SC55494造血刺激活性的研究*
作者：张日 朱子玲 John F DiPersio
单位：张日 朱子玲 苏州医学院附属第一医院 江苏省血液研究所 邮政编码：215006；John F DiPersio 美国华盛顿大学医学院
关键词：SC55494 白细胞介素-3 人白细胞介素-3受体 信号传导
江苏医药990401 摘要 在小鼠前B细胞系BaF3中进行基因转染获得了表达人白细胞介素-3受体(IL-3R)α和α/β亚单位的阳性克隆。细胞增殖功能检测显示，IL-3R激动剂SC55494对表达α和α/β克隆的造血刺激活性分别比白细胞介素-3(IL-3)高500和100倍，对人骨髓CFU-Mix集落形成的刺激能力比IL-3大20倍，信号传导实验证明，SC55494增强的造血潜能与胞浆信号分子Jak2的酪氨酸磷酸化有关。上述结果意味着SC55494可能会作为生长因子家族的新成员而用于临床。
, 百拇医药
Study of Hematopoietic Stimulating Activity of SC55494
Zhang Ri et al
Jiangsu Institute of Hematology, First Affiliated Hospital,Suzhou Medical College, Suzhou
Abstract Gene transfection was performed to obtain clones expressing α and α/β subunits of human interleukin-3 receptor(IL-3R) in mouse pro-B cell line, BaF3. IL-3R agonist, SC55494-induced cell proliferation assay of BaF3/IL-3R α and BaF3/IL-3R α/β exhibited 500-fold and 100-fold greater hematopoietic stimulating activity than human interleukin-3(IL-3) respectively, and the number of human marrow CFU-Mix colony formation stimulated by SC55494 was 20-fold as many as that stimulated by hIL-3. Signal transduction experiment demonstrated that enhanced hematopoietic potency of SC55494 is associated with tyrosine phosphorylation of cytoplasmic Jak2 signal molecules. These results mean that SC55494 could enter clinical trails as a new member of cytokine family.
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Key words SC55494 Interleukin-3 Human interleukin-3 receptor Signal transduction
基因重组人白细胞介素-3(IL-3)通过α与β两个亚单位共同组成的跨膜受体(IL-3R α/β)的介导，可以刺激人早期造血祖细胞的增殖和分化。作为生长因子家族的重要成员，近年来IL-3已被成功地推向Ⅱ期临床，发现近半数经IL-3治疗的骨髓增生异常综合征(MDS)、再障、肿瘤放化疗后的骨髓抑制病例白细胞、网织红细胞和血小板数明显增加[1]，然而，由于IL-3在发挥体内治疗作用的同时，也可诱导机体释放炎性介质，引起寒战、发热、头痛等副作用。为了克服这一弊端，最近Thomas等人利用基因工程技术，对IL-3进行了分子变构，克隆出了一种新的IL-3R激动剂―SC55494，亦称合成介素1(synthokine-1)[2]。为了深入了解SC55494的造血刺激活性，我们将其与IL-3进行了比较研究。
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材料与方法
1.试剂与细胞培养：IL-3及单抗购自UBI公司；G418、湿性霉素B(Hygromycin B)及有关生化试剂购自Gibco公司；同位素125I-IL-3及ECL药盒购自Amersham公司；编码IL-3Rα及β亚单位的cDNA由Miyajima教授惠赠，SC55494由Baum博士惠赠；赖小鼠IL-3(mIL-3)生长的前B细胞系BaF3，培养于含lng/ml mIL-3和10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养液中，每周传代二次。
2.基因转染与克隆筛选：按照分子生物学常规方法，将编码IL-3Rα及β的cDNA，分别插入pMX及含Neo抗药基因的载体CMV中，构成pMX-IL-3Rα及CMV-β的质粒，分别取线性化的pMX-IL-3Rα18μg和含Hygro抗药基因的pSV2载体2μg或pMX-IL-3Rα与CMV-β各10μg，与1×107BaF3细胞混匀后进行电击转染。继将已转染细胞重新培养于含1ng/ml mIL-3及10%FCS的RPMI1640培养液中，2天后，在IL-3Rα及α/β的转染体系中分别对应加入0.1mg/ml湿性霉素B和0.5mg/ml G418进行耐药克隆选择，待获得HygroR和NeoR的BaF3克隆后，用125I-IL-3对耐药克隆进行配体结合检测，以发现表达IL-3Rα及α/β的BaF3阳性克隆。
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3.细胞增殖功能检测：取未转染和表达IL-3Rα及α/β的BaF3细胞，按每孔1×104细胞种植于含10%FCS与RPMI1640的24孔培养板中，并添加不同浓度人IL-3及SC55494，置5%CO2、37℃培养4天后计数细胞数，每实验点均设3孔，取均数作为结果。
4.混合集落形成单位(CFU-Mix)体外培养：抽取5例正常人骨髓并分离出单个核细胞(MNC)后，加入CFU-Mix体外培养体系中，使每毫升体系最终含MNC1×105、FCS30%、甲基纤维素1.1%、牛血清白蛋白1%、β-巯基乙醇10-4mol/L、Epo2U以及不同浓度的人IL-3或SC55494，置37℃、5%CO2和饱和湿度条件下培养14天后，在倒置显微镜下计数所有≥50个细胞的集落数。
5.Jak2信号蛋白的酪氨酸磷酸化：将含IL-3Rα与α/β的细胞洗涤3次后，在无生长因子及FCS的RPMI1640培养液中培养6小时后，置冰上加100ng/ml IL-3或50ng/mlSC55494刺激10分钟，以细胞裂解液在4℃裂解细胞30分钟，收集上清液，按5μg/ml加入抗胞浆蛋白激酶Jak2单抗，在4℃过夜免疫沉淀，再加50μg/ml洗涤的蛋白G-琼脂糖培养6小时，离心后继与50μl 2×SDS样品缓冲液混匀并煮沸10分钟，经7.5%PAGE电泳与转膜后，用含3%去脂牛奶的TTBS封闭1小时，再按1μg/ml加入抗磷酸化酪氨酸单抗(4G10)，室温孵育90分钟，最后按ECL试剂盒说明在X线胶片上曝光显影。
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结果
1.生长因子诱导的细胞增殖：未转染的BaF3细胞膜上仅存在mIL-3受体，因而生长特异性依赖mIL-3的刺激；当在BaF3细胞膜上重建了人IL-3R以后，该克隆则表现为对小鼠与人IL-3两种生长因子均有增殖反应。我们观察到，两种 因子刺激IL-3Rα/β克隆增殖的初始浓度，IL-3为1ng/ml，SC55494则为10pg/ml，后者的活性比前者大100倍；而对仅表达α亚单位的BaF3克隆，两者的增殖初始浓度分别为IL-3 50ng/ml和SC55494 100pg/ml，后者的活性比前者大500倍。
2.IL-3与SC55494刺激CFU-Mix集落形成能力的比较：正常人骨髓细胞在CFU-Mix体系中培养2周后，可见仅由粒系、单核系、红系、巨核系和嗜酸系分别组成或由上述各系共同组成的集落，我们将所有≥50个细胞的细胞团计为一个CFU-Mix。实验结果可见，当用0.1ng/ml SC55494刺激后，即可见到集落形成；而IL-3诱导集落形成的初始浓度则至少需1ng/ml，且集落数仅为前者的一半左右。随着两者浓度的递增，集落产率也相应增加，但从两者刺激的产率比较，SC55494造血刺激活性比IL-3大20倍左右。
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3.含IL-3R表达的BaF3克隆Jak2酪氨酸磷酸化表达：为了探讨两种因子诱导表达人IL-3R的BaF3细胞出现有丝分裂现象、并刺激人骨髓CFU-Mix集落形成的机理，我们先用抗Jak2抗体免疫沉淀胞浆Jak2蛋白，继用抗酪氨酸磷酸化单抗检测Jak2蛋白的酪氨酸磷酸化，结果观察到，仅表达IL-3Rα的BaF3细胞，在用100ng/ml SC55494或相同浓度的IL-3刺激10分钟后，未见到Jak2区带，即使将两者的浓度增加到2μg/ml、刺激时间延长到1小时也是如此；而含IL-3Rα/β共表达的BaF3克隆在50ng/ml SC55494或100ng/ml的IL-3刺激10分钟后，均可见到分子量为130KDa的Jak2蛋白表达。
讨论
已经证明，人IL-3R分子由α与β两个亚单位构成，α亚单位能以低亲和力方式与配体特异性结合，β亚单位虽然自身不能与配体结合，但可与α亚单位共同组成与配体高亲和结合力的受体分子，并向核内传导配体/受体复合物的刺激信号，诱导各种细胞生物学行为，此外，β亚单位也能被人粒―巨噬集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-5(IL-5)受体α亚单位所共享[3]。Thomas等利用配体/受体结合检测发现，作为IL-3R激动剂的SC55494与IL-3Rα及α/β的结合能力分别比天然IL-3大60与20倍，同时观察到SC55494刺激骨髓CFU-Mix集落形成的能力比IL-3大22倍，而SC55494刺激白三烯C4及组胺释放的能力仅比IL-3高1倍[2]；Farese等进行体内研究则发现，SC55494能有效提高血小板与白细胞数目[4]；然而至今尚无直接利用受体重建的克隆为材料，从刺激造血活性的角度，更直观地比较SC55494与IL-3促增殖能力的研究报导，我们的工作证实，SC55494刺激含IL-3Rα与α/β表达的BaF3细胞增殖的活性分别比IL-3高500与100倍，刺激正常人骨髓CFU-Mix集落形成的能力比IL-3大20倍左右。据此，我们认为，SC55494选择性地明显提高了IL-3的造血刺激活性，而促炎性介质释放的副反应并未相应增大，可以相信，SC55494有望作为人工合成的生长因子加入细胞因子的临床治疗队伍。
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由于人IL-3R胞浆结构中缺少内在的酪氨酸激酶区域，因而推测其信号传导必然借助于胞浆中其他成分的参与。我们过去的工作已经证明，Jak激酶家族中的Jak2酪氨酸磷酸化在IL-3R介导的增殖信号传导中担负关键作用[5]。当IL-3Rα/β与配体结合后，可激活受体复合物中的β亚单位，使结合于β亚单位胞浆域近膜端Boxl和Box2上的Jak2激酶得以活化，继而通过Jak-STAT(信号传导物与转录激活物)途径向核内传导刺激信号[6]。我们目前的研究则证实，与IL-3相同，SC55494促细胞增殖的机制，也是与通过结合IL-3R并进而激活Jak2胞浆激酶这一共同信号传导途径有关。
*本课题部分受国家自然科学基金(39670277)和教育部留学回国人员科研启动基金资助
参考文献
[1] Beutler E, et al. Williams Hematology. 5th ed. New York:Mc Graw-Hill, Inc.1995；161～162.
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[2] Thomas JW, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1995；92：3779.
[3] Miyajima A. International J Cell Cloning 1992；10:126.
[4] Farese AM, et al. Blood 1994；84(suppl 10)：28.
[5] Zhang R, et al. Blood 1996；88(suppl 10)：661.
[6] Schindler C, et al. Annu Rev Biochem 1995；64：621.
(1998年10月20日收稿 同年12月7日修回), 百拇医药
单位：张日 朱子玲 苏州医学院附属第一医院 江苏省血液研究所 邮政编码：215006；John F DiPersio 美国华盛顿大学医学院
关键词：SC55494 白细胞介素-3 人白细胞介素-3受体 信号传导
江苏医药990401 摘要 在小鼠前B细胞系BaF3中进行基因转染获得了表达人白细胞介素-3受体(IL-3R)α和α/β亚单位的阳性克隆。细胞增殖功能检测显示，IL-3R激动剂SC55494对表达α和α/β克隆的造血刺激活性分别比白细胞介素-3(IL-3)高500和100倍，对人骨髓CFU-Mix集落形成的刺激能力比IL-3大20倍，信号传导实验证明，SC55494增强的造血潜能与胞浆信号分子Jak2的酪氨酸磷酸化有关。上述结果意味着SC55494可能会作为生长因子家族的新成员而用于临床。
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Study of Hematopoietic Stimulating Activity of SC55494
Zhang Ri et al
Jiangsu Institute of Hematology, First Affiliated Hospital,Suzhou Medical College, Suzhou
Abstract Gene transfection was performed to obtain clones expressing α and α/β subunits of human interleukin-3 receptor(IL-3R) in mouse pro-B cell line, BaF3. IL-3R agonist, SC55494-induced cell proliferation assay of BaF3/IL-3R α and BaF3/IL-3R α/β exhibited 500-fold and 100-fold greater hematopoietic stimulating activity than human interleukin-3(IL-3) respectively, and the number of human marrow CFU-Mix colony formation stimulated by SC55494 was 20-fold as many as that stimulated by hIL-3. Signal transduction experiment demonstrated that enhanced hematopoietic potency of SC55494 is associated with tyrosine phosphorylation of cytoplasmic Jak2 signal molecules. These results mean that SC55494 could enter clinical trails as a new member of cytokine family.
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Key words SC55494 Interleukin-3 Human interleukin-3 receptor Signal transduction
基因重组人白细胞介素-3(IL-3)通过α与β两个亚单位共同组成的跨膜受体(IL-3R α/β)的介导，可以刺激人早期造血祖细胞的增殖和分化。作为生长因子家族的重要成员，近年来IL-3已被成功地推向Ⅱ期临床，发现近半数经IL-3治疗的骨髓增生异常综合征(MDS)、再障、肿瘤放化疗后的骨髓抑制病例白细胞、网织红细胞和血小板数明显增加[1]，然而，由于IL-3在发挥体内治疗作用的同时，也可诱导机体释放炎性介质，引起寒战、发热、头痛等副作用。为了克服这一弊端，最近Thomas等人利用基因工程技术，对IL-3进行了分子变构，克隆出了一种新的IL-3R激动剂―SC55494，亦称合成介素1(synthokine-1)[2]。为了深入了解SC55494的造血刺激活性，我们将其与IL-3进行了比较研究。
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材料与方法
1.试剂与细胞培养：IL-3及单抗购自UBI公司；G418、湿性霉素B(Hygromycin B)及有关生化试剂购自Gibco公司；同位素125I-IL-3及ECL药盒购自Amersham公司；编码IL-3Rα及β亚单位的cDNA由Miyajima教授惠赠，SC55494由Baum博士惠赠；赖小鼠IL-3(mIL-3)生长的前B细胞系BaF3，培养于含lng/ml mIL-3和10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养液中，每周传代二次。
2.基因转染与克隆筛选：按照分子生物学常规方法，将编码IL-3Rα及β的cDNA，分别插入pMX及含Neo抗药基因的载体CMV中，构成pMX-IL-3Rα及CMV-β的质粒，分别取线性化的pMX-IL-3Rα18μg和含Hygro抗药基因的pSV2载体2μg或pMX-IL-3Rα与CMV-β各10μg，与1×107BaF3细胞混匀后进行电击转染。继将已转染细胞重新培养于含1ng/ml mIL-3及10%FCS的RPMI1640培养液中，2天后，在IL-3Rα及α/β的转染体系中分别对应加入0.1mg/ml湿性霉素B和0.5mg/ml G418进行耐药克隆选择，待获得HygroR和NeoR的BaF3克隆后，用125I-IL-3对耐药克隆进行配体结合检测，以发现表达IL-3Rα及α/β的BaF3阳性克隆。
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3.细胞增殖功能检测：取未转染和表达IL-3Rα及α/β的BaF3细胞，按每孔1×104细胞种植于含10%FCS与RPMI1640的24孔培养板中，并添加不同浓度人IL-3及SC55494，置5%CO2、37℃培养4天后计数细胞数，每实验点均设3孔，取均数作为结果。
4.混合集落形成单位(CFU-Mix)体外培养：抽取5例正常人骨髓并分离出单个核细胞(MNC)后，加入CFU-Mix体外培养体系中，使每毫升体系最终含MNC1×105、FCS30%、甲基纤维素1.1%、牛血清白蛋白1%、β-巯基乙醇10-4mol/L、Epo2U以及不同浓度的人IL-3或SC55494，置37℃、5%CO2和饱和湿度条件下培养14天后，在倒置显微镜下计数所有≥50个细胞的集落数。
5.Jak2信号蛋白的酪氨酸磷酸化：将含IL-3Rα与α/β的细胞洗涤3次后，在无生长因子及FCS的RPMI1640培养液中培养6小时后，置冰上加100ng/ml IL-3或50ng/mlSC55494刺激10分钟，以细胞裂解液在4℃裂解细胞30分钟，收集上清液，按5μg/ml加入抗胞浆蛋白激酶Jak2单抗，在4℃过夜免疫沉淀，再加50μg/ml洗涤的蛋白G-琼脂糖培养6小时，离心后继与50μl 2×SDS样品缓冲液混匀并煮沸10分钟，经7.5%PAGE电泳与转膜后，用含3%去脂牛奶的TTBS封闭1小时，再按1μg/ml加入抗磷酸化酪氨酸单抗(4G10)，室温孵育90分钟，最后按ECL试剂盒说明在X线胶片上曝光显影。
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结果
1.生长因子诱导的细胞增殖：未转染的BaF3细胞膜上仅存在mIL-3受体，因而生长特异性依赖mIL-3的刺激；当在BaF3细胞膜上重建了人IL-3R以后，该克隆则表现为对小鼠与人IL-3两种生长因子均有增殖反应。我们观察到，两种 因子刺激IL-3Rα/β克隆增殖的初始浓度，IL-3为1ng/ml，SC55494则为10pg/ml，后者的活性比前者大100倍；而对仅表达α亚单位的BaF3克隆，两者的增殖初始浓度分别为IL-3 50ng/ml和SC55494 100pg/ml，后者的活性比前者大500倍。
2.IL-3与SC55494刺激CFU-Mix集落形成能力的比较：正常人骨髓细胞在CFU-Mix体系中培养2周后，可见仅由粒系、单核系、红系、巨核系和嗜酸系分别组成或由上述各系共同组成的集落，我们将所有≥50个细胞的细胞团计为一个CFU-Mix。实验结果可见，当用0.1ng/ml SC55494刺激后，即可见到集落形成；而IL-3诱导集落形成的初始浓度则至少需1ng/ml，且集落数仅为前者的一半左右。随着两者浓度的递增，集落产率也相应增加，但从两者刺激的产率比较，SC55494造血刺激活性比IL-3大20倍左右。
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3.含IL-3R表达的BaF3克隆Jak2酪氨酸磷酸化表达：为了探讨两种因子诱导表达人IL-3R的BaF3细胞出现有丝分裂现象、并刺激人骨髓CFU-Mix集落形成的机理，我们先用抗Jak2抗体免疫沉淀胞浆Jak2蛋白，继用抗酪氨酸磷酸化单抗检测Jak2蛋白的酪氨酸磷酸化，结果观察到，仅表达IL-3Rα的BaF3细胞，在用100ng/ml SC55494或相同浓度的IL-3刺激10分钟后，未见到Jak2区带，即使将两者的浓度增加到2μg/ml、刺激时间延长到1小时也是如此；而含IL-3Rα/β共表达的BaF3克隆在50ng/ml SC55494或100ng/ml的IL-3刺激10分钟后，均可见到分子量为130KDa的Jak2蛋白表达。
讨论
已经证明，人IL-3R分子由α与β两个亚单位构成，α亚单位能以低亲和力方式与配体特异性结合，β亚单位虽然自身不能与配体结合，但可与α亚单位共同组成与配体高亲和结合力的受体分子，并向核内传导配体/受体复合物的刺激信号，诱导各种细胞生物学行为，此外，β亚单位也能被人粒―巨噬集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-5(IL-5)受体α亚单位所共享[3]。Thomas等利用配体/受体结合检测发现，作为IL-3R激动剂的SC55494与IL-3Rα及α/β的结合能力分别比天然IL-3大60与20倍，同时观察到SC55494刺激骨髓CFU-Mix集落形成的能力比IL-3大22倍，而SC55494刺激白三烯C4及组胺释放的能力仅比IL-3高1倍[2]；Farese等进行体内研究则发现，SC55494能有效提高血小板与白细胞数目[4]；然而至今尚无直接利用受体重建的克隆为材料，从刺激造血活性的角度，更直观地比较SC55494与IL-3促增殖能力的研究报导，我们的工作证实，SC55494刺激含IL-3Rα与α/β表达的BaF3细胞增殖的活性分别比IL-3高500与100倍，刺激正常人骨髓CFU-Mix集落形成的能力比IL-3大20倍左右。据此，我们认为，SC55494选择性地明显提高了IL-3的造血刺激活性，而促炎性介质释放的副反应并未相应增大，可以相信，SC55494有望作为人工合成的生长因子加入细胞因子的临床治疗队伍。
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由于人IL-3R胞浆结构中缺少内在的酪氨酸激酶区域，因而推测其信号传导必然借助于胞浆中其他成分的参与。我们过去的工作已经证明，Jak激酶家族中的Jak2酪氨酸磷酸化在IL-3R介导的增殖信号传导中担负关键作用[5]。当IL-3Rα/β与配体结合后，可激活受体复合物中的β亚单位，使结合于β亚单位胞浆域近膜端Boxl和Box2上的Jak2激酶得以活化，继而通过Jak-STAT(信号传导物与转录激活物)途径向核内传导刺激信号[6]。我们目前的研究则证实，与IL-3相同，SC55494促细胞增殖的机制，也是与通过结合IL-3R并进而激活Jak2胞浆激酶这一共同信号传导途径有关。
*本课题部分受国家自然科学基金(39670277)和教育部留学回国人员科研启动基金资助
参考文献
[1] Beutler E, et al. Williams Hematology. 5th ed. New York:Mc Graw-Hill, Inc.1995；161～162.
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[2] Thomas JW, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1995；92：3779.
[3] Miyajima A. International J Cell Cloning 1992；10:126.
[4] Farese AM, et al. Blood 1994；84(suppl 10)：28.
[5] Zhang R, et al. Blood 1996；88(suppl 10)：661.
[6] Schindler C, et al. Annu Rev Biochem 1995；64：621.
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