半薄SDS-PAGE垂直式平板电泳法检测尿蛋白谱
作者：王生余 张 真 章 精 刘志红 黎磊石
单位：南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所(南京，210002)
关键词：SDS-PAGE；蛋白尿；尿蛋白谱
肾脏病与透析肾移植杂志990428
蛋白尿是肾脏疾患的重要症状之一，其中蛋白的性质与构成(即尿蛋白谱)在诊断肾脏疾病及评估药物疗效等方面有着重要的参考价值。以往采用的蛋白电泳技术，如醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶、免疫电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、等电聚集以及SDS-PAGE圆盘电泳等方法虽各具优点，但与临床诊断所需的大量尿标本检测，以及蛋白成分高分辨率要求相比还存在着差距。本文介绍的半薄SDS-PAGE垂直式平板电泳[2，3]，并结合高敏银染[4]和激光密度扫描的方法，能够快速有效地分析尿液中蛋白质成分。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 垂直式平板电泳槽(北京崇文东方仪器厂)，激光密度扫描仪(Molecular Dynamics公司，美国)，直流电稳压输出电源(Phamacia公司，美国)。
1.1.2 试剂 中分子量蛋白标准品(上海分子生物学研究所)；30%PAGE凝胶贮液(丙烯酰胺29g，甲叉双丙烯酰胺 1g)；10%十二烷基硫代硫酸钠(SDS)；20%过硫酸铵；三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(pH 8.9)；Tris-HCl缓冲液(pH 6.7)；四甲基乙二胺(TEMED)；Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH 8.3)。所有试剂均为分析纯。
1.1.3 标本 尿标本分别来自留取的健康成人和肾脏疾病患者50ml新鲜晨尿。
, 百拇医药
1.2 方法和步骤
1.2.1 凝胶的配制 分别配制12%分离胶和4%的浓缩胶，其方法简述如下。取Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)2.5ml，凝胶贮液8ml，10%SDS溶液200μl，及双蒸水9ml，再加入TEMED 20μl和20%过硫酸铵200μl，充分混匀后即为12%的分离胶。另取Tris-HCl缓冲液(pH 6.7)1.25ml，凝胶贮液1.3ml，10%SDS溶液100μl，及双蒸水7.26ml，再加入TEMED 10μl和20%过硫酸铵50μl，充分混匀后即为4%的浓缩胶。按实验要求分别将分离胶和浓缩胶依次加入1mm的垂直电泳板中即可。
1.2.2 电泳 晨尿标本先进行蛋白定性，根据蛋白定性的结果决定样本电泳所需的上样量，如附表所示。加样后在110伏电压下电泳5～6 h。以溴酚蓝做为电泳指示剂。
附表 尿蛋白定性检测结果与电泳上样量的关系 蛋白定性结果
, 百拇医药
取样量(μl)
-或±
20
+
10
++
5
+++
2
++++
1
1.2.3 银染 电泳结束后，用双蒸水配制的固定液(30%乙醇，10%乙酸)固定6h以上。随后以30%乙醇漂洗两次，每次漂洗时间不应少于10 min。纯水清洗两次(10 min)后，加入0.01%AgNO3染液染色45 min。显色液(25%Na2CO3、0.05%甲醛)显色后用1%乙酸终止反应。
, 百拇医药
1.2.4 扫描 将处理好的凝胶上机进行激光扫描，在相应软件支持下，计算可得各组分蛋白的分子量及其百分含量。
2 结 果
本方法所得蛋白电泳条带清晰可辩，能够明显区分尿标本中不同分子量的蛋白组分(见附图A)。借助密度扫描仪可分析尿标本中不同分子量蛋白含量。图B是激光密度扫描泳道3电泳条带的密度扫描图。附表是根据泳道3密度扫描图而得到的该患者尿液中不同分子量蛋白的组成。
附表 某患者尿液中不同分子量蛋白谱
姓 名 蒋×× 年龄 25/F 诊断 IgAN 种 类
分子量
百分比
蛋白带数
, http://www.100md.com
高分子
>7
31.16%
1～5
白蛋白
6万～7万
23.61%
6，7
低分子
4万～6万
7.32%
8，9
低分子
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2万～4万
22.30%
10～17
低分子
6千～2万
15.61%
18～24
低分子
<6千
%
附图 尿蛋白半薄SDS-PAGE垂直平板电泳图谱及分析结果
, 百拇医药
A 尿标本半薄SDS-PAGE垂直平板电泳图谱泳道1为蛋
白分子标准泳道2～9为肾病患者晨尿电泳条带
B 蛋白电泳密度扫描图
3 讨 论
本研究采用半薄SDS-PAGE垂直式平板电泳法分析尿标本中蛋白质的组分，重复性较好。同一块凝胶板能够对多个患者的尿标本进行电泳分析，便于多样本的临床检测，有助于肾脏病的诊断与治疗效果的评判。半薄SDS-PAGE垂直式平板电泳法的仪器设备简单，试剂易于配制，技术操作不难，所得结果直观，便于分析判断。与圆盘电泳相比，本方法操作步骤简单。由于采用厚度为1mm的普通凝胶板，易于扫描时光线透过，提高电泳条带的识别分辨能力。同时缩短了检测时间，整个检测过程不超过一天半；染色采取银染，时间快速，条带的清晰度优于G-250染色。
, http://www.100md.com 根据尿蛋白的来源可将其分为肾小球性、肾小管性以及混合性蛋白尿；而肾小球滤过蛋白质的大小又可将其分为选择性和非选择性蛋白尿。近年来的研究发现，尿液中的蛋白成分可能参与了肾小管及间质的损伤[1]。正常人尿液中蛋白含量极微，其尿蛋白谱特征为白蛋白含量约为40%左右，高分子量和小分子量蛋白含量少。病理情况下，尿蛋白阳性，尿蛋白谱也发生相应的改变，诸如蛋白成份增多，一些蛋白的含量发生变化等。肾病综合征患者尿蛋白谱最明显的特征就是高分子量蛋白和白蛋白的含量增加，高分子量蛋白的种类增多；肾间质病变最明显的变化是小分子量蛋白条带增多和百分含量增加；大部分糖尿病患者出现蛋白尿时，其尿蛋白谱明显的变化是白蛋白含量大幅度升高；其它肾脏疾病，尿蛋白谱也有其相应的特点。另外，在治疗过程中，尿蛋白谱也会发生改变[5～8]，如附图A所示，泳道1为蛋白标准，其余泳道均为肾病患者晨尿标本。泳道7、8、9中小分子蛋白比例增加很明显，泳道5、6的大分子蛋白比例增加，而泳道2、3显示除了大分子蛋白增加外，小分子蛋白组分增多且量也增加。尿蛋白谱中蛋白组分质和量的变化，可以作为判断肾病患者肾小球和肾小管受损程度的参考依据。肾间质有损害时，可利用半薄SDS-PAGE快速检测出对肾间质有致损作用的蛋白质及其含量；另外，尿液中有些蛋白质可作为肾病的预后指标，如多聚白蛋白(PA)，可通过半薄SDS-PAGE结合膜转印免疫杂交技术，检测尿液中PA的出现及其百分含量[9]。
, 百拇医药
防止发生污染是进行尿蛋白分析的重要条件之一。本方法在配制凝胶过程中需使用双蒸水，并使用一次性塑料手套，以保证电泳结果染色的背景清晰度。过硫酸铵需优级纯并且新鲜配制，否则影响凝胶的聚合速度和程度。电泳步骤中需注意样品的上样量，否则银染色后白蛋白部位会出现半透明的“大肚子”，扫描时使白蛋白的百分比下降，给临床错误的参考指标。银染具有安全、快速、经济等优点，染色试剂最好为优级纯，且要用去离子水新鲜配制，显影液预冷、显影时间加长、显影过程中多次更换显影液可使背景降低，条带清晰。聚丙烯酰胺的浓度和交联度决定凝胶孔径的大小，影响蛋白的泳动速度和各蛋白组分间的距离，因而还需根据临床的需要，配制不同浓度的凝胶，对蛋白组分进行更细的分析。
参考文献
1 Chen L，Wang Y，Tay YC et al.Proteinuria and tubulointerstitial injury.Kidney Int，1997，61(suppl)：S60
, http://www.100md.com
2 Bianchi-Bosisio A，Gaboardi F，Gianazza E et al.Sodium dodecyl sulphateelectrophoresis of urinary proteins.J Chromatogr，1991，569：243
3 Stierle HE，Oser B，Boesken WH et al.Improved classification of proteinuria by semiautomated ultrathin SDS-PAGE.Clin Nephrol，1990，33：168
4 Kirschtein M，Jensen R，Schroder R et al.Proteinuria after renal transplantation：diagnosis with highly sensitive silver stain in sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gradient gel electrophoresis.Klim-Wochenschr，1991，69：847
, 百拇医药
5 Perini JM，Dehon B， Marianne T et al.Evaluation by immunoblotting of the criteria for tubular lessions diagnostic with urinary SDS-PAGE.Clin Chim Acta，1987，169：255
6 Woo KT，Lau YK，Lee GS et al.Pattern of proteinuria in IgA nephritis by SDS-PAGE clinical significance.Clin Nephron，1991，36：6
7 Woo K，Lau YK.Pattern of proteinuria in tubular injury and glomerular hyperfiltration.Ann Acad Med Singapore，1997，26：465
, 百拇医药
8 Suenaga K.Analysis of urinary protein in diabetics：it′s clinical implications as a predictor of nephropathy.Nippon Jinzo Gakkai Shi，1991，33：43
9 Claudio B，Concetta P，Virginia R et al.Characterization of proteinuria in primary glomerulonephritides：urinary polymers of albumin.Am J Kidney Dis，1997，30：404
(1999-07-02收稿), 百拇医药
单位：南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所(南京，210002)
关键词：SDS-PAGE；蛋白尿；尿蛋白谱
肾脏病与透析肾移植杂志990428
蛋白尿是肾脏疾患的重要症状之一，其中蛋白的性质与构成(即尿蛋白谱)在诊断肾脏疾病及评估药物疗效等方面有着重要的参考价值。以往采用的蛋白电泳技术，如醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶、免疫电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、等电聚集以及SDS-PAGE圆盘电泳等方法虽各具优点，但与临床诊断所需的大量尿标本检测，以及蛋白成分高分辨率要求相比还存在着差距。本文介绍的半薄SDS-PAGE垂直式平板电泳[2，3]，并结合高敏银染[4]和激光密度扫描的方法，能够快速有效地分析尿液中蛋白质成分。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 垂直式平板电泳槽(北京崇文东方仪器厂)，激光密度扫描仪(Molecular Dynamics公司，美国)，直流电稳压输出电源(Phamacia公司，美国)。
1.1.2 试剂 中分子量蛋白标准品(上海分子生物学研究所)；30%PAGE凝胶贮液(丙烯酰胺29g，甲叉双丙烯酰胺 1g)；10%十二烷基硫代硫酸钠(SDS)；20%过硫酸铵；三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(pH 8.9)；Tris-HCl缓冲液(pH 6.7)；四甲基乙二胺(TEMED)；Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH 8.3)。所有试剂均为分析纯。
1.1.3 标本 尿标本分别来自留取的健康成人和肾脏疾病患者50ml新鲜晨尿。
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1.2 方法和步骤
1.2.1 凝胶的配制 分别配制12%分离胶和4%的浓缩胶，其方法简述如下。取Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)2.5ml，凝胶贮液8ml，10%SDS溶液200μl，及双蒸水9ml，再加入TEMED 20μl和20%过硫酸铵200μl，充分混匀后即为12%的分离胶。另取Tris-HCl缓冲液(pH 6.7)1.25ml，凝胶贮液1.3ml，10%SDS溶液100μl，及双蒸水7.26ml，再加入TEMED 10μl和20%过硫酸铵50μl，充分混匀后即为4%的浓缩胶。按实验要求分别将分离胶和浓缩胶依次加入1mm的垂直电泳板中即可。
1.2.2 电泳 晨尿标本先进行蛋白定性，根据蛋白定性的结果决定样本电泳所需的上样量，如附表所示。加样后在110伏电压下电泳5～6 h。以溴酚蓝做为电泳指示剂。
附表 尿蛋白定性检测结果与电泳上样量的关系 蛋白定性结果
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取样量(μl)
-或±
20
+
10
++
5
+++
2
++++
1
1.2.3 银染 电泳结束后，用双蒸水配制的固定液(30%乙醇，10%乙酸)固定6h以上。随后以30%乙醇漂洗两次，每次漂洗时间不应少于10 min。纯水清洗两次(10 min)后，加入0.01%AgNO3染液染色45 min。显色液(25%Na2CO3、0.05%甲醛)显色后用1%乙酸终止反应。
, 百拇医药
1.2.4 扫描 将处理好的凝胶上机进行激光扫描，在相应软件支持下，计算可得各组分蛋白的分子量及其百分含量。
2 结 果
本方法所得蛋白电泳条带清晰可辩，能够明显区分尿标本中不同分子量的蛋白组分(见附图A)。借助密度扫描仪可分析尿标本中不同分子量蛋白含量。图B是激光密度扫描泳道3电泳条带的密度扫描图。附表是根据泳道3密度扫描图而得到的该患者尿液中不同分子量蛋白的组成。
附表 某患者尿液中不同分子量蛋白谱
姓 名 蒋×× 年龄 25/F 诊断 IgAN 种 类
分子量
百分比
蛋白带数
, http://www.100md.com
高分子
>7
31.16%
1～5
白蛋白
6万～7万
23.61%
6，7
低分子
4万～6万
7.32%
8，9
低分子
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2万～4万
22.30%
10～17
低分子
6千～2万
15.61%
18～24
低分子
<6千
%
附图 尿蛋白半薄SDS-PAGE垂直平板电泳图谱及分析结果
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A 尿标本半薄SDS-PAGE垂直平板电泳图谱泳道1为蛋
白分子标准泳道2～9为肾病患者晨尿电泳条带
B 蛋白电泳密度扫描图
3 讨 论
本研究采用半薄SDS-PAGE垂直式平板电泳法分析尿标本中蛋白质的组分，重复性较好。同一块凝胶板能够对多个患者的尿标本进行电泳分析，便于多样本的临床检测，有助于肾脏病的诊断与治疗效果的评判。半薄SDS-PAGE垂直式平板电泳法的仪器设备简单，试剂易于配制，技术操作不难，所得结果直观，便于分析判断。与圆盘电泳相比，本方法操作步骤简单。由于采用厚度为1mm的普通凝胶板，易于扫描时光线透过，提高电泳条带的识别分辨能力。同时缩短了检测时间，整个检测过程不超过一天半；染色采取银染，时间快速，条带的清晰度优于G-250染色。
, http://www.100md.com 根据尿蛋白的来源可将其分为肾小球性、肾小管性以及混合性蛋白尿；而肾小球滤过蛋白质的大小又可将其分为选择性和非选择性蛋白尿。近年来的研究发现，尿液中的蛋白成分可能参与了肾小管及间质的损伤[1]。正常人尿液中蛋白含量极微，其尿蛋白谱特征为白蛋白含量约为40%左右，高分子量和小分子量蛋白含量少。病理情况下，尿蛋白阳性，尿蛋白谱也发生相应的改变，诸如蛋白成份增多，一些蛋白的含量发生变化等。肾病综合征患者尿蛋白谱最明显的特征就是高分子量蛋白和白蛋白的含量增加，高分子量蛋白的种类增多；肾间质病变最明显的变化是小分子量蛋白条带增多和百分含量增加；大部分糖尿病患者出现蛋白尿时，其尿蛋白谱明显的变化是白蛋白含量大幅度升高；其它肾脏疾病，尿蛋白谱也有其相应的特点。另外，在治疗过程中，尿蛋白谱也会发生改变[5～8]，如附图A所示，泳道1为蛋白标准，其余泳道均为肾病患者晨尿标本。泳道7、8、9中小分子蛋白比例增加很明显，泳道5、6的大分子蛋白比例增加，而泳道2、3显示除了大分子蛋白增加外，小分子蛋白组分增多且量也增加。尿蛋白谱中蛋白组分质和量的变化，可以作为判断肾病患者肾小球和肾小管受损程度的参考依据。肾间质有损害时，可利用半薄SDS-PAGE快速检测出对肾间质有致损作用的蛋白质及其含量；另外，尿液中有些蛋白质可作为肾病的预后指标，如多聚白蛋白(PA)，可通过半薄SDS-PAGE结合膜转印免疫杂交技术，检测尿液中PA的出现及其百分含量[9]。
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防止发生污染是进行尿蛋白分析的重要条件之一。本方法在配制凝胶过程中需使用双蒸水，并使用一次性塑料手套，以保证电泳结果染色的背景清晰度。过硫酸铵需优级纯并且新鲜配制，否则影响凝胶的聚合速度和程度。电泳步骤中需注意样品的上样量，否则银染色后白蛋白部位会出现半透明的“大肚子”，扫描时使白蛋白的百分比下降，给临床错误的参考指标。银染具有安全、快速、经济等优点，染色试剂最好为优级纯，且要用去离子水新鲜配制，显影液预冷、显影时间加长、显影过程中多次更换显影液可使背景降低，条带清晰。聚丙烯酰胺的浓度和交联度决定凝胶孔径的大小，影响蛋白的泳动速度和各蛋白组分间的距离，因而还需根据临床的需要，配制不同浓度的凝胶，对蛋白组分进行更细的分析。
参考文献
1 Chen L，Wang Y，Tay YC et al.Proteinuria and tubulointerstitial injury.Kidney Int，1997，61(suppl)：S60
, http://www.100md.com
2 Bianchi-Bosisio A，Gaboardi F，Gianazza E et al.Sodium dodecyl sulphateelectrophoresis of urinary proteins.J Chromatogr，1991，569：243
3 Stierle HE，Oser B，Boesken WH et al.Improved classification of proteinuria by semiautomated ultrathin SDS-PAGE.Clin Nephrol，1990，33：168
4 Kirschtein M，Jensen R，Schroder R et al.Proteinuria after renal transplantation：diagnosis with highly sensitive silver stain in sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gradient gel electrophoresis.Klim-Wochenschr，1991，69：847
, 百拇医药
5 Perini JM，Dehon B， Marianne T et al.Evaluation by immunoblotting of the criteria for tubular lessions diagnostic with urinary SDS-PAGE.Clin Chim Acta，1987，169：255
6 Woo KT，Lau YK，Lee GS et al.Pattern of proteinuria in IgA nephritis by SDS-PAGE clinical significance.Clin Nephron，1991，36：6
7 Woo K，Lau YK.Pattern of proteinuria in tubular injury and glomerular hyperfiltration.Ann Acad Med Singapore，1997，26：465
, 百拇医药
8 Suenaga K.Analysis of urinary protein in diabetics：it′s clinical implications as a predictor of nephropathy.Nippon Jinzo Gakkai Shi，1991，33：43
9 Claudio B，Concetta P，Virginia R et al.Characterization of proteinuria in primary glomerulonephritides：urinary polymers of albumin.Am J Kidney Dis，1997，30：404
(1999-07-02收稿), 百拇医药