大鼠海马CA1区长时程增强的发育变化
作者：熊鹰 蔡文琴 李希成 隋建峰
单位：熊鹰 李希成 隋建峰 第三军医大学基础医学部生理学教研室 重庆，400038；蔡文琴 组织学与胚胎学教研室
关键词：长时程增强；发育；海马
提 要 目的 提 要 目的：探讨大鼠发育过程中海马CA1区LTP的变化。方法：刺激海马CA3区Schaffer侧枝，在CA1锥体细胞层记录LTP。结果：1月龄大鼠海马CA1区LTP诱出率最低，2、6月龄大鼠诱出率均高于1月龄大鼠；串刺激后，2月龄大鼠平均峰潜期显著缩短，而1、6月龄大鼠无明显变化；各年龄组大鼠PS峰值在串刺激后均明显增加，但1月龄大鼠PS增幅最小，2月龄大鼠PS增幅最大，fEPSP斜率的变化与PS增幅的变化基本一致。结论：LTP随发育进程有明显的变化，2月龄大鼠LTP效应强于其他年龄组大鼠。
中图法分类号 R338.1
, 百拇医药
Developmental changes of long-term potentiation in hippocampus CA1 region in rats
Xiong Ying, Cai Wenqin, Li Xicheng, Sui Jianfeng (Department of Physiology, Faculty of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To investigate the developmental changes of long-term potentiation (LTP) in the hippocampus CA1 region. Methods: Schaffer lateral branch in CA3 region was simulated to record LTP in CA1 region. Results: The probability of the induction of LTP in the CA1 region in 1-month-old rats was the lowest among all groups. The PS amplitude and fEPSP slope of different age rats were significantly increased after tetanic stimulation but the intensity of LTP in 2-month-old rats was stronger than those in 1-month-old and 6-month-old rats. Conclusion: There are obvious developmental changes of LTP and the intensity of LTP in 2-month-old rats is the highest.
, 百拇医药
Key words long-term potentiation; development; hippocampus; rat
This project was supported by the National Natural Science Foundation of China,No.39670249S
发育是一个贯穿生命始终的过程。从功能的角度可以将大鼠发育过程大致分为发育早期(3月龄以前)、成年期(3～12月龄)和发育晚期(或称衰退期，12月龄以上)[1]。长时程增强(Long-term potentiation,LTP)是一种快速建立而持久作用的突触反应性增强，由于具有协同性、特异性、长时性等特点，被认为是学习、记忆的神经基础[2]。关于LTP在发育过程中的变化，有少数研究者在海马和皮层脑片上进行了观察，认为大鼠小于2周不能在海马诱导LTP的产生，而其它脑区，如视皮层、躯体感觉皮层的LTP在出生后一周消失，与海马LTP发育变化不一样[3，4]。目前关于LTP发育的研究多采用离体脑片的方法，以在体LTP记录的方法研究不同发育阶段尤其是发育早期LTP变化的报道很少。本实验采用在体LTP记录的方法研究发育过程中大鼠LTP的变化特点。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物 Wistar大鼠，年龄分别为12、6月龄。本校实验动物中心提供。
1.2 在体LTP记录方法
以25%乌拉坦和1%氯醛糖混合液(3ml/kg,ip)麻醉大鼠，除去与海马相对应的颅骨和硬脑膜，将刺激电极推置于CA3区辐射层(P：3.2,LR:2.3,H:3.0)，刺激Schaffer侧枝。记录电极采用金属绝缘电极，直径0.2mm，阻抗<5KΩ，用微电极推进器推置于CA1区锥体细胞层(P：4.0,LR:2.3,H:2.0)，记录锥体细胞层的突触反应和细胞放电。以刺激器和隔离器输出频率0.5Hz，波宽0.1ms的方波进行单刺激，其刺激强度相当于引起突触反应和峰电位最大振幅50%的强度，以此作为测试刺激。将刺激所诱发的场兴奋性突触后电位(fEPSP)和群体峰电位(PS)经前置放大器输至双线示波器和Dantec-2000C型神经肌电记录仪。开始记录时，调节刺激强度使PS振幅和
, 百拇医药
fEPSP斜率分别为其最大值的50%～60%。在诱发LTP时，先至少记录15min的CA1区锥体细胞对单个脉冲刺激Schaffer侧枝的反应，待电位反应平稳后施予串刺激，频率100Hz，串长1s，强度、波宽与测试刺激相同。15min后，用测试刺激进行检测，连续观察60min，如果串刺激后PS振幅增大30%以上，并持续超过30min，即可认为该动物的海马Schaffer侧枝与CA1区锥体细胞的突触部位产生了LTP现象。
1.3 统计学处理
峰潜期为从刺激伪迹到PS波峰的时间。突触传递增强的计算方法是串刺激后单脉冲诱发的PS的振幅与串刺激前单脉冲诱发的PS的振幅平均值之差再除以该平均值，即以PS增幅的相对百分率作为衡量LTP效应的指标。不同组之间LTP强化程度的比较采用串刺激后某一时间段内振幅增大的百分率以t检验比较差异是否显著。
2 结果
, 百拇医药
2.1 LTP诱出率的比较
海马CA1区群体电位波形主要由fEPSP和叠加于其上的PS两个成份组成。无论以PS或fEPSP为指标，1月龄大鼠LTP的诱出率均是最低，虽然2月龄大鼠LTP诱出率稍高于6月龄大鼠，但两者差异不显著(P>0.05)，见图1。
图1 发育早期和成年大鼠LTP诱出率的比较
Fig 1 Comparison of the probability of the induction rate ofLTP between early developmental stage and adult rats
, http://www.100md.com 2.2 串刺激前后各组大鼠海马CA1区PS峰潜期的比较，见表1
串刺激(TS)后，2月龄大鼠平均峰潜期较串刺激前显著缩短(P<0.05)，1、6月龄大鼠平均峰潜期无明显的缩短(P>0.05)。
2.3 各组大鼠串刺激后PS及fEPSP斜率增幅的比较
见图2，1、2、6月龄各组大鼠PS峰值在串刺激后均明显增加，其中2月龄大鼠PS增幅的百分率较其他两组升高得更为显著(P<0.05)，平均峰潜期较串刺激前显著缩短，持续时间达1 h以上。1月龄组大鼠串刺激后，PS增幅百分率升高最小，与2月龄小鼠相比差异显著(P<0.01)。fEPSP的变化与PS的变化基本一致，见图3。表明2月龄组大鼠LTP效应明显强于其他年龄大鼠。
表1 串刺激前后海马CA1区PS峰潜期的变化(t/ms，x±s)
, 百拇医药
Tab 1 Changes of spike latency of PS in hippocampal CA1 area before and after tetanic stimulus(t/ms,x±s)
Group
(Month)
n
Pre-TS
Post-TS
1
7
3.21±0.53
2.97±0.41
, 百拇医药
2
8
3.11±0.29
2.59±0.21*
6
7
3.09±0.43
2.76±0.42
*：P<0.05 vs pre-TS
图2 串刺激后发育早期大鼠和成年大鼠PS峰值的比较
, http://www.100md.com
Fig 2 Comparison of PS amplitude after tetanic stimulation between early developmental stage and adult rats
图3 发育早期和成年大鼠刺激后fEPSP斜率的比较
Fig 3 Comparison of fEPSP slope after tetanic stimulation between early developmental stage and adult rats
3 讨论
LTP现象最先是在整体动物上发现的[5]，后来才发展到在离体脑片上进行研究。以整体动物为实验对象可以完整地反映机体生理状态，有离体脑片不具备的优越性。来自CA3区锥体细胞的Schaffer侧枝与CA1区锥体细胞树突形成突触，刺激Schaffer侧枝使CA1区锥体细胞任何树突层受刺激均可诱出LTP。常用PS振幅增大或fEPSP斜率增大来判定突触传递是否强化以及是否出现LTP[6]。本实验以频率100 Hz，串长1s的强直刺激在各年龄组均不同水平地诱发出LTP，其持续时程与文献报道一致。
, 百拇医药
LTP的发育变化近来引起一些学者的兴趣。Ito[7]发现NMDA受体ε1亚单位基因敲除小鼠LTP的幅度降低，在2～3周减少到最低。Teyler的实验表明大鼠生后6～10d在海马和皮层就可诱出LTP，生后15d LTP的幅值最高。Barnes[8]曾报道28～32月龄大鼠LTP效应远较10～16月龄大鼠差，而且在空间分辨学习任务中记忆力也较差，表明发育过程中LTP效应与学习、记忆紧密相关。本实验研究了1、2、6月龄大鼠在体LTP的发育变化，结果显示，1月龄大鼠LTP的诱出率最低；串刺激后，2月龄大鼠平均峰潜期较串刺激前显著缩短，1、6月龄大鼠无明显变化；各年龄组大鼠PS峰值以及fEPSP斜率在串刺激后均明显增加，2月龄大鼠PS和fEPSP斜率增幅的百分率较其他两组升高得更为显著。这些结果表明，随发育的进程，海马CA1区LTP现象由弱到强，进而减弱，2月龄大鼠LTP效应明显强于其他年龄大鼠，这一特点与学习记忆行为的发育变化基本吻合。
国家自然科学基金资助项目，No.39670249
, http://www.100md.com
作者简介：熊鹰，男，33岁，讲师，博士
参考文献
1 Hoffmann H, Hunt P S，Spear N E.Ontogenetic differen-ces in the association of gustatory and tactile cues with lithium chloride and footshock. Behavioral and Neural Biology,1996,53(2):441
2 Bliss T V P，Collingridge G L.A synaptic model of memory:long-term potentiation in the hippocampus. Nature,1993,361(6427):31
3 Bolshakov V Y，Siegelbaum S A.Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science,1995,269(5237):1730
, 百拇医药
4 Durand G M, Kovalchuk Y, Konnerth A. Long-term potentiation and functional synapse induction in developing hippocampus. Nature,1996,381(6577):71
5 Bliss T V P，Gradner-Medwin A R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol,1973,232(2):357
6 Scharfman H E. Postsynaptic firing during reptitive stimulation is required for long-term potentiation in hippocampus. Brain Res,1985,331(1):267
, http://www.100md.com
7 Ito I, Sakimura K, Mishina M, et al. Age-dependent reduction of hippocampal LTP in mice lacking N-methyl-D-aspartate receptor epsilon 1 subunit. Neurosci-Lett,1996,203(1):69
8 Barnes C A. Memory dificits associated with senescence: A neurophsiological and behavioural study in the rat. J Comp Physiol and Psychol,1979,93(1):74
(收稿：1998-07-14；修回：1998-10-07), 百拇医药
单位：熊鹰 李希成 隋建峰 第三军医大学基础医学部生理学教研室 重庆，400038；蔡文琴 组织学与胚胎学教研室
关键词：长时程增强；发育；海马
提 要 目的 提 要 目的：探讨大鼠发育过程中海马CA1区LTP的变化。方法：刺激海马CA3区Schaffer侧枝，在CA1锥体细胞层记录LTP。结果：1月龄大鼠海马CA1区LTP诱出率最低，2、6月龄大鼠诱出率均高于1月龄大鼠；串刺激后，2月龄大鼠平均峰潜期显著缩短，而1、6月龄大鼠无明显变化；各年龄组大鼠PS峰值在串刺激后均明显增加，但1月龄大鼠PS增幅最小，2月龄大鼠PS增幅最大，fEPSP斜率的变化与PS增幅的变化基本一致。结论：LTP随发育进程有明显的变化，2月龄大鼠LTP效应强于其他年龄组大鼠。
中图法分类号 R338.1
, 百拇医药
Developmental changes of long-term potentiation in hippocampus CA1 region in rats
Xiong Ying, Cai Wenqin, Li Xicheng, Sui Jianfeng (Department of Physiology, Faculty of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To investigate the developmental changes of long-term potentiation (LTP) in the hippocampus CA1 region. Methods: Schaffer lateral branch in CA3 region was simulated to record LTP in CA1 region. Results: The probability of the induction of LTP in the CA1 region in 1-month-old rats was the lowest among all groups. The PS amplitude and fEPSP slope of different age rats were significantly increased after tetanic stimulation but the intensity of LTP in 2-month-old rats was stronger than those in 1-month-old and 6-month-old rats. Conclusion: There are obvious developmental changes of LTP and the intensity of LTP in 2-month-old rats is the highest.
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Key words long-term potentiation; development; hippocampus; rat
This project was supported by the National Natural Science Foundation of China,No.39670249S
发育是一个贯穿生命始终的过程。从功能的角度可以将大鼠发育过程大致分为发育早期(3月龄以前)、成年期(3～12月龄)和发育晚期(或称衰退期，12月龄以上)[1]。长时程增强(Long-term potentiation,LTP)是一种快速建立而持久作用的突触反应性增强，由于具有协同性、特异性、长时性等特点，被认为是学习、记忆的神经基础[2]。关于LTP在发育过程中的变化，有少数研究者在海马和皮层脑片上进行了观察，认为大鼠小于2周不能在海马诱导LTP的产生，而其它脑区，如视皮层、躯体感觉皮层的LTP在出生后一周消失，与海马LTP发育变化不一样[3，4]。目前关于LTP发育的研究多采用离体脑片的方法，以在体LTP记录的方法研究不同发育阶段尤其是发育早期LTP变化的报道很少。本实验采用在体LTP记录的方法研究发育过程中大鼠LTP的变化特点。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物 Wistar大鼠，年龄分别为12、6月龄。本校实验动物中心提供。
1.2 在体LTP记录方法
以25%乌拉坦和1%氯醛糖混合液(3ml/kg,ip)麻醉大鼠，除去与海马相对应的颅骨和硬脑膜，将刺激电极推置于CA3区辐射层(P：3.2,LR:2.3,H:3.0)，刺激Schaffer侧枝。记录电极采用金属绝缘电极，直径0.2mm，阻抗<5KΩ，用微电极推进器推置于CA1区锥体细胞层(P：4.0,LR:2.3,H:2.0)，记录锥体细胞层的突触反应和细胞放电。以刺激器和隔离器输出频率0.5Hz，波宽0.1ms的方波进行单刺激，其刺激强度相当于引起突触反应和峰电位最大振幅50%的强度，以此作为测试刺激。将刺激所诱发的场兴奋性突触后电位(fEPSP)和群体峰电位(PS)经前置放大器输至双线示波器和Dantec-2000C型神经肌电记录仪。开始记录时，调节刺激强度使PS振幅和
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fEPSP斜率分别为其最大值的50%～60%。在诱发LTP时，先至少记录15min的CA1区锥体细胞对单个脉冲刺激Schaffer侧枝的反应，待电位反应平稳后施予串刺激，频率100Hz，串长1s，强度、波宽与测试刺激相同。15min后，用测试刺激进行检测，连续观察60min，如果串刺激后PS振幅增大30%以上，并持续超过30min，即可认为该动物的海马Schaffer侧枝与CA1区锥体细胞的突触部位产生了LTP现象。
1.3 统计学处理
峰潜期为从刺激伪迹到PS波峰的时间。突触传递增强的计算方法是串刺激后单脉冲诱发的PS的振幅与串刺激前单脉冲诱发的PS的振幅平均值之差再除以该平均值，即以PS增幅的相对百分率作为衡量LTP效应的指标。不同组之间LTP强化程度的比较采用串刺激后某一时间段内振幅增大的百分率以t检验比较差异是否显著。
2 结果
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2.1 LTP诱出率的比较
海马CA1区群体电位波形主要由fEPSP和叠加于其上的PS两个成份组成。无论以PS或fEPSP为指标，1月龄大鼠LTP的诱出率均是最低，虽然2月龄大鼠LTP诱出率稍高于6月龄大鼠，但两者差异不显著(P>0.05)，见图1。
图1 发育早期和成年大鼠LTP诱出率的比较
Fig 1 Comparison of the probability of the induction rate ofLTP between early developmental stage and adult rats
, http://www.100md.com 2.2 串刺激前后各组大鼠海马CA1区PS峰潜期的比较，见表1
串刺激(TS)后，2月龄大鼠平均峰潜期较串刺激前显著缩短(P<0.05)，1、6月龄大鼠平均峰潜期无明显的缩短(P>0.05)。
2.3 各组大鼠串刺激后PS及fEPSP斜率增幅的比较
见图2，1、2、6月龄各组大鼠PS峰值在串刺激后均明显增加，其中2月龄大鼠PS增幅的百分率较其他两组升高得更为显著(P<0.05)，平均峰潜期较串刺激前显著缩短，持续时间达1 h以上。1月龄组大鼠串刺激后，PS增幅百分率升高最小，与2月龄小鼠相比差异显著(P<0.01)。fEPSP的变化与PS的变化基本一致，见图3。表明2月龄组大鼠LTP效应明显强于其他年龄大鼠。
表1 串刺激前后海马CA1区PS峰潜期的变化(t/ms，x±s)
, 百拇医药
Tab 1 Changes of spike latency of PS in hippocampal CA1 area before and after tetanic stimulus(t/ms,x±s)
Group
(Month)
n
Pre-TS
Post-TS
1
7
3.21±0.53
2.97±0.41
, 百拇医药
2
8
3.11±0.29
2.59±0.21*
6
7
3.09±0.43
2.76±0.42
*：P<0.05 vs pre-TS
图2 串刺激后发育早期大鼠和成年大鼠PS峰值的比较
, http://www.100md.com
Fig 2 Comparison of PS amplitude after tetanic stimulation between early developmental stage and adult rats
图3 发育早期和成年大鼠刺激后fEPSP斜率的比较
Fig 3 Comparison of fEPSP slope after tetanic stimulation between early developmental stage and adult rats
3 讨论
LTP现象最先是在整体动物上发现的[5]，后来才发展到在离体脑片上进行研究。以整体动物为实验对象可以完整地反映机体生理状态，有离体脑片不具备的优越性。来自CA3区锥体细胞的Schaffer侧枝与CA1区锥体细胞树突形成突触，刺激Schaffer侧枝使CA1区锥体细胞任何树突层受刺激均可诱出LTP。常用PS振幅增大或fEPSP斜率增大来判定突触传递是否强化以及是否出现LTP[6]。本实验以频率100 Hz，串长1s的强直刺激在各年龄组均不同水平地诱发出LTP，其持续时程与文献报道一致。
, 百拇医药
LTP的发育变化近来引起一些学者的兴趣。Ito[7]发现NMDA受体ε1亚单位基因敲除小鼠LTP的幅度降低，在2～3周减少到最低。Teyler的实验表明大鼠生后6～10d在海马和皮层就可诱出LTP，生后15d LTP的幅值最高。Barnes[8]曾报道28～32月龄大鼠LTP效应远较10～16月龄大鼠差，而且在空间分辨学习任务中记忆力也较差，表明发育过程中LTP效应与学习、记忆紧密相关。本实验研究了1、2、6月龄大鼠在体LTP的发育变化，结果显示，1月龄大鼠LTP的诱出率最低；串刺激后，2月龄大鼠平均峰潜期较串刺激前显著缩短，1、6月龄大鼠无明显变化；各年龄组大鼠PS峰值以及fEPSP斜率在串刺激后均明显增加，2月龄大鼠PS和fEPSP斜率增幅的百分率较其他两组升高得更为显著。这些结果表明，随发育的进程，海马CA1区LTP现象由弱到强，进而减弱，2月龄大鼠LTP效应明显强于其他年龄大鼠，这一特点与学习记忆行为的发育变化基本吻合。
国家自然科学基金资助项目，No.39670249
, http://www.100md.com
作者简介：熊鹰，男，33岁，讲师，博士
参考文献
1 Hoffmann H, Hunt P S，Spear N E.Ontogenetic differen-ces in the association of gustatory and tactile cues with lithium chloride and footshock. Behavioral and Neural Biology,1996,53(2):441
2 Bliss T V P，Collingridge G L.A synaptic model of memory:long-term potentiation in the hippocampus. Nature,1993,361(6427):31
3 Bolshakov V Y，Siegelbaum S A.Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science,1995,269(5237):1730
, 百拇医药
4 Durand G M, Kovalchuk Y, Konnerth A. Long-term potentiation and functional synapse induction in developing hippocampus. Nature,1996,381(6577):71
5 Bliss T V P，Gradner-Medwin A R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol,1973,232(2):357
6 Scharfman H E. Postsynaptic firing during reptitive stimulation is required for long-term potentiation in hippocampus. Brain Res,1985,331(1):267
, http://www.100md.com
7 Ito I, Sakimura K, Mishina M, et al. Age-dependent reduction of hippocampal LTP in mice lacking N-methyl-D-aspartate receptor epsilon 1 subunit. Neurosci-Lett,1996,203(1):69
8 Barnes C A. Memory dificits associated with senescence: A neurophsiological and behavioural study in the rat. J Comp Physiol and Psychol,1979,93(1):74
(收稿：1998-07-14；修回：1998-10-07), 百拇医药