天、8～14天及15～21天在15:00～16:00之间于水深25cm, 水温恒定在25℃的玻璃水缸中接受强迫游泳10min[4]。
二、神经行为评定方法
1.一般指标 仔鼠出生日记录每窝产仔数、仔活数、死亡数，观察外观有无畸形。
2.生长情况 记录产后0、3、7、14、28d每只仔鼠体重。
3.发育成熟指标 观察张耳、开眼、出牙、睾丸下降、阴道张开时间，分别从生后3、6、10、22、26d开始观察，记录每只达标天数。
4.早期反射和感觉功能 观察发生平面翻正、断崖回避、听觉惊厥、空中翻正、视觉定向的时间，分别从出生后3、4、7、9、12d开始观察，记录每只仔鼠达标的天数。
, 百拇医药
5.运动和协调功能 转体、前肢悬挂时间，分别于出生后6、11天观察。将仔鼠放在45℃斜面上，头朝下，记录放置至转身后头朝上的时间即为转体时间；将仔鼠前肢悬挂在直径约为0.5cm的铜棒上，记录其坠下时间即为前肢悬挂时间；足展开于14、28d观察，每天测2次。
6.学习记忆功能测定 采用一次性被动回避反应，检测小鼠的记忆保持力。实验前将小鼠放在暗箱外的通道上，记录其进入暗箱之前在通道上停留的时间，即电击前步入潜伏期(step-through latency, SLT)。当动物进入暗箱后，立即施以电击，电击参数为0.3mA、50Hz、3s, 由刺激控制仪控制。电击后取出小鼠，24h后检测其对电击的记忆保持力，STL越长说明记忆保持越好。检测以300s仍不进入暗箱者，均视为记忆保持良好。自仔鼠出生后41d开始，每只仔鼠每天测2次，连续10d。
7.开场行为观察 于仔鼠出后50天，逐个对仔鼠的开场行为(open field behavior)进行观察。观察时将单个仔鼠放入直径为40cm、高20cm的圆场中，圆场底面划分21格，记录小鼠在3min内由中央格开始跑动(ambulation)穿越的格数、在中央格停留的时间、竖立(rearing)次数、理毛(grooming)次数以及粪便粒数(defecation)。
, 百拇医药
结果
一、一般指标
实验各组的每窝产仔数、存活数、死亡数与对照组相比均无明显差异，而外观畸形发生率仅应激II组(8.31%)与对照组(3.34%)相比有显著性差异(χ2=4.16，P<0.05)。
二、生长指标体重
在早期应激组，除了♂d0仔鼠和♀d21仔鼠低于对照组外，其它时期两组无显著性差异；在中期应激组除了♂d3和♀d7外，其余与对照组相比，均有显著性差异，见表1。
表1 不同怀孕阶段应激对子代大鼠的体重发育的影响(g)
出生后时间
早期
, 百拇医药
中期
晚期
对照
d0
M
1.88±0.18*
1.74±0.20*
1.97±0.19
1.98±0.19
F
1.85±0.18
1.78±0.21*
, 百拇医药
1.98±0.20
1.94±0.18
d3
M
2.45±0.23
1.94±0.18*
2.12±0.21
2.20±0.21
F
2.12±0.20
1.93±0.19
2.10±0.20
, 百拇医药
1.98±0.20
d7
M
6.19±0.81
5.84±0.75
6.15±0.78
6.24±0.88
F
5.78±0.75
5.58±0.74*
6.10±0.75
6.12±0.98
, http://www.100md.com
d14
M
11.20±1.12
9.45±1.02*
10.90±1.13
11.10±1.20
F
10.12±1.10
9.25±0.98*
9.75±1.03
10.08±1.05
, 百拇医药 d21
M
15.59±2.00
14.78±2.01**
15.98±2.13
16.78±2.45
F
14.21±2.01*
14.42±1.95*
15.75±2.10
15.98±2.13
, 百拇医药
d28
M
20.12±3.18
18.12±3.15*
19.75±3.45
20.01±4.01
F
19.80±3.02
18.01±3.10*
19.65±3.18
19.78±3.78
, 百拇医药
与对照组相比， * P<0.05 ** P<0.01
三、发育成熟指标出牙
♂和♀仔鼠中期应激组均早于对照组，开眼；♀仔鼠中期应激组早于对照组，差异均有显著性，见表2。
表2 不同怀孕阶段应激对子代大鼠的发育成熟指标的影响(天)
成熟指标
早期
中期
晚期
对照
张耳
, 百拇医药
M
4.32±0.28
4.96±1.51
4.77±1.10
4.56±0.83
F
4.51±0.61
5.00±1.38
4.52±1.09
4.45±0.74
出牙
M
, http://www.100md.com
11.06±0.89
9.58±1.03*
10.89±0.74
11.07±0.68
F
11.00±0.89
9.08±0.84*
10.89±0.74
11.07±0.68
开眼
M
, 百拇医药 14.30±0.78
13.73±1.08
14.48±1.33
14.66±1.04
F
14.71±0.52
12.86±1.12**
14.25±1.34
14.66±1.04
睾丸下降
M
23.36±0.45
, 百拇医药
23.18±1.34
23.81±1.26
23.34±0.64
阴道张开
F
29.19±0.14
29.12±0.01
29.11±0.18
29.00±0.10
与对照组相比， * P<0.05 ** P<0.01
四、反射和感觉功能成熟指标平面翻正
, http://www.100md.com
♂中期应激组晚于对照组；视觉定向：♂和♀中期应激组均晚于对照组，有显著性差异，见表3。
表3 不同怀孕阶段应激对子代大鼠的早期反射和感觉功能发育的影响(天)
发育指标
早期
中期
晚期
对照
平面翻正
M
6.20±1.04
5.09±0.87*
, 百拇医药
6.79±1.40
6.34±1.04
F
5.81±1.15
5.61±1.30
6.53±1.36
6.12±0.86
断崖回避
M
6.57±1.60
6.91±1.41
6.94±1.72
, 百拇医药
6.39±1.60
F
6.97±1.77
6.62±1.77
6.57±1.25
6.92±1.44
听觉惊厥
M
11.06±0.83
10.86±0.89
11.23±1.28
11.04±1.13
, 百拇医药
F
11.86±0.64
10.77±1.18
11.18±1.09
11.18±1.08
空中翻正
M
11.20±1.25
11.18±0.96
11.00±1.32
11.26±1.06
F
, http://www.100md.com
11.05±1.39
11.31±1.05
11.31±1.07
11.67±1.07
视觉定向
M
18.06±1.06
16.50±1.57*
17.69±1.94
18.81±1.04
F
17.78±1.51
, http://www.100md.com
16.31±2.07*
17.78±1.66
17.64±2.08
与对照组相比， * P<0.05 ** P<0.01
五、运动协调功能发育指标转体
仔鼠各期应激组与对照组相比均有显著性差异；前肢悬挂：♂和♀仔鼠中期应激组与对照组相比亦有显著差异，见表4。
表4 不同怀孕阶段应激对子代大鼠运动协调功能发育的影响
发育指标
早期
, http://www.100md.com 中期
晚期
对照
转体功能
M
3.20±0.32*
3.13±0.24*
3.48±2.19*
2.63±0.66
F
3.08±0.14*
3.17±0.15*
, http://www.100md.com
3.55±2.28*
2.45±0.63
前肢悬挂
M
12.27±9.44
11.46±17.35*
12.60±7.06
13.85±8.93
F
12.00±6.66
8.81±5.56**
, 百拇医药
11.44±8.65
11.81±7.02
后肢展开
M
3.56±0.57
3.78±0.54
3.56±0.71
3.57±0.59
(d14)
F
3.52±0.50
3.55±0.72
, 百拇医药
3.39±0.71
3.60±0.74
后肢展开
M
3.76±0.64
3.71±0.54
3.69±0.49
3.54±0.52
(d24)
F
3.72±0.37
3.74±0.65
, 百拇医药
3.65±0.40
3.45±0.46
与对照组相比， * P<0.05 ** P<0.01
六、学习记忆功能发育指标
在中期应激组，d41,d46～50仔鼠与对照组相比均有显著性差异；而在早期应激组，仅d48♀仔鼠与对照组相比有显著性差异，见表5。
表5 不同怀孕阶段应激对子代大鼠学习记忆功能发育的影响(s)
出生后时间
早期
中期
, http://www.100md.com
晚期
对照
d41
M
298.34±44.94
211.94±56.16**
272.66±55.62
299.03±42.21
F
263.93±59.87
215.91±54.31**
, http://www.100md.com 274.44±63.17
298.60±45.10
d42
M
284.59±37.55
299.86±35.50
280.09±32.77
290.25±49.56
F
290.94±48.34
296.46±40.85
298.92±53.61
, 百拇医药
289.35±43.07
d43
M
267.92±20.01
278.36±44.64
288.05±45.09
287.02±49.24
F
287.60±29.90
271.61±48.04
278.29±31.59
291.54±45.98
, http://www.100md.com
d44
M
291.18±44.40
272.85±49.28
274.16±49.28
292.37±45.23
F
283.03±31.84
279.09±43.36
283.32±41.26
290.52±46.25
d45
, 百拇医药
M
290.40±33.50
280.80±44.44
291.54±46.33
290.56±43.82
F
280.54±45.64
278.53±42.51
290.04±45.00
291.18±41.97
d46
M
, 百拇医药
289.42±42.74
219.47±43.46*
271.02±35.22
299.09±42.51
F
280.68±42.96
219.25±49.57*
279.69±37.17
290.49±40.32
d47
M
, 百拇医药
278.37±42.00
209.72±43.72*
271.12±45.32
289.16±42.14
F
287.76±42.68
219.22±44.55
289.91±48.44
289.84±45.87
d8
M
, 百拇医药
258.46±32.79*
212.41±44.22*
272.14±37.07
298.59±42.49
F
257.93±33.60*
208.11±42.86*
289.85±37.25
298.87±44.86
d49
, 百拇医药
M
287.67±42.43
218.24±42.10*
288.44±42.54
288.05±42.15
F
277.68±42.81
228.57±46.23*
290.90±36.18
290.80±44.69
d50
, 百拇医药
M
298.46±43.20
218.42±41.86*
297.90±41.69
297.86±42.09
F
288.04±44.13
207.69±42.72*
280.17±45.96
290.38±49.96
与对照组相比， * P<0.05 ** P<0.01
, 百拇医药
七、开场行为观察结果
穿行格数：仅♂仔鼠中期应激低于对照组，差异有显著性。竖立次数：三个应激组均低于对照组；中央格时间：仅中期应激组仔鼠高于对照组，见表6。
表6 不同怀孕阶段应激对子代大鼠开场行为发育的影响
行为指标
早期
中期
晚期
对照
穿行格数
M
82.76±33.83
, 百拇医药
68.67±34.64*
84.71±36.74
97.38±35.01
F
76.47±39.00
83.07±34.70
89.39±76.06
80.19±19.40
竖立次数
M
8.29±7.37*
, 百拇医药
4.20±5.75**
6.94±6.09*
14.31±6.20
F
6.35±6.75*
5.07±4.37**
6.72±6.84*
13.44±5.15
粪便粒数
M
1.88±1.62
, 百拇医药
1.93±1.67
2.12±1.50
1.63±1.09
F
2.12±1.87
3.33±3.83
2.94±1.92
2.75±2.46
理毛次数
M
3.81±1.21
3.51±1.12
, 百拇医药
3.83±1.62
4.14±1.85
F
3.67±1.42
3.31±0.95
3.61±1.21
3.83±1.62
中央格时间
M
9.71±7.82
18.90±15.20*
11.21±7.80
, 百拇医药
10.45±7.42
F
10.78±9.24
19.42±11.41*
13.27±7.94
11.25±8.10
与对照组相比， * P<0.05 ** P<0.01
讨 论
本实验采用强迫游泳建立怀孕小鼠应激模型，通过对子代一般生长发育情况、反射和感觉功能、运动协调功能、学习记忆功能和开场行为进行检测，研究了妊娠期应激对子代神经行为发育影响的行为学改变特点，国内、外未见类似报道。本实验发现妊娠期应激对子代神经行为发育的影响具有特异性，即对某些神经行为功能呈现刺激性，如应激组的某些生长发育指标(开眼、出牙)比对照组发育提前；相反，妊娠期应激对另一些神经行为功能可以表现抑制作用，如中期应激组的运动协同功能、学习记忆功能和行为反应均比对照组下降。Thullier报道[5]，母鼠怀孕期间受伤后，其子代在发育过程中出现一些神经行为的异常，在出生后10天，实验组子鼠的转体功能和避地反应明显差于对照组，在生后22至30天，实验组子鼠视觉定向迟钝，在强迫游泳过程中，需要花更多的时间才能爬到安全杆上。Muneoka给怀孕大鼠注射尼古丁后，其子代的开场行为受到明显抑制，其抑制程度与前脑、海马及小脑的单胺类递质，如多巴胺和5-羟色胺的浓度成正相关[6]。
, 百拇医药
虽然早期的很多研究认为，越在妊娠早期阶段给母鼠伤害性刺激(如药物、损伤)，对胚胎发育的影响越大。但在本研究中，对胚胎发育影响最大的是妊娠中期给予强迫游泳的刺激，而妊娠早、晚期给予应激对子代神经行为发育影响相对较小。Shearman (1997)报道[7]，在小鼠怀孕的第10天和第20天给母体注射D1受体拮抗剂SKF38393，发现第10天给药诱导子代出生时中枢神经系统c-fos表达强于第20天给药；在第10天给药诱导D1受体mRNA表达分布更为广泛，因此导致的出生后神经行为发育异常更为明显，Shearman的发现与本研究结果具有一致的趋势。
很多研究证实[8，9]，精神分裂症存在着明显的神经发育缺陷，主要表现在：(1)脑影像学发现。病人存在脑室扩大，脑沟变浅，脑皮层萎缩，两大脑半球不对称，胼质体变薄；(2)认知功能检查。病人可表现先期视觉加工、持续注意试验、空间工作记忆、执行功能和IQ操作测验明显异常；(3)微小躯体异常及皮纹变异。所有这些神经发育缺陷都可出现在精神分裂症早期，甚至是在发病之前或童年时期，说明这些发育缺陷并不是疾病或药物造成的，多数研究认为是与母孕中期三个月的应激或创伤有关[10，11]。Arnold等研究了妊娠期患流感对胎儿成年后患精神分裂症的影响，结果发现孕妇在妊娠中三个月患流感，其胎儿成年后精神分裂症患病率最高，显著高于母孕期未患流感及母孕期前三个月或后三个月患流感的胎儿组[12]。除了感染，母孕期的心理创伤对胎儿后来的神经发育亦存在肯定的影响，Harrison曾报道，怀孕4～6个月时，丈夫死亡后，其胎儿成年后精神分裂症发病风险增加[13]， 王学义在研究唐山大地震对胎儿神经发育影响时发现，妊娠4～6个月经历大地震的孕母，其胎儿成年时(18～22岁)神经心理测验异常评分增加，如SCL-90中恐怖和精神病性因子评分明显高于对照组，与神经症患者接近。 以上研究均提示，妊娠期应激或感染是精神分裂症病人神经发育缺陷的根本原因之一。在本实验中，孕鼠妊娠中期应激对子代神经行为发育产生了广泛的影响，能否对妊娠期应激(特别是妊娠中期)进行有效预防或对精神分裂症高危人群在童年或发病前进行干预，从而减少精神分裂症的发病，值得进一步深入研究。
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*本研究为国家自然科学启动基金(960179)及美国南加福尼亚大学合作项目部分资助
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(收稿日期：1999-07-22), http://www.100md.com