缺血/再灌损伤对大鼠视网膜一氧化氮合酶活性的影响
作者：李志远 罗贤民
单位：人体解剖学教研室 长沙 410008
关键词：缺血/再灌流；视网膜；一氧化氮合酶；高眼压；疾病模型；动物；大鼠
湖南医科大学学报990535 中国图书分类号 R774.1
组织短时急性缺血、缺氧性损伤不仅发生于缺血的当时，而且主要发生在血流再灌期。近年来研究证实氧自由基(Oxygen free radical; OFR)、一氧化氮(Nitric oxide; NO)等参与心肌缺血/再灌流损伤的病理过程。一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase; NOS)是NO合成的唯一限速因素，能把精氨酸转化为NO和胍氨酸；急性人工高眼压后再灌流对NOS活性是否有影响，国内外报道较少。本文采用依赖还原性辅酶Ⅱ硫辛酰胺脱氢酶(NADPH diaphorase; NADPH-d)组织化学方法检测NOS在高眼压后血流再灌时的变化，旨在探讨NOS在高眼压后期视网膜损伤中的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
选用双眼等大、角膜透明、瞳孔规则、体重300～400g的健康Wister大鼠30只，雌雄不拘。动物随机分为5组，每组6只，A～D组为实验组，E组为对照组。
1.2 实验动物模型制备
用二道生理记录仪测量并记录麻醉状态下大鼠平均尾动脉压。实验前用0.25%氯霉素眼药水冲洗结膜囊。用4.5号针头分别于左、右眼9点和3点方位，距角膜缘0.5mm穿刺入前房，注入生理盐水加压至各鼠平均尾动脉压水准，A～D组分别维持0.5，1，6及24h后，摘除眼球。对照组E组动物仅作前房穿刺，留针1h后摘除眼球。
1.3 组织准备和视网膜NADPH-d组织化学染色
, 百拇医药 将摘除的动物眼球立即置于4℃，pH为7.4，0.1mmol.L-1磷酸盐缓冲液中清洗血渍。在4%多聚甲醛液中剥离视网膜，固定60min，平铺于载玻片上，并清除残余的玻璃体，磷酸盐缓冲液漂洗3次。将铺片置于0.2mmol.L-1 β-NADPH-d,0.5mmol.L-1 NBT， 0.3% Triton X-100，pH8.0孵育箱中，于37℃恒温箱内孵育30min，再将铺片放入0.01mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH7.4)中止反应。室温干片，常规脱水、透明及封片，以备光镜下观察结果。对照试验：①卵育液不加β-NADPH-d；②孵育液不加NBT；③切片加热至80℃，使NOS变性，破坏其酶活性。
2 结 果
眼前房加压时，动物眼球变硬，瞳孔散大，角膜雾状混浊。
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2.1 视网膜NOS的观察
光镜下，NOS反应物呈蓝色。对照组大鼠左、右眼视网膜NOS反应物较浅淡，神经元主要为无长突细胞(图1)；加压缺血组视网膜反应较对照组略强(图2)；而缺血再灌组明显增强，神经元胞体呈深蓝色，突起明显(图3)。
图1 对照组大鼠视网膜铺片NOS反应物不明显 ×100
Fig. 1 NOS histochemistric reaction in whole mounted retina of the control
group. The reactive products in the retina were light ×100
, 百拇医药
图2 加压缺血组大鼠视网膜铺片 NOS反应物较对照组强，阳性神经元呈蓝色 ×100
Fig. 2 NOS histochemistric reaction of the ischemia group with darker reactive products compared the control group. The NOS neurons were stained with blue ×100
图3 缺血再灌组大鼠视网膜铺片NOS反应强，阳性神经元呈深蓝色，突起明显，血管充血明显 ×100
Fig. 3 NOS histochemistric reaction of the ischemia-reperfusion group with darker
, 百拇医药
reactive products. The NOS neurons were stained with dark blue. The congestion of blood vessels in the retina was severer than that of other two groups ×100
2.2 视网膜血管的形态观察
缺血再灌注大鼠视网膜血管NOS组织化学反应呈蓝色，其分支和毛细血管清晰可见。光镜下，缺血组血管内有少许血细胞，无出血点和白细胞浸润，而缺血再灌注组有多个出血点和白细胞浸润(图3)，高倍镜下见深染的血管内皮细胞。
2.3 对照实验
所有对照实验均呈NOS阴性反应。
3 讨 论
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NO作为一种新型的细胞信使分子，不但在生物体内有广泛的生理功能，而且还参与了某些疾病的发生和发展。近年研究表明：视网膜及中枢神经系统内有部分神经元含有NOS，其产物NO在神经系统的作用已取得普遍共识，它在脑血流的调节、神经元的发育、轴突的生长与修饰以及兴奋性氨基酸神经毒性的介导等方面均起重要的作用。NOS在视网膜缺血再灌时表达增多，反映了过多的NO在视网膜病理损害过程中发挥强烈的细胞毒性作用，加速视网膜受损神经元的死亡。本实验缺血再灌期，NOS含量明显高于缺血期，说明NO的大量产生不是在视网膜缺血时，而是在再灌注过程中，再灌流的不同时期NOS含量也不一致。6h达高峰，以后逐渐减少，这可能与视网膜缺血和再灌流后导致的炎症反应有关。光镜下观察到白细胞浸润，提示缺血和再灌注均能使诱导型的NOS生成。已知诱导型的NOS在抗炎时能发挥重要作用，但若该型NOS的活性过分强烈，可产生过多NO，则对正常组织细胞产生毒性作用。
视网膜血管内皮细胞中存在NOS，其产生的NO可直接作用于血管平滑肌，致使视网膜血管舒张，血流量增加。高眼压时，视网膜血流量减少，组织缺氧，此时缺血缺氧的血管内皮细胞受低血流张力和低氧刺激而大量合成NO，即NOS大量表达，以此来代偿性调节局部血流，故可见蓝色的NOS反应性视网膜血管。以此可推测NOS对视网膜血流的调节起重要作用，这有助于青光眼发病学的研究。, http://www.100md.com
单位：人体解剖学教研室 长沙 410008
关键词：缺血/再灌流；视网膜；一氧化氮合酶；高眼压；疾病模型；动物；大鼠
湖南医科大学学报990535 中国图书分类号 R774.1
组织短时急性缺血、缺氧性损伤不仅发生于缺血的当时，而且主要发生在血流再灌期。近年来研究证实氧自由基(Oxygen free radical; OFR)、一氧化氮(Nitric oxide; NO)等参与心肌缺血/再灌流损伤的病理过程。一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase; NOS)是NO合成的唯一限速因素，能把精氨酸转化为NO和胍氨酸；急性人工高眼压后再灌流对NOS活性是否有影响，国内外报道较少。本文采用依赖还原性辅酶Ⅱ硫辛酰胺脱氢酶(NADPH diaphorase; NADPH-d)组织化学方法检测NOS在高眼压后血流再灌时的变化，旨在探讨NOS在高眼压后期视网膜损伤中的作用。
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1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
选用双眼等大、角膜透明、瞳孔规则、体重300～400g的健康Wister大鼠30只，雌雄不拘。动物随机分为5组，每组6只，A～D组为实验组，E组为对照组。
1.2 实验动物模型制备
用二道生理记录仪测量并记录麻醉状态下大鼠平均尾动脉压。实验前用0.25%氯霉素眼药水冲洗结膜囊。用4.5号针头分别于左、右眼9点和3点方位，距角膜缘0.5mm穿刺入前房，注入生理盐水加压至各鼠平均尾动脉压水准，A～D组分别维持0.5，1，6及24h后，摘除眼球。对照组E组动物仅作前房穿刺，留针1h后摘除眼球。
1.3 组织准备和视网膜NADPH-d组织化学染色
, 百拇医药 将摘除的动物眼球立即置于4℃，pH为7.4，0.1mmol.L-1磷酸盐缓冲液中清洗血渍。在4%多聚甲醛液中剥离视网膜，固定60min，平铺于载玻片上，并清除残余的玻璃体，磷酸盐缓冲液漂洗3次。将铺片置于0.2mmol.L-1 β-NADPH-d,0.5mmol.L-1 NBT， 0.3% Triton X-100，pH8.0孵育箱中，于37℃恒温箱内孵育30min，再将铺片放入0.01mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH7.4)中止反应。室温干片，常规脱水、透明及封片，以备光镜下观察结果。对照试验：①卵育液不加β-NADPH-d；②孵育液不加NBT；③切片加热至80℃，使NOS变性，破坏其酶活性。
2 结 果
眼前房加压时，动物眼球变硬，瞳孔散大，角膜雾状混浊。
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2.1 视网膜NOS的观察
光镜下，NOS反应物呈蓝色。对照组大鼠左、右眼视网膜NOS反应物较浅淡，神经元主要为无长突细胞(图1)；加压缺血组视网膜反应较对照组略强(图2)；而缺血再灌组明显增强，神经元胞体呈深蓝色，突起明显(图3)。
图1 对照组大鼠视网膜铺片NOS反应物不明显 ×100
Fig. 1 NOS histochemistric reaction in whole mounted retina of the control
group. The reactive products in the retina were light ×100
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图2 加压缺血组大鼠视网膜铺片 NOS反应物较对照组强，阳性神经元呈蓝色 ×100
Fig. 2 NOS histochemistric reaction of the ischemia group with darker reactive products compared the control group. The NOS neurons were stained with blue ×100
图3 缺血再灌组大鼠视网膜铺片NOS反应强，阳性神经元呈深蓝色，突起明显，血管充血明显 ×100
Fig. 3 NOS histochemistric reaction of the ischemia-reperfusion group with darker
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reactive products. The NOS neurons were stained with dark blue. The congestion of blood vessels in the retina was severer than that of other two groups ×100
2.2 视网膜血管的形态观察
缺血再灌注大鼠视网膜血管NOS组织化学反应呈蓝色，其分支和毛细血管清晰可见。光镜下，缺血组血管内有少许血细胞，无出血点和白细胞浸润，而缺血再灌注组有多个出血点和白细胞浸润(图3)，高倍镜下见深染的血管内皮细胞。
2.3 对照实验
所有对照实验均呈NOS阴性反应。
3 讨 论
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NO作为一种新型的细胞信使分子，不但在生物体内有广泛的生理功能，而且还参与了某些疾病的发生和发展。近年研究表明：视网膜及中枢神经系统内有部分神经元含有NOS，其产物NO在神经系统的作用已取得普遍共识，它在脑血流的调节、神经元的发育、轴突的生长与修饰以及兴奋性氨基酸神经毒性的介导等方面均起重要的作用。NOS在视网膜缺血再灌时表达增多，反映了过多的NO在视网膜病理损害过程中发挥强烈的细胞毒性作用，加速视网膜受损神经元的死亡。本实验缺血再灌期，NOS含量明显高于缺血期，说明NO的大量产生不是在视网膜缺血时，而是在再灌注过程中，再灌流的不同时期NOS含量也不一致。6h达高峰，以后逐渐减少，这可能与视网膜缺血和再灌流后导致的炎症反应有关。光镜下观察到白细胞浸润，提示缺血和再灌注均能使诱导型的NOS生成。已知诱导型的NOS在抗炎时能发挥重要作用，但若该型NOS的活性过分强烈，可产生过多NO，则对正常组织细胞产生毒性作用。
视网膜血管内皮细胞中存在NOS，其产生的NO可直接作用于血管平滑肌，致使视网膜血管舒张，血流量增加。高眼压时，视网膜血流量减少，组织缺氧，此时缺血缺氧的血管内皮细胞受低血流张力和低氧刺激而大量合成NO，即NOS大量表达，以此来代偿性调节局部血流，故可见蓝色的NOS反应性视网膜血管。以此可推测NOS对视网膜血流的调节起重要作用，这有助于青光眼发病学的研究。, http://www.100md.com