大鼠脑缺血模型的改进和脑缺血再灌流损伤诱发细胞凋亡的研究
作者：叶建锋 李涛平 舒斯云 高宁
单位：叶建锋 高宁 广州第一军医大学基础部(510515)；李涛平 第一军医大学南方医院；舒斯云 第一军医大学珠江医院
关键词：脑缺血；细胞凋亡
中国急救医学990402 [摘 要] 目的 改进动脉内置线阻断法建立的大鼠大脑中动脉(MCA)局灶性脑缺血模型，并探讨脑缺血诱发细胞凋亡的时效和量效关系。方法 以顶端细，后逐渐增粗的涂抹硅橡胶改进栓子，TTC染色鉴定缺血效果；TUNEL-AP法和HE染色观察凋亡发生和形态学改变。结果 TTC染色证实了大脑缺血灶的的稳定出现；用TUNEL法发现，缺血30 min再灌流6 h后，凋亡阳性细胞即明显增多，48 h再灌流后阳性细胞数最多；缺血5 min再灌流48 h缺血脑区的凋亡细胞主要位于纹状体，15 min缺血组皮层也开始散见阳性细胞；随缺血时间延长，凋亡细胞主要出现在缺血区周边。结论 脑缺血可选择性诱发神经细胞凋亡。
, 百拇医药
Improving of the model of cerebral ischemia in the rats and apoptosis induction in reperfusion after cerebral ischemia
Ye Jianfeng,Li Taoping,Shu Siyun,et al.
Basic Medical College,The First Military Medical University,Guangzhou 510515
[Abstract] Objective To improve the model of intraluminal vascular occlusion of the middle cerebral artery in rats and assess the effects of focal ischemia on apoptosis induction.Methods The embolus was smeared thin in top and than gradually thicker in the end with silicon-rubber.The TTC staining was employed to appraise the ischemic effect.The TUNEL labeling and HE staining were used to detect apoptotic cells and morphologic changes in ischemic brain.Results The occlusion of ipsilateral MCA produced well-defined lesions that could be visualized with TTC staining.With the TUNEL labeling,apoptotic cells was increased as early as 6 hours after 30-min MCA occlusion and peaked at 48-hour reperfusion.Apoptotic cell increased in striatum after 5-min ischemia and 48-hour reperfusion,and scattered in the cortex after 15-min ischemia.With the time of ischemia prolonged,groups of apoptotic cells were primarily localized to the inner boundary zone of the infarct.Conclusion Neurocyte apoptosis can be selectivity induced in ischemic brain.
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[Key words] Cerebral ischemia Apoptosis
细胞凋亡是通过触发细胞内专门负责细胞死亡信号感知、调控和死亡效应执行的一整套基因程序后而发生的，以细胞DNA早期降解为特征、具有特征性形态变化和生化改变的细胞主动死亡过程。在发育成熟的神经系统中，细胞凋亡有可能在各种细胞操作性刺激下被触发或持续发生[1]。在不同的脑缺血模型中，脑缺血可以诱发一些细胞凋亡的形态学变化和核小体DNA片段的生成[2，3]。由于不同的细胞系统在发生凋亡时的动力学过程不尽一致，发生的细胞形态学改变也具有不同的差异[4]，可能导致脑缺血后细胞凋亡的发生及变化浓缩等凋亡的形态学改变并不突出[5]，进一步确认不同类型脑缺血后细胞凋亡的发生及变化是必要的。本实验改进动脉内置线阻断法建立的大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型，用TUNEL法检测缺血脑区神经元凋亡的发生及分布，并结合形态学变化，研究在较温和的缺血条件下(30 min)，不同时间再灌流后神经凋亡的发生，以及在不同的损伤强度的缺血条件下(5～120 min)，再灌流48 h后细胞凋亡的发生变化，探讨脑缺血诱发细胞凋亡的时效和量效关系。
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1 资料与方法
1.1 建立大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型(动脉内置线阻断法) Wistar大鼠(雄性，200～250 g)，第一军医大学实验动物中心提供。分为假手术组、对照组、手术组。手术组又分为：①不同时间缺血(5 min，15 min，30 min，60 min，120 min)后再灌注48 h组；②30 min缺血后不同时点(6 h，12 h，24 h，48 h)再灌注组，每组4～6只大鼠。参照Zea Longa[6]方法，并在栓子上作了改进。大鼠经水合氯醛(500 mg/kg i.p.)麻醉，颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈动脉分叉部，分离、结扎颈外动脉(ECA)远端及ECA和颈内动脉(ICA)的小交通支，把4-0单股尼龙缝合线(以顶端细，后逐渐增粗的硅橡胶涂抹方法处理，约18.0～19.0 mm)插入ECA腔，沿ECA、劲动脉分叉部、ICA内渐进，至ICA颅内分叉部(MCA起点)。依实验设计，阻断MCA血流一定时点后，拔出栓子，结扎ECA切口处，恢复ICA血流。假手术组的栓子长度约15 mm，此长度的栓子不足以到达ICA的颅内分叉部。冠状冰冻切片，片厚25～35 μm。
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1.2 TTC(2，3，5triphenyltetrazolium chloride，氯化-2，3，5-三苯基四氮痤)染色 大鼠12只，60 min、120 min缺血48 h再灌流和24 h、48 h缺血后断头处死，取出大脑，观察未灌流大鼠的栓子栓塞部位。脑片或全脑置于2%TTC液，37 ℃避光温育30 min，然后转移至PBS配制的4%多聚甲醛液中固定，观察脑梗塞灶呈色。
1.3 原位细胞死亡检测—TUNEL-AP法 TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)方法[9]是一种对DNA片段和凋亡小体非常特异和敏感的分子生物学—组织化学方法。参照试剂盒和Gavrieli等[7]方法并作修改。正常神经细胞核含有相对无意义的3′-OH末端，不出现染色反应。凋亡细胞表现为核着蓝色，可破裂成小碎片；一些细胞的表面或细胞内可出现多个凋亡小体，圆或椭圆形，深蓝色，大小不一；染色体边聚，帽状或环状。坏死细胞一般为阴性染色，但由于DNA的随机切割也可能会出现部分着色，表现为更为弥散均一和不出现凋亡体的改变。
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1.4 HE染色 相邻脑切片用HE染色，观察梗塞区域，并在高倍镜下观察脑缺血损伤组织学特点、坏死性神经元特征、细胞凋亡现象。缺血区的组织学特性观察包括：神经纤维网空泡形成，嗜酸性背景的广泛苍白化，神经元核周体和星形胶质细胞核的形状及着色改变等。坏死性神经元表现为核固缩，胞浆嗜酸性，或缺乏细胞结构。
2 结果
2.1 活体观察及TTC观察梗塞范围 麻醉苏醒后，可见不同程度的对侧肢不全偏瘫，以120 min缺血/48 h再灌流组最明显，术后24～48 h为最严重，后逐渐消失。TTC作为受氢体，在组织化学中用于显示氧化还原酶的活性。TTC受H+后形成红色、光敏脂溶性的Formazen，使正常脑组织染成红色，缺血灶无此反应则显苍白色。观察的脑梗塞灶位于皮质和纹状体，呈苍白色，与MCA支配的脑区域一致，未缺血部分呈红色，说明模型制作成功。参考图谱[8]观察主要缺血部位包括：CPu(尾壳核)的尾和壳、GP(苍白球)、IC(内囊)后股、皮层(颞叶TeAud，第Ⅰ、Ⅱ感觉运动皮层S1，S2区，无粒型岛皮质后区Alp)、部分下丘脑和丘脑等。
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2.2 HE染色光镜观察 缺血区淡染，细胞数明显减少，但结构尚存；缺血周边缺血细胞体积缩小，核固缩，细胞间隙加大。油镜下观察凋亡细胞主要根据染色体固缩形成的圆或椭圆的凋亡小体，表现为致密的大小各异的暗蓝紫色团，无炎症反应，在皮质和纹状体均可见到，有些伴有坏死神经元，半影区出现大量的凋亡细胞。
2.3 原位细胞死亡检测(TUNEL法) 结果表明，假手术组和缺血对侧仅出现2～0个特异标记细胞。在量效关系上，缺血5 min/48 h再灌流组缺血脑区凋亡细胞即明显增多，分布上相差不明显；15 min组达高峰，每切片的纹状体缺血区内标记的阳性细胞达300个以上，以缺血灶内边稍多，皮层也开始散见阳性细胞；30 min组缺血灶内边阳性细胞增加更加明显，纹状体多于皮层；120 min组缺血灶内凋亡阳性细胞减少，多见于缺血灶的内边，缺血灶内散在TUNEL阳性细胞。在时效关系上，缺血30 min/6 hr再灌流组凋亡阳性细胞明显增加，主要位于纹状体缺血灶，皮层散在分布；此后维持于较高水平，皮层开始增多；48 h再灌流后阳性细胞数最多，缺血区内细胞凋亡数降低，缺血区周边出现较多的阳性细胞。不同再灌流时间后缺血脑区凋亡细胞的变化见图。
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图 缺血30 min后不同再灌流时间对缺血脑区凋亡细胞数的影响
除上述分布特点外，60 min缺血/48 h再灌流后，缺血侧一些比较多的阳性细胞部位主要出现在：扣带皮层、外侧中央前区、梨状前皮层、部分丘脑和下丘脑核团、杏仁基内外侧核等。
3 讨论
建立重复性好、反应一致和敏感性高的脑缺血动物模型是研究缺血性脑损伤发生机理及评价干预效果的重要工具。与开颅阻断大鼠脑中动脉(MCA)的局灶性脑缺血模型相比，动脉内置线阻断法不需开颅暴露MCA，方法更为简单，对脑组织的直接损伤小，能阻断豆纹动脉和其它直接从MCA发出的小皮层支，与临床上脑梗塞发生的常见类型相似，制作成脑缺血后再灌注动物模型也十分方便，因此极有可能代替开颅阻断MCA的各种方法。本研究中考虑到血管的解剖特点，以顶端细，后逐渐增粗的涂抹硅橡胶处理栓子，使进入ICA颅内时更顺畅，几乎不发生刺破ICA及其分枝的机会。解剖后发现栓子定位正确，无蛛网膜下腔出血和动脉穿孔，阻断效果明显，大大提高了手术成功率。
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凋亡小体是细胞凋亡时的特征性形态学表现。本文在高倍油镜下，在HE染色中即证实了上述凋亡的一些基本形态学变化。形态学变化常常是细胞凋亡的最初标志，并具有确实的诊断意义[9]。
细胞凋亡中最富特征性的生物化学改变是凋亡细胞的基因组DNA(genomic DNA)在琼脂糖凝胶电泳中出现典型的DNA梯(DNA ladder)。Sei等[10]发现10 min前脑缺血再灌流12 h后海马CA1区即出现DNA ladder，48 h达高峰，并延至96 h。Nitatori等[11]认为这种短暂性脑缺血引起的海马CA1区神经元延迟性死亡是由于细胞凋亡而非坏死引起的。自发性高血压大鼠MCA堵塞24 h后，用电泳方法可以在梗死中心以及缺血过渡带(半影区)检测到大量的核小体DNA[12]。然而，电泳法不能检出DNA片段形成的最初阶段，敏感性较低，也不能反映细胞凋亡发生的组织分布情况。而TUNEL染色及其定量分析为DNA片段在脑组织中的分布提供了有效的方法。原有的TUNEL方法一般要求标本切片很薄(约5 μm)，本实验中使用的较厚的冰冻切片(约30 μm)难以达到理想的检测效果，如加用蛋白酶K和延长Triton X-100穿透处理，导致背景混乱，并出现一些非特异性的细胞外染色。结合本实验大脑缺血标本的特点，本文在原有的TUNEL方法上作了进一步改进。标本用pH 6.0的柠檬酸缓冲液70 ℃30 min穿透，两次加用正常牛血清和牛血清白蛋白阻断非特异性结合，获得较理想的结果。本文以正常的缺血对侧半球为内对照，5 min缺血后48 h再灌流即出现了明显的TUNEL阳性细胞，随缺血时间的延长，凋亡主要发生于缺血区的内带，在120 min缺血后再灌流48 h出现明显的梗死灶时，大量的TUNEL阳性细胞出现于梗死灶周边的缺血半影区。结果提示，对缺血后神经元的选择坏死或凋亡而言，很大程度上可能依赖于缺血这种损伤因素的强弱(梗塞的时间和梗塞的范围)，较轻微和温和的脑缺血损伤可能以诱发细胞凋亡为主，剧烈的脑缺血损伤则以细胞坏死为主，并以缺血半影区中大量的凋亡细胞为特征。缺血时间的延长导致梗塞损伤的放大可能与半影区内细胞凋亡的发生有关。本实验也发现，在缺血神经细胞凋亡发生的时间效应方面，较温和的缺血方式(30 min阻断)后6 h后则更明显。已发现脑缺血发生后梗塞灶周围的缺血半影区仍保持有临界脑血流。临界脑血流的存在可能降低了损伤程度，使得细胞凋亡在该过渡区发生；损伤的加重，将使凋亡发生的部位向缺血区外移，从而使缺血损伤区扩大。因此，半影区中细胞凋亡的发生可能是梗塞灶扩大的关键，而该区的血流恢复进一步减轻了损伤程度，也可能使细胞凋亡的发生难以向外扩大，并可以减少坏死的程度。另外，扣带皮层、外侧中央前区、梨状前皮层、部分丘脑和下丘脑核团、杏仁基内外侧核等部位也出现较强的阳性信号，反映上述部位可能也是MCA缺血的选择性易损性的神经元。
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不同强度的脑缺血导致细胞凋亡的发生从缺血的中心部位到梗死灶周边的缺血半影区的进程提示，脑梗塞的治疗效果可能依赖于缺血半影区的部位和范围。缺血半影区中细胞凋亡发生的确立提示缺血影区的神经元损害为可逆的，也对脑缺血的治疗提供了新的线索和可能性。Linnik等[3]在大脑中动脉缺血期间，持续右脑室灌注蛋白合成抑制剂Cycloheximide(1 mg.kg-1.d-1)，24 h后明显降低皮质梗塞灶面积。腹腔注射Anisomycin，在抑制蛋白合成的同时，也可抑制全脑缺血引起的海马神经元延迟性死亡[13]。因此，从脑缺血后细胞内本身的死亡机制出发，直接着眼于细胞凋亡链中的细胞内靶成分的治疗，可能对争取半影区内神经元功能的逆转具有重要意义。
参考文献
1 Kure S, Tominga T, Yoshimoto T, et al. Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells.Biochem Biophys Res Commun,1991,179:39-45
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2 Li Y,Sharov VG,Jiang N,et al.Ultrastructural and light microscopic evidence of apoptosis after middle cerebral artery occlusion in rat.Am J Pathol，1995,146:1045-1051
3 Linnik MD,Zobrist RH,Hatfield MD.Evidence supporting a role for
programmed cell death in focal cerebral ischemia in rats.Stroke,1993,24:2002-2009
4 Zakeri ZF,Quaglino D,Latham T,et al.Delayed internucleosomal DNA fragmentation in programmed cell death.FASEBJ,1993,7:470-478
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5 Deshpande J,Bergstedt K,Linden T,et al.Ultrastructural changes in the hippocampal CA1 region following transient cerebral ischemia:evidenec against programmed cell death.Exp Brain Res,1992,88:91-05
6 Zea Longa, Weinstein PR,Carson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke，1989,19(3):109-114
7 Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.J Cell Biol,1992,119:493-501
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8 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱.第一版.北京：人民卫生出版.1991
9 Charriaut-Marlangue C, Aggoun-Zouaoui D,Represa A, et al. Apoptotic features of selective neuronal death in ischemia,epilepsy and gp 120 toxicity.Trends Neurosciences,1996,19(3):109-114
10 Sei Y, Von-Lubitz KJ,Basile AS,et al. Internucleosomal DNA fragmentation in gerbil hippocampus following forebrain ischemia.Neurosci Lett,1994,171(1-2):179-182
11 Nitatori T,Sato N,Waguri S,et al.Delayed neuronal death in the CA1 pyramidal cell layer of the gerbil hippocampus following transient ischemia is apoptosis.J Neurosci，1995,15(2):1001-1011
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12 Linnik MD,Miller JA,Sprinkle-Cavallo J,et al.Apoptotic DNA fragmentation in the rat cerebral cortex induced by permanent middle cerebral artery occlusion.Mol Brain Res，1995,32:116-124
13 Shigeno T,Yamasaki Y,Kato G,et al.Reduction of delayed neuronal death by inhibition of protein synthesis.Neurosci Lett,1990,120:117-119
(收稿：1998-08-20), 百拇医药
单位：叶建锋 高宁 广州第一军医大学基础部(510515)；李涛平 第一军医大学南方医院；舒斯云 第一军医大学珠江医院
关键词：脑缺血；细胞凋亡
中国急救医学990402 [摘 要] 目的 改进动脉内置线阻断法建立的大鼠大脑中动脉(MCA)局灶性脑缺血模型，并探讨脑缺血诱发细胞凋亡的时效和量效关系。方法 以顶端细，后逐渐增粗的涂抹硅橡胶改进栓子，TTC染色鉴定缺血效果；TUNEL-AP法和HE染色观察凋亡发生和形态学改变。结果 TTC染色证实了大脑缺血灶的的稳定出现；用TUNEL法发现，缺血30 min再灌流6 h后，凋亡阳性细胞即明显增多，48 h再灌流后阳性细胞数最多；缺血5 min再灌流48 h缺血脑区的凋亡细胞主要位于纹状体，15 min缺血组皮层也开始散见阳性细胞；随缺血时间延长，凋亡细胞主要出现在缺血区周边。结论 脑缺血可选择性诱发神经细胞凋亡。
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Improving of the model of cerebral ischemia in the rats and apoptosis induction in reperfusion after cerebral ischemia
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Basic Medical College,The First Military Medical University,Guangzhou 510515
[Abstract] Objective To improve the model of intraluminal vascular occlusion of the middle cerebral artery in rats and assess the effects of focal ischemia on apoptosis induction.Methods The embolus was smeared thin in top and than gradually thicker in the end with silicon-rubber.The TTC staining was employed to appraise the ischemic effect.The TUNEL labeling and HE staining were used to detect apoptotic cells and morphologic changes in ischemic brain.Results The occlusion of ipsilateral MCA produced well-defined lesions that could be visualized with TTC staining.With the TUNEL labeling,apoptotic cells was increased as early as 6 hours after 30-min MCA occlusion and peaked at 48-hour reperfusion.Apoptotic cell increased in striatum after 5-min ischemia and 48-hour reperfusion,and scattered in the cortex after 15-min ischemia.With the time of ischemia prolonged,groups of apoptotic cells were primarily localized to the inner boundary zone of the infarct.Conclusion Neurocyte apoptosis can be selectivity induced in ischemic brain.
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[Key words] Cerebral ischemia Apoptosis
细胞凋亡是通过触发细胞内专门负责细胞死亡信号感知、调控和死亡效应执行的一整套基因程序后而发生的，以细胞DNA早期降解为特征、具有特征性形态变化和生化改变的细胞主动死亡过程。在发育成熟的神经系统中，细胞凋亡有可能在各种细胞操作性刺激下被触发或持续发生[1]。在不同的脑缺血模型中，脑缺血可以诱发一些细胞凋亡的形态学变化和核小体DNA片段的生成[2，3]。由于不同的细胞系统在发生凋亡时的动力学过程不尽一致，发生的细胞形态学改变也具有不同的差异[4]，可能导致脑缺血后细胞凋亡的发生及变化浓缩等凋亡的形态学改变并不突出[5]，进一步确认不同类型脑缺血后细胞凋亡的发生及变化是必要的。本实验改进动脉内置线阻断法建立的大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型，用TUNEL法检测缺血脑区神经元凋亡的发生及分布，并结合形态学变化，研究在较温和的缺血条件下(30 min)，不同时间再灌流后神经凋亡的发生，以及在不同的损伤强度的缺血条件下(5～120 min)，再灌流48 h后细胞凋亡的发生变化，探讨脑缺血诱发细胞凋亡的时效和量效关系。
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1 资料与方法
1.1 建立大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型(动脉内置线阻断法) Wistar大鼠(雄性，200～250 g)，第一军医大学实验动物中心提供。分为假手术组、对照组、手术组。手术组又分为：①不同时间缺血(5 min，15 min，30 min，60 min，120 min)后再灌注48 h组；②30 min缺血后不同时点(6 h，12 h，24 h，48 h)再灌注组，每组4～6只大鼠。参照Zea Longa[6]方法，并在栓子上作了改进。大鼠经水合氯醛(500 mg/kg i.p.)麻醉，颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈动脉分叉部，分离、结扎颈外动脉(ECA)远端及ECA和颈内动脉(ICA)的小交通支，把4-0单股尼龙缝合线(以顶端细，后逐渐增粗的硅橡胶涂抹方法处理，约18.0～19.0 mm)插入ECA腔，沿ECA、劲动脉分叉部、ICA内渐进，至ICA颅内分叉部(MCA起点)。依实验设计，阻断MCA血流一定时点后，拔出栓子，结扎ECA切口处，恢复ICA血流。假手术组的栓子长度约15 mm，此长度的栓子不足以到达ICA的颅内分叉部。冠状冰冻切片，片厚25～35 μm。
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1.2 TTC(2，3，5triphenyltetrazolium chloride，氯化-2，3，5-三苯基四氮痤)染色 大鼠12只，60 min、120 min缺血48 h再灌流和24 h、48 h缺血后断头处死，取出大脑，观察未灌流大鼠的栓子栓塞部位。脑片或全脑置于2%TTC液，37 ℃避光温育30 min，然后转移至PBS配制的4%多聚甲醛液中固定，观察脑梗塞灶呈色。
1.3 原位细胞死亡检测—TUNEL-AP法 TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)方法[9]是一种对DNA片段和凋亡小体非常特异和敏感的分子生物学—组织化学方法。参照试剂盒和Gavrieli等[7]方法并作修改。正常神经细胞核含有相对无意义的3′-OH末端，不出现染色反应。凋亡细胞表现为核着蓝色，可破裂成小碎片；一些细胞的表面或细胞内可出现多个凋亡小体，圆或椭圆形，深蓝色，大小不一；染色体边聚，帽状或环状。坏死细胞一般为阴性染色，但由于DNA的随机切割也可能会出现部分着色，表现为更为弥散均一和不出现凋亡体的改变。
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1.4 HE染色 相邻脑切片用HE染色，观察梗塞区域，并在高倍镜下观察脑缺血损伤组织学特点、坏死性神经元特征、细胞凋亡现象。缺血区的组织学特性观察包括：神经纤维网空泡形成，嗜酸性背景的广泛苍白化，神经元核周体和星形胶质细胞核的形状及着色改变等。坏死性神经元表现为核固缩，胞浆嗜酸性，或缺乏细胞结构。
2 结果
2.1 活体观察及TTC观察梗塞范围 麻醉苏醒后，可见不同程度的对侧肢不全偏瘫，以120 min缺血/48 h再灌流组最明显，术后24～48 h为最严重，后逐渐消失。TTC作为受氢体，在组织化学中用于显示氧化还原酶的活性。TTC受H+后形成红色、光敏脂溶性的Formazen，使正常脑组织染成红色，缺血灶无此反应则显苍白色。观察的脑梗塞灶位于皮质和纹状体，呈苍白色，与MCA支配的脑区域一致，未缺血部分呈红色，说明模型制作成功。参考图谱[8]观察主要缺血部位包括：CPu(尾壳核)的尾和壳、GP(苍白球)、IC(内囊)后股、皮层(颞叶TeAud，第Ⅰ、Ⅱ感觉运动皮层S1，S2区，无粒型岛皮质后区Alp)、部分下丘脑和丘脑等。
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2.2 HE染色光镜观察 缺血区淡染，细胞数明显减少，但结构尚存；缺血周边缺血细胞体积缩小，核固缩，细胞间隙加大。油镜下观察凋亡细胞主要根据染色体固缩形成的圆或椭圆的凋亡小体，表现为致密的大小各异的暗蓝紫色团，无炎症反应，在皮质和纹状体均可见到，有些伴有坏死神经元，半影区出现大量的凋亡细胞。
2.3 原位细胞死亡检测(TUNEL法) 结果表明，假手术组和缺血对侧仅出现2～0个特异标记细胞。在量效关系上，缺血5 min/48 h再灌流组缺血脑区凋亡细胞即明显增多，分布上相差不明显；15 min组达高峰，每切片的纹状体缺血区内标记的阳性细胞达300个以上，以缺血灶内边稍多，皮层也开始散见阳性细胞；30 min组缺血灶内边阳性细胞增加更加明显，纹状体多于皮层；120 min组缺血灶内凋亡阳性细胞减少，多见于缺血灶的内边，缺血灶内散在TUNEL阳性细胞。在时效关系上，缺血30 min/6 hr再灌流组凋亡阳性细胞明显增加，主要位于纹状体缺血灶，皮层散在分布；此后维持于较高水平，皮层开始增多；48 h再灌流后阳性细胞数最多，缺血区内细胞凋亡数降低，缺血区周边出现较多的阳性细胞。不同再灌流时间后缺血脑区凋亡细胞的变化见图。
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图 缺血30 min后不同再灌流时间对缺血脑区凋亡细胞数的影响
除上述分布特点外，60 min缺血/48 h再灌流后，缺血侧一些比较多的阳性细胞部位主要出现在：扣带皮层、外侧中央前区、梨状前皮层、部分丘脑和下丘脑核团、杏仁基内外侧核等。
3 讨论
建立重复性好、反应一致和敏感性高的脑缺血动物模型是研究缺血性脑损伤发生机理及评价干预效果的重要工具。与开颅阻断大鼠脑中动脉(MCA)的局灶性脑缺血模型相比，动脉内置线阻断法不需开颅暴露MCA，方法更为简单，对脑组织的直接损伤小，能阻断豆纹动脉和其它直接从MCA发出的小皮层支，与临床上脑梗塞发生的常见类型相似，制作成脑缺血后再灌注动物模型也十分方便，因此极有可能代替开颅阻断MCA的各种方法。本研究中考虑到血管的解剖特点，以顶端细，后逐渐增粗的涂抹硅橡胶处理栓子，使进入ICA颅内时更顺畅，几乎不发生刺破ICA及其分枝的机会。解剖后发现栓子定位正确，无蛛网膜下腔出血和动脉穿孔，阻断效果明显，大大提高了手术成功率。
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凋亡小体是细胞凋亡时的特征性形态学表现。本文在高倍油镜下，在HE染色中即证实了上述凋亡的一些基本形态学变化。形态学变化常常是细胞凋亡的最初标志，并具有确实的诊断意义[9]。
细胞凋亡中最富特征性的生物化学改变是凋亡细胞的基因组DNA(genomic DNA)在琼脂糖凝胶电泳中出现典型的DNA梯(DNA ladder)。Sei等[10]发现10 min前脑缺血再灌流12 h后海马CA1区即出现DNA ladder，48 h达高峰，并延至96 h。Nitatori等[11]认为这种短暂性脑缺血引起的海马CA1区神经元延迟性死亡是由于细胞凋亡而非坏死引起的。自发性高血压大鼠MCA堵塞24 h后，用电泳方法可以在梗死中心以及缺血过渡带(半影区)检测到大量的核小体DNA[12]。然而，电泳法不能检出DNA片段形成的最初阶段，敏感性较低，也不能反映细胞凋亡发生的组织分布情况。而TUNEL染色及其定量分析为DNA片段在脑组织中的分布提供了有效的方法。原有的TUNEL方法一般要求标本切片很薄(约5 μm)，本实验中使用的较厚的冰冻切片(约30 μm)难以达到理想的检测效果，如加用蛋白酶K和延长Triton X-100穿透处理，导致背景混乱，并出现一些非特异性的细胞外染色。结合本实验大脑缺血标本的特点，本文在原有的TUNEL方法上作了进一步改进。标本用pH 6.0的柠檬酸缓冲液70 ℃30 min穿透，两次加用正常牛血清和牛血清白蛋白阻断非特异性结合，获得较理想的结果。本文以正常的缺血对侧半球为内对照，5 min缺血后48 h再灌流即出现了明显的TUNEL阳性细胞，随缺血时间的延长，凋亡主要发生于缺血区的内带，在120 min缺血后再灌流48 h出现明显的梗死灶时，大量的TUNEL阳性细胞出现于梗死灶周边的缺血半影区。结果提示，对缺血后神经元的选择坏死或凋亡而言，很大程度上可能依赖于缺血这种损伤因素的强弱(梗塞的时间和梗塞的范围)，较轻微和温和的脑缺血损伤可能以诱发细胞凋亡为主，剧烈的脑缺血损伤则以细胞坏死为主，并以缺血半影区中大量的凋亡细胞为特征。缺血时间的延长导致梗塞损伤的放大可能与半影区内细胞凋亡的发生有关。本实验也发现，在缺血神经细胞凋亡发生的时间效应方面，较温和的缺血方式(30 min阻断)后6 h后则更明显。已发现脑缺血发生后梗塞灶周围的缺血半影区仍保持有临界脑血流。临界脑血流的存在可能降低了损伤程度，使得细胞凋亡在该过渡区发生；损伤的加重，将使凋亡发生的部位向缺血区外移，从而使缺血损伤区扩大。因此，半影区中细胞凋亡的发生可能是梗塞灶扩大的关键，而该区的血流恢复进一步减轻了损伤程度，也可能使细胞凋亡的发生难以向外扩大，并可以减少坏死的程度。另外，扣带皮层、外侧中央前区、梨状前皮层、部分丘脑和下丘脑核团、杏仁基内外侧核等部位也出现较强的阳性信号，反映上述部位可能也是MCA缺血的选择性易损性的神经元。
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不同强度的脑缺血导致细胞凋亡的发生从缺血的中心部位到梗死灶周边的缺血半影区的进程提示，脑梗塞的治疗效果可能依赖于缺血半影区的部位和范围。缺血半影区中细胞凋亡发生的确立提示缺血影区的神经元损害为可逆的，也对脑缺血的治疗提供了新的线索和可能性。Linnik等[3]在大脑中动脉缺血期间，持续右脑室灌注蛋白合成抑制剂Cycloheximide(1 mg.kg-1.d-1)，24 h后明显降低皮质梗塞灶面积。腹腔注射Anisomycin，在抑制蛋白合成的同时，也可抑制全脑缺血引起的海马神经元延迟性死亡[13]。因此，从脑缺血后细胞内本身的死亡机制出发，直接着眼于细胞凋亡链中的细胞内靶成分的治疗，可能对争取半影区内神经元功能的逆转具有重要意义。
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(收稿：1998-08-20), 百拇医药