巴戟素补肾健脑作用的神经活动基础
作者：陈洁文 王勇 谭宝璇 陈朝凤
单位：广州中医药大学生理教研室，广州 510405
关键词：巴戟天/药理学；@巴戟素/药理学；海马/药物作用；脑缺氧/中药疗法；记忆/药物作用；一氧化氮/拮抗剂和抑制剂
广州中医药大学学报990419摘要：巴戟素是广州中医药大学新近从补肾中药巴戟天中提取的一种糖类单体物。为探讨巴戟素的补肾健脑的神经作用机制，本实验以大鼠离体海马脑片为标本，从细胞分子水平上观察巴戟素对大鼠海马脑片缺氧状态下的诱发群锋电位(population spike，PS)和突触传递长时程增强(long term potentiation,LTP)的影响。结果观察到巴戟素对脑缺氧损伤具有保护作用，并能增强脑的记忆功能；并观察到其作用机制与一氧化氮(NO)有一定关系。实验结果从神经活动角度为中医补肾健脑理论增补了现代科学内容，同时对开发巴戟素的临床应用提供了实验依据。
, 百拇医药
分类号：R285.5 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(1999)04-0314-04
Neuroactivities Basis of BA-JI-SU in Invigorating Kidney
to Improve Mental Power
CHEN Jiewen WANG Yong TAN Baoxuan CHEN Chaofeng
(Dept. of Physiology, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405，China)
Abstract: BA-JI-SU is a kind of monosaccharide extracted from Radix Morindae Officinalis. In this study, hippocampal slices of rats were employed to investigate the effects of BA-JI-SU on memory and neurons in anoxic condition and its mechanism. The results showed that BA-JI-SU could enhance the long_term potentiation(LTP),prolong the starting decreasing time and disappearing time of the amplitude of population spike(PS) in anoxic condition,increase the recovery rate after reoxygenation.Its mechanism was in relation with the level of nitric oxide(NO) in hippocampus. These results indicated that BA-JI-SU could increase the memory and protect neurons from anoxic injury. These supply experimental evidences for the clinical practice of BA-JI-SU.
, 百拇医药
Key words: MORINDA OFFICINALIS/pharmacology; @BAJISU/pharmacology;
HIPPOCAMPUS/drug effects; CEREBRAL ANOXIA/TCD therapy;
MEMORY/drug effects; NITRIC OXIDE/antag.
近年有报道用补肾健脑方药治疗脑萎缩和小儿脑功能障碍，均取得良好疗效[1]。中药巴戟天(morinda officinalis How.)，入肝肾经，有强筋骨、安五脏、补中增志和益气等作用。本校新近从巴戟天中提取出一种糖类单体物，名为巴戟素。初步实验表明，它能显著提高果蝇的性活力和幼虫羽化率[2]，临床初步观察对改善老年性痴呆患者的记忆有一定效果。
, http://www.100md.com 现代医学认为，海马是记忆的重要部位，且对缺氧十分敏感。在离体海马脑片记录的诱发群锋电位(population spike，PS)被认为是脑组织中突触传递信息的重要指标[3]。对脑片施加一定频率和串长的强直刺激，可使 PS 的振幅显著增大达 50% 以上，并持续 10 h 以上，此种突触传递的易化现象，称突触传递长时程增强(long term potentiation，LTP)，被认为是神经元信息贮存过程中突触活动的反映，从而广泛应用于学习、记忆功能的研究[4]。
本课题应用离体脑片技术，围绕保护脑细胞缺氧损伤和提高脑的记忆功能两个重要方面，观察巴戟素对大鼠海马脑片缺氧状态下 PS 变化和 LTP 的影响，研究补肾中药保护脑细胞和增强记忆功能的神经活动基础，为阐发中医的补肾健脑理论和开发巴戟素的临床应用提供科学依据和实验基础。
1 材料和方法
1.1 动物 健康 Wistar 大鼠(清洁级)，雄性，体重 120～160 g，由中山医科大学实验动物中心供应。
, 百拇医药
1.2 仪器 RM-6004 型四导生理记录仪；VC-10A 型记忆示波器；MEZ-8201 型微电极放大器；PFS-48 型微电极推进器；SNE-7103 型刺激器；SS-102J 型隔离器(以上均为日本光电公司产品)。另有 WJ-1 型数显直流控温仪(第一军医大学研制)；XTB-A 型连续变倍显微镜(桂林光学仪器厂产品)；玻璃微电极拉制器；振动 切 片 机；水浴恒温箱等。
1.3 药品 巴戟素，灰白色粉末，由本校新药开发所提供。NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)，白色粉末，由中山医科大学生理室提供。配制人工脑脊液(ACSF)的各种试剂均为分析纯，双蒸水配制，pH7.3～7.4。
1.4 大鼠海马脑片制备和诱发群锋电位引导 叩击大鼠颈背部致昏，迅即开颅取脑，剥离海马，沿其长轴切成厚约 400 μm 的脑薄片，置于 ACSF 中孵育 2～4 h 后移入恒温供氧浴槽中稳定 10 min。电刺激 CA3 区的 Schaffer 侧支以诱发 CA1 区锥体细胞层的 QS，用玻璃微电极行胞外记录[5，6]。
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1.5 脑片缺氧和复氧的方法和时间 引导和记录出 PS 后，持续稳定 15 min，其间 PS 幅值变化不超过 5% 者为合格标本。用 95%N2+5%CO2 混合气体替换 95%O2+5%CO2 行脑片缺氧，观察 PS 幅值开始减小(-10%)时间和 PS 消失(-90%)时间(min)。持续缺氧 20 min 后即行恢复供氧，30 min 内 PS 幅值恢复达到原幅值 90% 以上者计入恢复的脑片数。
1.6 大鼠海马脑片 LTP 的诱导和数据分析
先引导稳定的 CA1区PS，然后寻求测试刺激值，稳定 10 min 后，再施加频率 20 Hz，串长 10 s，波宽 200 μs 的强直刺激(TS)以诱发 LTP。用 PS 幅值比强直刺激前增大的百分率反映 LTP 的变化。记录时间持续 50 min，其间每 5 min取 5 个 PS 的幅值求其平均值，再将1/2 h 内的 6 个数值进行平均，求得 TS 后的PS 幅值[7]。
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2 实验结果
2.1 巴戟素对脑片缺氧、复氧中 PS 变化的影响 实验设对照组和巴戟素A、B、C组，待引导的 PS 稳定 15 min 后，用微量注射器沿浴槽边缘缓慢加入已配制成一定浓度的巴戟素溶液0.1 mL，使巴戟素在浴槽中的终浓度分别为 10 mg/L、100 mg/L和 500 mg/L，对照组则加入等量ACSF。各组观察 30 min 后，依次进行缺氧和复氧实验(表1，图1，图2)。结果显示，巴戟素能显著延长缺氧状态下 PS 幅值开始减小时间(t1)、PS 消失时间(t2)和复氧后 PS 恢复率，且呈一定量效关系。提示巴戟素具有提高脑片耐缺氧能力，并对其缺氧损伤具有显著的保护作用。
表1 巴戟素对脑片缺氧复氧时 PS 变化的影响 (
±s) 组 别
, 百拇医药
N/片
t1/min
t2/min
pPS恢复/%
对 照 组
8
1.78±1.20
4.16±1.30
50
巴戟素A组
8
1.95±1.18
, 百拇医药
4.22±1.55
50
巴戟素B组
8
3.68±1.52*
7.78±2.96**
75
巴戟素C组
8
7.12±2.86***
14.88±4.23***
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100**
*与对照组比较P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
图1 对照组缺氧时PS的变化
图2 巴戟素(0.1g/L)对脑片缺氧时PS变化的影响
2.2 巴戟素对脑片缺氧损伤保护与 NO 的关系 实验设 ACSF 组(对照组)、巴戟素组(10 mg/L)、L-NAME 组(10-6 mol/L)和巴戟素 +L-NAME 组。ACSF 组和巴戟素组加药和缺氧、复氧程序与2.1项实验相同。L-NAME 组加药和缺氧、复氧程序与巴戟素组相同。巴戟素+L-NAME 组则先加巴戟素 15 min 后，再加入 L-NAME，观察 15 min，然后给予缺氧、复氧(表2)。
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表2 各组脑片缺氧复氧时PS的变化(±s) 组 别
N/片
t1/min
t2/min
pPS恢复/%
ACSF组
8
1.78±1.20***
4.16±1.30***
, http://www.100md.com 50.0*
巴戟素组
8
1.95±1.18***
4.22±1.55***
50.0*
L-NAME组
6
7.30±2.96**△△
16.52±5.36**△△△
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83.3
L-NAME
+巴戟素组
6
15.00±4.89△△△
>20.00△△△
100.0△
**各组与巴戟素+L-NAME组比较P<0.01,***P<0.001；△各组与ACSF组比较P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001
结果显示，在单纯巴戟素组，缺氧和复氧对脑片的 PS 变化均未见影响，因为此时巴戟素尚末达到有效浓度。在单纯 L-NAME 组，可见到缺氧时t1和t2明显延长，并提高 PS恢复率。在巴戟素+L-NAME 组，虽然巴戟素未达到影响 PS 变化的有效浓度，但由于与 NO 合成酶抑制剂 L-NAME 的作用相加，使拮抗缺氧对 PS 影响的能力明显高于单纯 L-NAME 组，提示巴戟素可能具有抑制 NO 生成或对抗 NO 毒性的作用，当其与 L-NAME 协同作用下，显示出对脑细胞缺氧损伤具有更强的保护作用(但也不排除另有途径)。
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2.3 巴戟素对脑片 LTP 的增强效应 实验设对照组和巴戟素A、B组，巴戟素是在 PS 稳定 10 min 后加入，浴槽中的终浓度分别为 10 mg/L和 100 mg/L。对照组加入等量 ACSF。3 组均在加药或液后再稳定 10 min，然后施加强直刺激，观察、记录脑片 PS 幅值增大率(表3，图3，图4)。结果显示，巴戟素对大鼠海马脑片的 LTP 效应具有明显增强作用，且呈一定的量效关系，提示巴戟素可增强脑的学习记忆功能。
图3 对照组强直刺激后PS幅值的变化
图4 巴戟素(0.1g/L)强直刺激后后PS变化的影响
表3 巴戟素对脑片 LTP 的增强效应 (±s) 组 别
, 百拇医药
N/片
pPS幅值增大/%
对照组(ACSF)
9
84.46±13.15
巴戟素A组(10 mg/L)
9
113.22±18.12**
巴戟素B组(100 mg/L)
9
191.80±23.44***
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**与对照组比较P<0.01，***P<0.001
2.4 巴戟素增强脑片 LTP 效应与 NO 的关系 先前的工作证明，NO 对 LTP 的形成与维持有促进作用，当向浴槽中滴加 NO 的前体物 L-Arg 时，可使脑片的 LTP 增强；反之，滴加L-NAME 时，则使 LTP 减弱。本实验设 L-NAME 组和巴戟素+L-NAME 组。巴戟素在施加 TS 前给药； L-NAME 给药时间两组均在施加 TS 后 30 min 确定已产生 LTP 后才加入。结果显示，巴戟素+L-NAME 组在加入 L-NAME 后，可见 LTP 效应显著下降，其下降程度明显大于 L-NAME 组，两组的差异有显著性(表4)，提示巴戟素增强 LTP 的效应与 NO 的促进作用有关。
表4 两组加 L-NAME 前后 LTP 效应比较(±s) 组 别
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N/片
(VPS幅值/mV)/(加L-NAME前 加L-NAME后)
pPS幅值减少
/%
L-NAME组
5
2.55±0.75
1.94±0.52
23.80±4.95
巴戟素+
L-NAME组
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5
4.19±0.89
2.75±0.64
34.61±2.95**
**与L-NAME组比较P<0.01；L-NAME 终浓度均为 10-6 mol/L，巴戟素终浓度为 100 mg/L
3 讨论
保护脑功能，开发人脑的潜力是当今生命科学的重大课题。中医十分重视人的肾气，认为肾与脑有密切联系，通过补肾可以生髓益脑，增强人的智慧。本研究主要是探讨巴戟素补肾健脑的神经作用机制。结果证明，巴戟素明显增强 LTP 效应，同时延长缺氧时 PS 消失时间和降低脑细胞缺氧损伤。表明它具有增强神经元的信息贮存和突触传递功能，同时又能在缺氧状态下起保护脑细胞的作用。鉴于巴戟素这一药理作用，加上药源丰富，副作用小，服用方便的特点，很可能开发为一种极具应用前景的补肾健脑药物，用于促进脑的正常发育、延缓脑衰老，预防中老年脑萎缩发生以至防治老年性痴呆等。
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大量研究证明，LTP 反应强度与记忆功能有显著相关性[8]。业已证明，突触前兴奋性氨基酸释放、突触后 NMDA 受体激活、Ca2+内流、蛋白激酶 C 激活、基因活动及蛋白质合成等对于 LTP 产生和维持具有重要作用[9]。新近发现，逆行信使 NO 在其中起着关键作用。大多数学者认为 NO 产生于突触后，随之 散到胞外，参与调控突触前膜功能，是 LTP 产生的必要条件[10]，但亦有报道 NO 并非 LTP 产生所必需。我们的研究表明，加入 L-NAME 可抑制脑片 LTP 的反应强度，加入 L-Arg 则能加强 LTP 效应，表明 NO 对 LTP 形成与维持有促进作用。巴戟素增强 LTP 效应与其促进 NO 生成有密切关系。
有关研究证明，兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙超载和自由基增多是脑缺血缺氧损伤的主要发病机制[11]。有实验报道，脑缺血早期，NO 突然增多，30 min 后达高峰，并认为NO 能介导谷氨酸的神经毒性作用，高浓度的 NO 还能最终抑制线粒体呼吸而对细胞产生直接毒性作用[12，13]。本实验结果显示 L-NAME 对脑细胞缺氧损伤有明显保护作用，支持 NO 毒性参与急性脑缺血损伤作用的观点。至于巴戟素对脑细胞缺氧损伤所起的保护作用，是否与其对抗自由基生成，增加能源供应或对抗 NO 的毒性作用等有关，有待进一步研究。
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基金项目：国家中医药管理局科研基金课题(编号：97L025)
作者简介：陈洁文，女，教授；
参考文献：
[1] 王贵林.补肾健脑化瘀法治疗脑萎缩35例[J].中医药信息，1996，13(1)：3
[2] 林励，徐鸿华，邓沛峰.巴戟天多糖对果蝇性活力及羽化率的影响[J].中药资源开发利用研究论文集[C].广州：广东科技出版社，1996.65
[3] 丁爱石，黄福庆，解夏平.缺氧对大鼠海马脑片诱发电位的影响[J].中国应用生理学杂志，1992，8(2)：169
[4] 韩太真.关于长时程增强形成机理的研究进展[J].生理科学进展，1994，25(1)：60
, 百拇医药
[5] 陈洁文，谭宝璇，苏文.毛冬青甲素对脑细胞缺氧损伤的保护及其机制实验研究[J].广州中医药大学学报，1997，14(2)：97
[6] 景健，解夏平，王大佑.大鼠离体海马脑片缺氧耐受性的研究[J].基础医学与临床，1992，12(3)：39
[7] Matthies H.In search of cellular mechanism of memory[J].Prog.Neurobiol.1989，32：277
[8] 李永新，梅镇彤.长时程增强的形成机制及其与学习记忆的相关性[J].生理科学进展，1993，24(3)：278
[9] 韩太真，吴馥梅.学习与记忆的神经生物学[M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998.302
, 百拇医药
[10] 胡志安.海马突触传递长时程增强效应中的逆行信使[J].生理科学进展，1996，27(1)：82
[11] 郑彩梅.缺氧与缺血性脑血管病神经元损伤的研究进展[J].国外医学*脑血管疾病分册，1993，1(1)：6
[12] 王仁刚.NO在神经系统中的作用[J].生理科学进展，1994，25(1)：73
[13] Buisson A.Mechanism involved in the neuroprotective activity of a nitric oxide synthase inhibitor during focal cerebral ischemia[J]. J Neurochem.,1993,61:690
收稿日期：1999-09-01, http://www.100md.com
单位：广州中医药大学生理教研室，广州 510405
关键词：巴戟天/药理学；@巴戟素/药理学；海马/药物作用；脑缺氧/中药疗法；记忆/药物作用；一氧化氮/拮抗剂和抑制剂
广州中医药大学学报990419摘要：巴戟素是广州中医药大学新近从补肾中药巴戟天中提取的一种糖类单体物。为探讨巴戟素的补肾健脑的神经作用机制，本实验以大鼠离体海马脑片为标本，从细胞分子水平上观察巴戟素对大鼠海马脑片缺氧状态下的诱发群锋电位(population spike，PS)和突触传递长时程增强(long term potentiation,LTP)的影响。结果观察到巴戟素对脑缺氧损伤具有保护作用，并能增强脑的记忆功能；并观察到其作用机制与一氧化氮(NO)有一定关系。实验结果从神经活动角度为中医补肾健脑理论增补了现代科学内容，同时对开发巴戟素的临床应用提供了实验依据。
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分类号：R285.5 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(1999)04-0314-04
Neuroactivities Basis of BA-JI-SU in Invigorating Kidney
to Improve Mental Power
CHEN Jiewen WANG Yong TAN Baoxuan CHEN Chaofeng
(Dept. of Physiology, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405，China)
Abstract: BA-JI-SU is a kind of monosaccharide extracted from Radix Morindae Officinalis. In this study, hippocampal slices of rats were employed to investigate the effects of BA-JI-SU on memory and neurons in anoxic condition and its mechanism. The results showed that BA-JI-SU could enhance the long_term potentiation(LTP),prolong the starting decreasing time and disappearing time of the amplitude of population spike(PS) in anoxic condition,increase the recovery rate after reoxygenation.Its mechanism was in relation with the level of nitric oxide(NO) in hippocampus. These results indicated that BA-JI-SU could increase the memory and protect neurons from anoxic injury. These supply experimental evidences for the clinical practice of BA-JI-SU.
, 百拇医药
Key words: MORINDA OFFICINALIS/pharmacology; @BAJISU/pharmacology;
HIPPOCAMPUS/drug effects; CEREBRAL ANOXIA/TCD therapy;
MEMORY/drug effects; NITRIC OXIDE/antag.
近年有报道用补肾健脑方药治疗脑萎缩和小儿脑功能障碍，均取得良好疗效[1]。中药巴戟天(morinda officinalis How.)，入肝肾经，有强筋骨、安五脏、补中增志和益气等作用。本校新近从巴戟天中提取出一种糖类单体物，名为巴戟素。初步实验表明，它能显著提高果蝇的性活力和幼虫羽化率[2]，临床初步观察对改善老年性痴呆患者的记忆有一定效果。
, http://www.100md.com 现代医学认为，海马是记忆的重要部位，且对缺氧十分敏感。在离体海马脑片记录的诱发群锋电位(population spike，PS)被认为是脑组织中突触传递信息的重要指标[3]。对脑片施加一定频率和串长的强直刺激，可使 PS 的振幅显著增大达 50% 以上，并持续 10 h 以上，此种突触传递的易化现象，称突触传递长时程增强(long term potentiation，LTP)，被认为是神经元信息贮存过程中突触活动的反映，从而广泛应用于学习、记忆功能的研究[4]。
本课题应用离体脑片技术，围绕保护脑细胞缺氧损伤和提高脑的记忆功能两个重要方面，观察巴戟素对大鼠海马脑片缺氧状态下 PS 变化和 LTP 的影响，研究补肾中药保护脑细胞和增强记忆功能的神经活动基础，为阐发中医的补肾健脑理论和开发巴戟素的临床应用提供科学依据和实验基础。
1 材料和方法
1.1 动物 健康 Wistar 大鼠(清洁级)，雄性，体重 120～160 g，由中山医科大学实验动物中心供应。
, 百拇医药
1.2 仪器 RM-6004 型四导生理记录仪；VC-10A 型记忆示波器；MEZ-8201 型微电极放大器；PFS-48 型微电极推进器；SNE-7103 型刺激器；SS-102J 型隔离器(以上均为日本光电公司产品)。另有 WJ-1 型数显直流控温仪(第一军医大学研制)；XTB-A 型连续变倍显微镜(桂林光学仪器厂产品)；玻璃微电极拉制器；振动 切 片 机；水浴恒温箱等。
1.3 药品 巴戟素，灰白色粉末，由本校新药开发所提供。NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)，白色粉末，由中山医科大学生理室提供。配制人工脑脊液(ACSF)的各种试剂均为分析纯，双蒸水配制，pH7.3～7.4。
1.4 大鼠海马脑片制备和诱发群锋电位引导 叩击大鼠颈背部致昏，迅即开颅取脑，剥离海马，沿其长轴切成厚约 400 μm 的脑薄片，置于 ACSF 中孵育 2～4 h 后移入恒温供氧浴槽中稳定 10 min。电刺激 CA3 区的 Schaffer 侧支以诱发 CA1 区锥体细胞层的 QS，用玻璃微电极行胞外记录[5，6]。
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1.5 脑片缺氧和复氧的方法和时间 引导和记录出 PS 后，持续稳定 15 min，其间 PS 幅值变化不超过 5% 者为合格标本。用 95%N2+5%CO2 混合气体替换 95%O2+5%CO2 行脑片缺氧，观察 PS 幅值开始减小(-10%)时间和 PS 消失(-90%)时间(min)。持续缺氧 20 min 后即行恢复供氧，30 min 内 PS 幅值恢复达到原幅值 90% 以上者计入恢复的脑片数。
1.6 大鼠海马脑片 LTP 的诱导和数据分析
先引导稳定的 CA1区PS，然后寻求测试刺激值，稳定 10 min 后，再施加频率 20 Hz，串长 10 s，波宽 200 μs 的强直刺激(TS)以诱发 LTP。用 PS 幅值比强直刺激前增大的百分率反映 LTP 的变化。记录时间持续 50 min，其间每 5 min取 5 个 PS 的幅值求其平均值，再将1/2 h 内的 6 个数值进行平均，求得 TS 后的PS 幅值[7]。
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2 实验结果
2.1 巴戟素对脑片缺氧、复氧中 PS 变化的影响 实验设对照组和巴戟素A、B、C组，待引导的 PS 稳定 15 min 后，用微量注射器沿浴槽边缘缓慢加入已配制成一定浓度的巴戟素溶液0.1 mL，使巴戟素在浴槽中的终浓度分别为 10 mg/L、100 mg/L和 500 mg/L，对照组则加入等量ACSF。各组观察 30 min 后，依次进行缺氧和复氧实验(表1，图1，图2)。结果显示，巴戟素能显著延长缺氧状态下 PS 幅值开始减小时间(t1)、PS 消失时间(t2)和复氧后 PS 恢复率，且呈一定量效关系。提示巴戟素具有提高脑片耐缺氧能力，并对其缺氧损伤具有显著的保护作用。
表1 巴戟素对脑片缺氧复氧时 PS 变化的影响 (
±s) 组 别, 百拇医药
N/片
t1/min
t2/min
pPS恢复/%
对 照 组
8
1.78±1.20
4.16±1.30
50
巴戟素A组
8
1.95±1.18
, 百拇医药
4.22±1.55
50
巴戟素B组
8
3.68±1.52*
7.78±2.96**
75
巴戟素C组
8
7.12±2.86***
14.88±4.23***
, http://www.100md.com
100**
*与对照组比较P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
图1 对照组缺氧时PS的变化
图2 巴戟素(0.1g/L)对脑片缺氧时PS变化的影响
2.2 巴戟素对脑片缺氧损伤保护与 NO 的关系 实验设 ACSF 组(对照组)、巴戟素组(10 mg/L)、L-NAME 组(10-6 mol/L)和巴戟素 +L-NAME 组。ACSF 组和巴戟素组加药和缺氧、复氧程序与2.1项实验相同。L-NAME 组加药和缺氧、复氧程序与巴戟素组相同。巴戟素+L-NAME 组则先加巴戟素 15 min 后，再加入 L-NAME，观察 15 min，然后给予缺氧、复氧(表2)。
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表2 各组脑片缺氧复氧时PS的变化(
±s) 组 别N/片
t1/min
t2/min
pPS恢复/%
ACSF组
8
1.78±1.20***
4.16±1.30***
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巴戟素组
8
1.95±1.18***
4.22±1.55***
50.0*
L-NAME组
6
7.30±2.96**△△
16.52±5.36**△△△
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83.3
L-NAME
+巴戟素组
6
15.00±4.89△△△
>20.00△△△
100.0△
**各组与巴戟素+L-NAME组比较P<0.01,***P<0.001；△各组与ACSF组比较P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001
结果显示，在单纯巴戟素组，缺氧和复氧对脑片的 PS 变化均未见影响，因为此时巴戟素尚末达到有效浓度。在单纯 L-NAME 组，可见到缺氧时t1和t2明显延长，并提高 PS恢复率。在巴戟素+L-NAME 组，虽然巴戟素未达到影响 PS 变化的有效浓度，但由于与 NO 合成酶抑制剂 L-NAME 的作用相加，使拮抗缺氧对 PS 影响的能力明显高于单纯 L-NAME 组，提示巴戟素可能具有抑制 NO 生成或对抗 NO 毒性的作用，当其与 L-NAME 协同作用下，显示出对脑细胞缺氧损伤具有更强的保护作用(但也不排除另有途径)。
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2.3 巴戟素对脑片 LTP 的增强效应 实验设对照组和巴戟素A、B组，巴戟素是在 PS 稳定 10 min 后加入，浴槽中的终浓度分别为 10 mg/L和 100 mg/L。对照组加入等量 ACSF。3 组均在加药或液后再稳定 10 min，然后施加强直刺激，观察、记录脑片 PS 幅值增大率(表3，图3，图4)。结果显示，巴戟素对大鼠海马脑片的 LTP 效应具有明显增强作用，且呈一定的量效关系，提示巴戟素可增强脑的学习记忆功能。
图3 对照组强直刺激后PS幅值的变化
图4 巴戟素(0.1g/L)强直刺激后后PS变化的影响
表3 巴戟素对脑片 LTP 的增强效应 (
±s) 组 别, 百拇医药
N/片
pPS幅值增大/%
对照组(ACSF)
9
84.46±13.15
巴戟素A组(10 mg/L)
9
113.22±18.12**
巴戟素B组(100 mg/L)
9
191.80±23.44***
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**与对照组比较P<0.01，***P<0.001
2.4 巴戟素增强脑片 LTP 效应与 NO 的关系 先前的工作证明，NO 对 LTP 的形成与维持有促进作用，当向浴槽中滴加 NO 的前体物 L-Arg 时，可使脑片的 LTP 增强；反之，滴加L-NAME 时，则使 LTP 减弱。本实验设 L-NAME 组和巴戟素+L-NAME 组。巴戟素在施加 TS 前给药； L-NAME 给药时间两组均在施加 TS 后 30 min 确定已产生 LTP 后才加入。结果显示，巴戟素+L-NAME 组在加入 L-NAME 后，可见 LTP 效应显著下降，其下降程度明显大于 L-NAME 组，两组的差异有显著性(表4)，提示巴戟素增强 LTP 的效应与 NO 的促进作用有关。
表4 两组加 L-NAME 前后 LTP 效应比较(
±s) 组 别, http://www.100md.com
N/片
(VPS幅值/mV)/(加L-NAME前 加L-NAME后)
pPS幅值减少
/%
L-NAME组
5
2.55±0.75
1.94±0.52
23.80±4.95
巴戟素+
L-NAME组
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5
4.19±0.89
2.75±0.64
34.61±2.95**
**与L-NAME组比较P<0.01；L-NAME 终浓度均为 10-6 mol/L，巴戟素终浓度为 100 mg/L
3 讨论
保护脑功能，开发人脑的潜力是当今生命科学的重大课题。中医十分重视人的肾气，认为肾与脑有密切联系，通过补肾可以生髓益脑，增强人的智慧。本研究主要是探讨巴戟素补肾健脑的神经作用机制。结果证明，巴戟素明显增强 LTP 效应，同时延长缺氧时 PS 消失时间和降低脑细胞缺氧损伤。表明它具有增强神经元的信息贮存和突触传递功能，同时又能在缺氧状态下起保护脑细胞的作用。鉴于巴戟素这一药理作用，加上药源丰富，副作用小，服用方便的特点，很可能开发为一种极具应用前景的补肾健脑药物，用于促进脑的正常发育、延缓脑衰老，预防中老年脑萎缩发生以至防治老年性痴呆等。
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大量研究证明，LTP 反应强度与记忆功能有显著相关性[8]。业已证明，突触前兴奋性氨基酸释放、突触后 NMDA 受体激活、Ca2+内流、蛋白激酶 C 激活、基因活动及蛋白质合成等对于 LTP 产生和维持具有重要作用[9]。新近发现，逆行信使 NO 在其中起着关键作用。大多数学者认为 NO 产生于突触后，随之 散到胞外，参与调控突触前膜功能，是 LTP 产生的必要条件[10]，但亦有报道 NO 并非 LTP 产生所必需。我们的研究表明，加入 L-NAME 可抑制脑片 LTP 的反应强度，加入 L-Arg 则能加强 LTP 效应，表明 NO 对 LTP 形成与维持有促进作用。巴戟素增强 LTP 效应与其促进 NO 生成有密切关系。
有关研究证明，兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙超载和自由基增多是脑缺血缺氧损伤的主要发病机制[11]。有实验报道，脑缺血早期，NO 突然增多，30 min 后达高峰，并认为NO 能介导谷氨酸的神经毒性作用，高浓度的 NO 还能最终抑制线粒体呼吸而对细胞产生直接毒性作用[12，13]。本实验结果显示 L-NAME 对脑细胞缺氧损伤有明显保护作用，支持 NO 毒性参与急性脑缺血损伤作用的观点。至于巴戟素对脑细胞缺氧损伤所起的保护作用，是否与其对抗自由基生成，增加能源供应或对抗 NO 的毒性作用等有关，有待进一步研究。
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基金项目：国家中医药管理局科研基金课题(编号：97L025)
作者简介：陈洁文，女，教授；
参考文献：
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收稿日期：1999-09-01, http://www.100md.com