丹参对耳蜗辐射防护作用的实验研究
作者：杨新明 卢永德 谢鼎华 陈 忠
单位：第二附属医院耳鼻咽喉科 长沙 410011
关键词：丹参；辐射损伤*；放射保护*；耳蜗；实验研究；豚鼠
湖南医科大学学报990520 提要 为探讨内耳辐射损伤的防治，采用丹参作为保护药物，用相同剂量的60Co γ射线照射丹参防护组和单纯放射组豚鼠耳颞部，2周后作形态与机能检查。结果发现：丹参防护组耳蜗机能与结构损害较轻，而单纯放射组耳蜗机能明显受损，血管纹和柯替氏器病变严重；复合动作电位(CAP)反应阈和毛细胞损伤率两组比较差异有显著性(P<0.01)。表明丹参对内耳辐射损伤有保护作用。
中国图书分类号 R764.83 R818.74
Protective effect of Radix Salvia Miltiorrhizae on
, 百拇医药
radiation damage of the cochlea
Yang Xinming, Lu Yongde, Xie Dinghua, et al
(Department of Otolaryngology, The Second Affiliated Hospital,Hunan Medical University, Changsha 410011)
In order to evaluate the preventive and therapeutic effects of Radix Salvia Miltiorrhizae on radiation damage of the cochlea, guinea pigs were divided into 3 groups. Group 1 was treated by radiation added with Radix Salvia Miltiorrhizae. Group 2 was radiated alone, and Group 3 was control. Group 1 and Group 2 were radiated with a single dose of gamma radiation(60Gy). Morphological and functional observation of the cochleae was performed in two weeks after radiation. The result showed that the changes of complex action potential(CAP) and the cochlear structure were slight in Group 1, but obvious changes were found in Group 2. There was a significant difference in CAP response threshold and incidence of the cochlear hair cell loss between Group 1 and Group 2(P<0.01). These results suggest that Radix Salvia Miltiorrhiza may prevent radiation-induced cochlea damage. Its protective mechanisms may be cleaning free radicals, blocking calcium channel and improving microcirculation of the cochlea.
, 百拇医药
Key words Radix Salvia Miltiorrhizae; radiation damage*; radioprotection*; cochlea; experimental studies; guinea pigs
电离辐射产生的自由基反应可致内耳出现早期和迟发性损害，甚至使部分头颈部肿瘤患者放疗后听力丧失[1，2]。近年来，虽然在组织细胞辐射损伤的防治方面作了大量工作，但内耳辐射损伤的防治研究尚未起步。目前较为有效的抗辐射药物有含硫类、甾体激素类、免疫调节剂、钙拮抗剂及天然药物如中草药。其中以天然药物的研究较为广泛。文献报道，丹参可能具有防治爆聋、噪声性聋及氨基甙类抗生素所致中毒性耳聋的作用[3，4]。它的药理作用主要有清除氧自由基、钙拮抗、活血化淤和改善微循环等[5]。据此，丹参可能对抗辐射对耳蜗的损伤。本实验旨在观察丹参对耳蜗辐射损伤的保护作用，并初步探讨其机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 一般资料
选择白色红目豚鼠45只，体重350～450g，耳廓反射灵敏，耳道及鼓膜正常。随机分为3组：①丹参防护组(丹参组)18只；②单纯放射组(单放组)18只；③对照组9只。用同样剂量的γ射线照射单放组和丹参组动物右侧颞区，对照组未照射。照射前测试耳蜗电图(ECochG)。，丹参组自照射前1d开始，于大腿内侧皮下注射丹参注射液〔江苏省东台市制药厂产品，江卫药准字(82)1342-4号〕，1g.kg-1.d-1；单放组及对照组在上述部位注射等量生理盐水，1ml.d-1。两组用药各为2周。测试ECochG后处死，作形态学观察。单放组和丹参组观察右侧放射耳各18耳；对照组观察双耳，共18耳。各组观察方法和耳数为：透射电镜及扫描电镜各2耳，火棉胶切片及耳蜗外壁铺片各3耳，硝酸银染色、基底膜铺片、毛细胞计数各8耳。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 射线投照方法 将受试豚鼠固定在木盒内，将3cm厚的铅板置于动物头颅左半上方，隔绝对左耳的辐射，放射野2cm×1.5cm，皮距80cm，剂量深度2cm。各组均采用单一剂量60Co γ射线60Gy照射。
1.2.2 ECochG测试、电镜观察、火棉胶切片、耳蜗基底膜铺片与毛细胞计数 方法同笔者已报道过的方法[6]。
1.2.3 耳蜗外壁铺片 快速处死动物后，迅速取出颞骨，于蜗尖钻孔，开放两窗，10%福尔马林灌流后再固定24h，去除蜗壳，分离取出外壁组织，在伊红染液中染色5min，自来水漂洗，将蜗管面朝上铺于载玻片之甘油滴中，盖上盖玻片，光镜下观察。
1.3 统计学处理
结果用均数±标准差(
±s)表示，统计处理采用t检验及方差分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 ECochG结果
单放组与照射前比较，CAP反应阈明显上升；与丹参组比较，差异有显著性(P<0.01)。丹参组与照射前比较，反应阈有所上升，但损伤较轻。对照组听力无变化(表1)。
表1 丹参组与单放组放射前后CAP变化(±s,dB SPL) 组别
耳数
照射前
照射后
丹参组
18
, 百拇医药
35.00±7.31
39.05±4.08①
单放组
18
34.44±4.73
70.72±16.40②
对照组
18
33.22±5.12
32.88±5.34
与辐射前比较①P>0.05;②P<0.012.2 耳蜗毛细胞计数
, 百拇医药
单放组毛细胞损伤率明显高于丹参组和正常对照组(P<0.01)(表2，图1)。
图1 三组耳蜗外毛细胞损伤率分布曲线
Fig. 1 Distribution curve of loss rate of the out hair
cell on the cochlea in three groups
表2 各组耳蜗毛细胞损伤率(±s，%) 组别
耳数
内毛细胞
, 百拇医药
外毛细胞
丹参组
8
4.1±1.6
8.2±1.3
单放组
8
8.5±1.3①②
23.1±7.1①③
对照组
8
1.0±0.5
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3.3±1.4
①与对照组比较P<0.01；②与丹参组比较P<0.05；③与丹参组比较P<0.01
2.3 外壁铺片
单放组耳蜗外壁毛细血管网及汇集的静脉扩张淤血，周边部分毛细血管及外放射动脉消失。丹参组外放射动脉毛细血管和汇集的静脉无明显扩张，无缺血区和淤血区。
2.4 颞骨连续切片
单放组耳蜗底转外淋巴间隙水肿，前庭膜向蜗管内膨隆，内淋巴腔受压，蜗管内有红细胞渗出(图2)；外毛细胞(DHC)及支持细胞肿胀或溶解，部分核消失，有的仅留下网状支架，盖膜脱离螺旋缘；螺旋神经节细胞有退变或数目减少。丹参组耳蜗形态正常，内外淋巴腔隙内无水肿及渗出，少数外毛细胞胞浆轻度肿胀，血管纹无明显肿胀与变性，螺旋神经节细胞正常。
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图2A. 丹参组耳蜗中轴切片形态正常HE，×30 2B.
单放组耳蜗中轴切片底转和第二转外淋巴间隙水肿，蜗管受压(↑) HE，×30
Fig. 2A. Midmiodialar section of cochlea in group with salvia miltiorrhiza showing normal structure HE,×30 2B. Midmodialar section of cochlea in group radiated alone showing perilymphatic edema with compression of the endolymphatic space in the basal and 2nd turn of cochlea(↑) HE,×30
2.5 透射电镜观察
, 百拇医药 丹参组血管纹细胞、毛细血管内皮细胞及血管周围间质轻度水肿，血管腔无红细胞淤滞，偶见内外毛细胞胞浆疏松，个别线粒体肿胀。单放组血管纹细胞线粒体气球样变，毛细血管淤血，内皮细胞肿胀；内毛细胞皱缩，外毛细胞表皮板疏松，线粒体水肿变性，溶酶体肿胀破裂，内质网、高尔基体溶解，表面囊扩张。
2.6 扫描电镜观察
丹参组内、外毛细胞排列整齐，静纤毛僵直度正常；单放组外毛细胞纤毛缺失、倒伏、融合、排列紊乱(图3)。
图3A. 丹参组外毛细胞纤毛排列正常，个别纤毛融合 ×3000 3B.
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单放组外毛细胞融合成团(↑)，失去正常形状×3000 3C.对照组内外毛细胞排列整齐×3000
Fig. 3A. Out hair cell in group with salvia miltiorrhiza showing an almost normal appearance with proper stiffness, only a little fusion of sensory hairs ×3000 3B. Out hair cell in group radiated alone showing the sensory hairs fused into ball (↑) ×3000 3C. Inner and out hair cell showing a normal arragment ×3000
3 讨 论
据文献报道，鼻咽癌、腮腺癌等耳颞部附近的头颈肿瘤放疗后，感音神经性耳聋的发生率为30%～50%[1，2]。然而，目前尚无一种有效的防护方法。有研究发现，丹参有防治辐射所致心肌膜系统损伤的作用[7]。刘振声等提出氧自由基可能是爆震性耳聋的致病因素。应用丹参防治爆聋的研究发现，丹参防治组耳蜗组织中氧自由基代谢产物丙二醛明显低于单纯爆震组，表明丹参可清除耳蜗组织中氧自由基代谢产物[3]。此外，丹参还可能有防治噪声性耳聋及对抗氨基甙类抗生素的耳蜗毒性作用[4]。本研究发现，丹参组CAP反应阈上升幅度较小，耳蜗结构与机能损害较轻，而单放组耳蜗机能明显受损，耳蜗病变严重，提示丹参对内耳的辐射损伤可能有防护作用。其作用机制可能是：①电离辐射损伤主要与自由基有关，自由基有很强的破坏作用，可造成广泛的细胞损害。丹参中含有原儿茶酚和丹参素D，两者有清除氧自由基的作用，从而有可能减轻自由基对内耳的损伤。②钙离子拮抗剂是一类新型的抗辐射药物，由辐射所致的组织损伤使进入细胞的钙离子增加，从而导致细胞死亡。丹参有钙拮抗作用，可通过阻断内耳各细胞膜上的钙通道，减少钙离子进入细胞内。③辐射致内耳血管纹毛细血管淤血，回流受阻。丹参是活血化淤药，能增 加血流速度，改善内耳微循环，维护其正常代谢。
, http://www.100md.com
预防头颈部恶性肿瘤放射治疗所并发的内耳辐射损伤，首先必须保证放疗的效果不受影响，所用药物如能增加放疗的敏感性则更为理想。有资料显示，活血化淤的中药及钙拮抗剂有放射增敏作用。对鼻咽癌放疗时，加用活血化淤的中药并与单纯放疗进行前瞻性研究，表明活血化淤药物组患者的5年幸存率明显高于单纯放疗组[8]。有研究证实丹参有活血化淤及阻滞钙通道的作用[5]。因此，笔者认为丹参可能既有辐射防护作用，又有放射增敏作用，有必要进一步研究。
参考文献
1 Moretti JA. Sensori-neural hearing loss following radiotherapy to the nasopharynx. Laryngoscope, 1976,86:598～602
2 Anteunis LJC, Wauders SL, Hendriks JJT, et al. A prospective longitudinal study on radiation-induced hearing loss. Am J Surg, 1994,16:408～411
, http://www.100md.com
3 刘振声，王锦玲，毛慰英.丹参防治爆震性聋的实验研究.临床耳鼻咽喉科杂志，1992，6(2)：80～81
4 于德林，董民声.复方丹参对抗卡那霉素耳蜗毒性的实验研究.中华耳鼻咽喉科杂志，1990，25(1)：16～19
5 陈维州.丹参的药理.药学学报，1981，11：876～878
6 杨新明，卢永德，陈忠，等.电离辐射对内耳的迟发性损害.中华耳鼻咽喉科杂志，1997，32(4)：222～225
7 刘尔东，贾玉芝，刘尔林，等.分次照射所致心肌细胞通透性变化及丹参防护作用的镧电子示踪研究.中华放射医学与防护杂志，1993，12(4)：222～224
8 李振权，潘启超，陈剑经.鼻咽癌临床与实验研究.广州：广东科技出版社，1983：270, http://www.100md.com
单位：第二附属医院耳鼻咽喉科 长沙 410011
关键词：丹参；辐射损伤*；放射保护*；耳蜗；实验研究；豚鼠
湖南医科大学学报990520 提要 为探讨内耳辐射损伤的防治，采用丹参作为保护药物，用相同剂量的60Co γ射线照射丹参防护组和单纯放射组豚鼠耳颞部，2周后作形态与机能检查。结果发现：丹参防护组耳蜗机能与结构损害较轻，而单纯放射组耳蜗机能明显受损，血管纹和柯替氏器病变严重；复合动作电位(CAP)反应阈和毛细胞损伤率两组比较差异有显著性(P<0.01)。表明丹参对内耳辐射损伤有保护作用。
中国图书分类号 R764.83 R818.74
Protective effect of Radix Salvia Miltiorrhizae on
, 百拇医药
radiation damage of the cochlea
Yang Xinming, Lu Yongde, Xie Dinghua, et al
(Department of Otolaryngology, The Second Affiliated Hospital,Hunan Medical University, Changsha 410011)
In order to evaluate the preventive and therapeutic effects of Radix Salvia Miltiorrhizae on radiation damage of the cochlea, guinea pigs were divided into 3 groups. Group 1 was treated by radiation added with Radix Salvia Miltiorrhizae. Group 2 was radiated alone, and Group 3 was control. Group 1 and Group 2 were radiated with a single dose of gamma radiation(60Gy). Morphological and functional observation of the cochleae was performed in two weeks after radiation. The result showed that the changes of complex action potential(CAP) and the cochlear structure were slight in Group 1, but obvious changes were found in Group 2. There was a significant difference in CAP response threshold and incidence of the cochlear hair cell loss between Group 1 and Group 2(P<0.01). These results suggest that Radix Salvia Miltiorrhiza may prevent radiation-induced cochlea damage. Its protective mechanisms may be cleaning free radicals, blocking calcium channel and improving microcirculation of the cochlea.
, 百拇医药
Key words Radix Salvia Miltiorrhizae; radiation damage*; radioprotection*; cochlea; experimental studies; guinea pigs
电离辐射产生的自由基反应可致内耳出现早期和迟发性损害，甚至使部分头颈部肿瘤患者放疗后听力丧失[1，2]。近年来，虽然在组织细胞辐射损伤的防治方面作了大量工作，但内耳辐射损伤的防治研究尚未起步。目前较为有效的抗辐射药物有含硫类、甾体激素类、免疫调节剂、钙拮抗剂及天然药物如中草药。其中以天然药物的研究较为广泛。文献报道，丹参可能具有防治爆聋、噪声性聋及氨基甙类抗生素所致中毒性耳聋的作用[3，4]。它的药理作用主要有清除氧自由基、钙拮抗、活血化淤和改善微循环等[5]。据此，丹参可能对抗辐射对耳蜗的损伤。本实验旨在观察丹参对耳蜗辐射损伤的保护作用，并初步探讨其机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 一般资料
选择白色红目豚鼠45只，体重350～450g，耳廓反射灵敏，耳道及鼓膜正常。随机分为3组：①丹参防护组(丹参组)18只；②单纯放射组(单放组)18只；③对照组9只。用同样剂量的γ射线照射单放组和丹参组动物右侧颞区，对照组未照射。照射前测试耳蜗电图(ECochG)。，丹参组自照射前1d开始，于大腿内侧皮下注射丹参注射液〔江苏省东台市制药厂产品，江卫药准字(82)1342-4号〕，1g.kg-1.d-1；单放组及对照组在上述部位注射等量生理盐水，1ml.d-1。两组用药各为2周。测试ECochG后处死，作形态学观察。单放组和丹参组观察右侧放射耳各18耳；对照组观察双耳，共18耳。各组观察方法和耳数为：透射电镜及扫描电镜各2耳，火棉胶切片及耳蜗外壁铺片各3耳，硝酸银染色、基底膜铺片、毛细胞计数各8耳。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 射线投照方法 将受试豚鼠固定在木盒内，将3cm厚的铅板置于动物头颅左半上方，隔绝对左耳的辐射，放射野2cm×1.5cm，皮距80cm，剂量深度2cm。各组均采用单一剂量60Co γ射线60Gy照射。
1.2.2 ECochG测试、电镜观察、火棉胶切片、耳蜗基底膜铺片与毛细胞计数 方法同笔者已报道过的方法[6]。
1.2.3 耳蜗外壁铺片 快速处死动物后，迅速取出颞骨，于蜗尖钻孔，开放两窗，10%福尔马林灌流后再固定24h，去除蜗壳，分离取出外壁组织，在伊红染液中染色5min，自来水漂洗，将蜗管面朝上铺于载玻片之甘油滴中，盖上盖玻片，光镜下观察。
1.3 统计学处理
结果用均数±标准差(
±s)表示，统计处理采用t检验及方差分析。, 百拇医药
2 结 果
2.1 ECochG结果
单放组与照射前比较，CAP反应阈明显上升；与丹参组比较，差异有显著性(P<0.01)。丹参组与照射前比较，反应阈有所上升，但损伤较轻。对照组听力无变化(表1)。
表1 丹参组与单放组放射前后CAP变化(
±s,dB SPL) 组别耳数
照射前
照射后
丹参组
18
, 百拇医药
35.00±7.31
39.05±4.08①
单放组
18
34.44±4.73
70.72±16.40②
对照组
18
33.22±5.12
32.88±5.34
与辐射前比较①P>0.05;②P<0.012.2 耳蜗毛细胞计数
, 百拇医药
单放组毛细胞损伤率明显高于丹参组和正常对照组(P<0.01)(表2，图1)。
图1 三组耳蜗外毛细胞损伤率分布曲线
Fig. 1 Distribution curve of loss rate of the out hair
cell on the cochlea in three groups
表2 各组耳蜗毛细胞损伤率(
±s，%) 组别耳数
内毛细胞
, 百拇医药
外毛细胞
丹参组
8
4.1±1.6
8.2±1.3
单放组
8
8.5±1.3①②
23.1±7.1①③
对照组
8
1.0±0.5
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3.3±1.4
①与对照组比较P<0.01；②与丹参组比较P<0.05；③与丹参组比较P<0.01
2.3 外壁铺片
单放组耳蜗外壁毛细血管网及汇集的静脉扩张淤血，周边部分毛细血管及外放射动脉消失。丹参组外放射动脉毛细血管和汇集的静脉无明显扩张，无缺血区和淤血区。
2.4 颞骨连续切片
单放组耳蜗底转外淋巴间隙水肿，前庭膜向蜗管内膨隆，内淋巴腔受压，蜗管内有红细胞渗出(图2)；外毛细胞(DHC)及支持细胞肿胀或溶解，部分核消失，有的仅留下网状支架，盖膜脱离螺旋缘；螺旋神经节细胞有退变或数目减少。丹参组耳蜗形态正常，内外淋巴腔隙内无水肿及渗出，少数外毛细胞胞浆轻度肿胀，血管纹无明显肿胀与变性，螺旋神经节细胞正常。
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图2A. 丹参组耳蜗中轴切片形态正常HE，×30 2B.
单放组耳蜗中轴切片底转和第二转外淋巴间隙水肿，蜗管受压(↑) HE，×30
Fig. 2A. Midmiodialar section of cochlea in group with salvia miltiorrhiza showing normal structure HE,×30 2B. Midmodialar section of cochlea in group radiated alone showing perilymphatic edema with compression of the endolymphatic space in the basal and 2nd turn of cochlea(↑) HE,×30
2.5 透射电镜观察
, 百拇医药 丹参组血管纹细胞、毛细血管内皮细胞及血管周围间质轻度水肿，血管腔无红细胞淤滞，偶见内外毛细胞胞浆疏松，个别线粒体肿胀。单放组血管纹细胞线粒体气球样变，毛细血管淤血，内皮细胞肿胀；内毛细胞皱缩，外毛细胞表皮板疏松，线粒体水肿变性，溶酶体肿胀破裂，内质网、高尔基体溶解，表面囊扩张。
2.6 扫描电镜观察
丹参组内、外毛细胞排列整齐，静纤毛僵直度正常；单放组外毛细胞纤毛缺失、倒伏、融合、排列紊乱(图3)。
图3A. 丹参组外毛细胞纤毛排列正常，个别纤毛融合 ×3000 3B.
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单放组外毛细胞融合成团(↑)，失去正常形状×3000 3C.对照组内外毛细胞排列整齐×3000
Fig. 3A. Out hair cell in group with salvia miltiorrhiza showing an almost normal appearance with proper stiffness, only a little fusion of sensory hairs ×3000 3B. Out hair cell in group radiated alone showing the sensory hairs fused into ball (↑) ×3000 3C. Inner and out hair cell showing a normal arragment ×3000
3 讨 论
据文献报道，鼻咽癌、腮腺癌等耳颞部附近的头颈肿瘤放疗后，感音神经性耳聋的发生率为30%～50%[1，2]。然而，目前尚无一种有效的防护方法。有研究发现，丹参有防治辐射所致心肌膜系统损伤的作用[7]。刘振声等提出氧自由基可能是爆震性耳聋的致病因素。应用丹参防治爆聋的研究发现，丹参防治组耳蜗组织中氧自由基代谢产物丙二醛明显低于单纯爆震组，表明丹参可清除耳蜗组织中氧自由基代谢产物[3]。此外，丹参还可能有防治噪声性耳聋及对抗氨基甙类抗生素的耳蜗毒性作用[4]。本研究发现，丹参组CAP反应阈上升幅度较小，耳蜗结构与机能损害较轻，而单放组耳蜗机能明显受损，耳蜗病变严重，提示丹参对内耳的辐射损伤可能有防护作用。其作用机制可能是：①电离辐射损伤主要与自由基有关，自由基有很强的破坏作用，可造成广泛的细胞损害。丹参中含有原儿茶酚和丹参素D，两者有清除氧自由基的作用，从而有可能减轻自由基对内耳的损伤。②钙离子拮抗剂是一类新型的抗辐射药物，由辐射所致的组织损伤使进入细胞的钙离子增加，从而导致细胞死亡。丹参有钙拮抗作用，可通过阻断内耳各细胞膜上的钙通道，减少钙离子进入细胞内。③辐射致内耳血管纹毛细血管淤血，回流受阻。丹参是活血化淤药，能增 加血流速度，改善内耳微循环，维护其正常代谢。
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预防头颈部恶性肿瘤放射治疗所并发的内耳辐射损伤，首先必须保证放疗的效果不受影响，所用药物如能增加放疗的敏感性则更为理想。有资料显示，活血化淤的中药及钙拮抗剂有放射增敏作用。对鼻咽癌放疗时，加用活血化淤的中药并与单纯放疗进行前瞻性研究，表明活血化淤药物组患者的5年幸存率明显高于单纯放疗组[8]。有研究证实丹参有活血化淤及阻滞钙通道的作用[5]。因此，笔者认为丹参可能既有辐射防护作用，又有放射增敏作用，有必要进一步研究。
参考文献
1 Moretti JA. Sensori-neural hearing loss following radiotherapy to the nasopharynx. Laryngoscope, 1976,86:598～602
2 Anteunis LJC, Wauders SL, Hendriks JJT, et al. A prospective longitudinal study on radiation-induced hearing loss. Am J Surg, 1994,16:408～411
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3 刘振声，王锦玲，毛慰英.丹参防治爆震性聋的实验研究.临床耳鼻咽喉科杂志，1992，6(2)：80～81
4 于德林，董民声.复方丹参对抗卡那霉素耳蜗毒性的实验研究.中华耳鼻咽喉科杂志，1990，25(1)：16～19
5 陈维州.丹参的药理.药学学报，1981，11：876～878
6 杨新明，卢永德，陈忠，等.电离辐射对内耳的迟发性损害.中华耳鼻咽喉科杂志，1997，32(4)：222～225
7 刘尔东，贾玉芝，刘尔林，等.分次照射所致心肌细胞通透性变化及丹参防护作用的镧电子示踪研究.中华放射医学与防护杂志，1993，12(4)：222～224
8 李振权，潘启超，陈剑经.鼻咽癌临床与实验研究.广州：广东科技出版社，1983：270, http://www.100md.com