外周血CD34＋细胞移植(2)
作者：达万明
单位：中国人民解放军总医院血液科，北京 100853
关键词：CD34+；细胞移植；细胞正净化；细胞分选；免疫磁珠分离法；CliniMACS细胞分选系统；异基因；ZHLA半相合移植
现代诊断与治疗990502
中图分类号：R55；R457 文献标识码：A 文章编号：1001-8174(1999)05-0260-02
CD34+ Peripheral Blood Stem Cell Transplantation (2)
DA Wan-ming
(Department of Hematology,Chinese PLA General Hospital & Postgraduate Medical College,Beijing 100853,China)
, http://www.100md.com
6 异基因外周血CD34+细胞移植的临床应用
6.1 MLA相合同胞移植 比较异基因骨髓移植而言，G-CSF动员的外周血白细胞分离产物中含的T淋巴细胞约多1个对数级。但近年越来越多的临床证实，HLA相合同胞间异基因外周血干细胞移植后急性GVHD的发生并不比骨髓移植后的高，但慢性GVHD的发生要高一些，且临床表现有所不同。一般来讲，引起临床急性GVHD发生的T细胞输注量约为(0.1～1)×106/kg体重。实践证明，将造血细胞因子动员的外周血白细胞分离产物经分选富集CD34+细胞后，不仅可获得高纯度足量CD34+细胞用于临床移植，还可去除2～4个对数级的T淋巴细胞，这对异基因之间移植后减少GVHD的发生有十分重要的意义。另一方面，T细胞去除又可增加移植物排斥反应及肿瘤复发，人们在试图用强化移植前预处理方案或增加移植造血干细胞量来克服之外，也在探讨移植后回输一定量的供者外周血淋巴细胞来增加移植物抗肿瘤反应(GVL)[20]。
, 百拇医药
Urbano-Ispizua等[21]报告62例HLA相合同胞间CD34+细胞移植的结果，证实CD34+细胞移植确可降低急、慢性GVHD发生率及严重度，同时移植后造血恢复迅速，移植相关死亡率低，对于疾病复发率无显著的影响。高数量造血干/祖细胞的输入是移植形成完全供体型嵌合体的重要因素，Briones等[22]证实临床特征相似的分选异基因外周血CD34+移植比未去T细胞异基因骨髓移植后的受者更易形成供者型完全嵌合体，究其原因，是前者CD34+细胞的移植量高于后者数倍，Barrett等[23]则发现，提高CD34+输注剂量是减少移植后复发的独立因素，他们还在异基因外周血CD34+细胞移植后45和100天分别输注有限量供体CD3+细胞，明显提高了疗效。可见，分选富集异基因外周血CD34+细胞移植不仅有移植造血干/祖细胞浓度高、移植后容易形成供者型完全嵌合体、造血免疫功能重建迅速、移植相关死亡率低等优点，如果移植后一定时间再回输有限量的供者T细胞还将进一步提高疗效。
, http://www.100md.com
由于外周血CD34+细胞移植有如上优点，其主要用途如下：(1)用于HLA相合家族成员间的移植，以减少或减轻GVHD；(2)用于HLA不全相合(1～3个位点不合)家族成员间的移植，不仅减轻GVHD，且可增加移植细胞量以减少移植物排斥反应；(3)从同一家族供体中输注CD34+细胞，增强骨髓增生欠佳受体的造血功能；(4)适用于HLA相合无关供受体间的移植；(5)用于将供体CD34+细胞和T细胞分离后分别先后移植和输注；(6)适于分选CD34+细胞体外扩增后的移植和输注；(7)用于体外产生和扩增抗原特异性免疫效应细胞和抗原递呈细胞，以进行细胞治疗。
6.2 HLA半相合及无关供者移植 与HLA相合同胞移植比较，HLA半相合移植和无关供者移植困难更多。主要问题是植入失败、重症急性GVHD、更高且严重的各种感染发生率和移植相关性死亡率高。但在恶性疾病接受此种移植后疾病复发率较HLA相合同胞移植者低。近年认为，高危型恶性血液病患者在无HLA相合供者的情况下，可采用HLA半相合亲属或无关供者分选异基因外周血CD34+细胞移植[24]。
, 百拇医药
需要提及的是，在HLA半相合或HLA相合无关供体移植中，足够数量的CD34+细胞是移植成功和维持稳定造血重建的关键之一。通常认为，HLA相合同胞间移植时，CD34+细胞数应在4×106/kg以上，对HLA半相合或HLA相合无关供体间的移植，CD34+细胞的移植量要更高，约10×106/kg左右，同时注意T细胞的限量。由于分选富集CD34+细胞过程中不可避免有细胞的丢失，要采集到足量移植细胞需要更强烈有效的动员方案和采集技术，特别是细胞生长因子的合理应用尤其重要。
由于所用仪器性能、试剂质量及操作技术不同，一些病例在经CD34+分选后CD3+细胞含量仍在1×105/kg以上，故可采用两步法提高去除T细胞的效果[24]。如先采用CD34+细胞阳性分选法，再用抗CD3单克隆抗体进一步去除T细胞；或先采用E花结去除T细胞后再分选和富集CD34+细胞等，如此可将CD3+细胞控制在1×105/kg以下水平。“两步法”CD34+细胞的回收率达50%左右，而T或B或肿瘤细胞的去除达4个对数级以上[25]。
, 百拇医药
最后需要注意CD34+分选后CD34-细胞组分的保存和再回输。一般在分选CD34+细胞后，CD34-组分中约含CD3+细胞>107/kg。回输CD34-组分细胞的实质是回输其中的CD3+细胞，以诱发或增强移植物抗肿瘤反应、加速免疫功能重建，防治肿瘤复发。它的主要应用指征是：(1)移植后原肿瘤标志仍然阳性；(2)移植后2～3月供体仍然是混合嵌合体且受体细胞有较高比例；(3)白血病或肿瘤有基因或临床复发等。有效资料证明，虽然CD34-细胞的回复对以上治疗目的显示一定疗效，然而，CD34-细胞回复后常可诱发较重甚至致命的GVHD，因此对于CD34-细胞组分回复的时机、剂量、方法和策略有待深入的研究。
新近较大样本的临床应用结果进一步显示：(1)allo-PBCD34+细胞移植可显著降低急性及慢性GVHD的发生率及严重度，提高了临床移植的安全性；(2)初步结果提示移植后造血和免疫功能重建较allo-BMT者快；(3)其安全性使年龄偏大的患者(50～60岁)也能耐受移植；(4)拓宽了供者选择范围，使更多的缺少HLA相合同胞供者的患者有可能从HLA半相合或无关供者移植中受益。但对CD34+细胞移植的适应范围，移植后并发症，白血病复发率和生存率的评估，尚需更多病例和更长时间的随访分析。
, 百拇医药
7 CD34+细胞移植在基因治疗、免疫治疗等方面的前景
7.1 CD34+细胞的体外扩增 即便在动员后，从骨髓或外周血中有时也很难分选到临床应用所需的量，因此研究将有限的CD34+细胞在体外扩增，以获得足够临床应用量是近年来研究的重要课题之一。初步证明，CD34+细胞扩增后移植能够建立稳定的长期造血功能[26]。CD34+细胞的体外扩增还有如下好处：(1)可应用多次强化后的支持治疗；(2)减少外周血白细胞分离次数；(3)移植后造血重建的速度可与未经培养的CD34+细胞移植相媲美；(4)尤其有意义的是，可将有限的脐血CD34+扩增到成人临床所需移植的剂量。
7.2 从CD34+细胞发生树突状细胞的免疫治疗 近年的研究证实树突状细胞在T细胞免疫中发挥着关键的作用，研究还证实，体外培养生长的树突状细胞也具有正常的抗原递呈能力，甚至更强[27]。
, 百拇医药
7.3 CD34+细胞与基因治疗 分选富集的CD34+细胞移植其实就是造血干/祖细胞移植，自体造血干细胞具有转导基因靶细胞的一切条件，因而，CD34+细胞是理想的基因治疗靶细胞。目前，对Gaucher氏病及其它遗传性血液病，如Fanconi贫血及X-性联重症联合免疫缺陷症等的基因治疗中已获得初步成果[28，29]。
总之CD34+细胞移植是造血细胞移植领域的前沿课题之一，随着对造血干细胞分子生物学特性的深入认识，细胞分选富集技术的精益求精和日趋成熟，体外培养扩增质量的进一步提高等，其在自体或异体移植临床及基因治疗中的应用必将越来越广泛。然而，在自体移植中，为了提高移植物中肿瘤细胞的清除率，应寻找CD34阳性筛选与其它净化方法相结合的新的更加高效特异的方法，同时探讨进一步降低移植后的复发率。在异体移植中，CD34+细胞移植物中T淋巴细胞被去除，移植后排斥率和复发率增高趋势问题仍有待研究。还有脐血CD34+的体外扩增；基因治疗时如何提高靶基因转染率和永久性高表达等，这些问题都是今后继续探求的课题。
, 百拇医药
作者简介：达万明(1946-)，男，甘肃永登县人，中国人民解放军总医院、解放军军医进修学院教授，主任医师，硕士，1984年赴澳大利亚新南威尔士州立大学圣.文森特医院研修，1989年赴法国巴黎居里大学圣.安托万医学院客座研究，主要从事血液学的基础和临床研究。
参考文献：
[20]Stoppa AM,Aurran T,Chabannon C,et al.Feasibility of CD34+ seleced allogeneic bone marrow transplantation followed after 2 months by prophylactic donor lymphocytes infusion in high risk hematologic malignancies[J].Blood,1998,92(Suppl 1):454a.
, 百拇医药
[21]Urbano-Ispizua A,Solano C,Bruner S,et al.Allogeneic transplantation of selected CD34+ cells from peripheral blood :experience of 62 cases using immunoadsorption or immunomagnetic technique[J].Bone Marrow Transplant,1998,22:519-525.
[22]Briones J,Urbano-Ispizua A,Lawler M,et al.High frequency of donor chimerism after allogenetic transplantation of CD34+ selected peripheral blood cells[J].Exp Hematol,1998,26:415-420.
, 百拇医药
[23]Barrett J,Bahceci E,Childs R,et al.High CD34+ dose lowers relapse risk in standard and high risk recipients of allogeneic bone marrow or peripheral blood stem cell transplantation[J].Blood,1998,92(Suppl 2):139a.
[24]Dazey B,Boiron JM,Hamsany M,et al.CD34+ hematopoietic progenitor cells selection from peripheral blood:allogeneic stem cells transplantation for refractory leukemia[J].Bone Marrow Transplant,1998,21(Suppl 1):s17.
, 百拇医药
[25]Bertolini F,Thomas T,Battaglia M,et al.A new "two step" procedure for 4.5 depletion of T and B cells in allogeneic transplantation and of neoplastic cells in autologous transplantation[J].Bone Marrow Transplant,1997,19:615-620.
[26]Williams SF,Lee WJ,Bender JG,et al.Selection and expansion of peripheral blood CD34+ cells ia autologous stem cell transplantation for breast cancer[J].Blood,1996,87:1687-1691.
[27]Jonathan M,Austyn MA.Dendritic cells[J].Current Opin Hematol,1998,5:3-15.
, 百拇医药
[28]Nolta JA,YU XJ,Bahner I,et al.Retroviral-mediated transfer of the human glucocerebrosidase gene into cultured Gaucher bone marrow[J].J Clin Invest,1992,90:342-348.
[29]Nimgaokar M,Mierski J,Beeler M,et al.Cytokine mobilization of peripheral blood stem cells in patients with Gaucher disease with a view to gene therapy[J].Exp Hematol,1995,23:1633-1641.
收稿日期：1999-06-18, 百拇医药
单位：中国人民解放军总医院血液科，北京 100853
关键词：CD34+；细胞移植；细胞正净化；细胞分选；免疫磁珠分离法；CliniMACS细胞分选系统；异基因；ZHLA半相合移植
现代诊断与治疗990502
中图分类号：R55；R457 文献标识码：A 文章编号：1001-8174(1999)05-0260-02
CD34+ Peripheral Blood Stem Cell Transplantation (2)
DA Wan-ming
(Department of Hematology,Chinese PLA General Hospital & Postgraduate Medical College,Beijing 100853,China)
, http://www.100md.com
6 异基因外周血CD34+细胞移植的临床应用
6.1 MLA相合同胞移植 比较异基因骨髓移植而言，G-CSF动员的外周血白细胞分离产物中含的T淋巴细胞约多1个对数级。但近年越来越多的临床证实，HLA相合同胞间异基因外周血干细胞移植后急性GVHD的发生并不比骨髓移植后的高，但慢性GVHD的发生要高一些，且临床表现有所不同。一般来讲，引起临床急性GVHD发生的T细胞输注量约为(0.1～1)×106/kg体重。实践证明，将造血细胞因子动员的外周血白细胞分离产物经分选富集CD34+细胞后，不仅可获得高纯度足量CD34+细胞用于临床移植，还可去除2～4个对数级的T淋巴细胞，这对异基因之间移植后减少GVHD的发生有十分重要的意义。另一方面，T细胞去除又可增加移植物排斥反应及肿瘤复发，人们在试图用强化移植前预处理方案或增加移植造血干细胞量来克服之外，也在探讨移植后回输一定量的供者外周血淋巴细胞来增加移植物抗肿瘤反应(GVL)[20]。
, 百拇医药
Urbano-Ispizua等[21]报告62例HLA相合同胞间CD34+细胞移植的结果，证实CD34+细胞移植确可降低急、慢性GVHD发生率及严重度，同时移植后造血恢复迅速，移植相关死亡率低，对于疾病复发率无显著的影响。高数量造血干/祖细胞的输入是移植形成完全供体型嵌合体的重要因素，Briones等[22]证实临床特征相似的分选异基因外周血CD34+移植比未去T细胞异基因骨髓移植后的受者更易形成供者型完全嵌合体，究其原因，是前者CD34+细胞的移植量高于后者数倍，Barrett等[23]则发现，提高CD34+输注剂量是减少移植后复发的独立因素，他们还在异基因外周血CD34+细胞移植后45和100天分别输注有限量供体CD3+细胞，明显提高了疗效。可见，分选富集异基因外周血CD34+细胞移植不仅有移植造血干/祖细胞浓度高、移植后容易形成供者型完全嵌合体、造血免疫功能重建迅速、移植相关死亡率低等优点，如果移植后一定时间再回输有限量的供者T细胞还将进一步提高疗效。
, http://www.100md.com
由于外周血CD34+细胞移植有如上优点，其主要用途如下：(1)用于HLA相合家族成员间的移植，以减少或减轻GVHD；(2)用于HLA不全相合(1～3个位点不合)家族成员间的移植，不仅减轻GVHD，且可增加移植细胞量以减少移植物排斥反应；(3)从同一家族供体中输注CD34+细胞，增强骨髓增生欠佳受体的造血功能；(4)适用于HLA相合无关供受体间的移植；(5)用于将供体CD34+细胞和T细胞分离后分别先后移植和输注；(6)适于分选CD34+细胞体外扩增后的移植和输注；(7)用于体外产生和扩增抗原特异性免疫效应细胞和抗原递呈细胞，以进行细胞治疗。
6.2 HLA半相合及无关供者移植 与HLA相合同胞移植比较，HLA半相合移植和无关供者移植困难更多。主要问题是植入失败、重症急性GVHD、更高且严重的各种感染发生率和移植相关性死亡率高。但在恶性疾病接受此种移植后疾病复发率较HLA相合同胞移植者低。近年认为，高危型恶性血液病患者在无HLA相合供者的情况下，可采用HLA半相合亲属或无关供者分选异基因外周血CD34+细胞移植[24]。
, 百拇医药
需要提及的是，在HLA半相合或HLA相合无关供体移植中，足够数量的CD34+细胞是移植成功和维持稳定造血重建的关键之一。通常认为，HLA相合同胞间移植时，CD34+细胞数应在4×106/kg以上，对HLA半相合或HLA相合无关供体间的移植，CD34+细胞的移植量要更高，约10×106/kg左右，同时注意T细胞的限量。由于分选富集CD34+细胞过程中不可避免有细胞的丢失，要采集到足量移植细胞需要更强烈有效的动员方案和采集技术，特别是细胞生长因子的合理应用尤其重要。
由于所用仪器性能、试剂质量及操作技术不同，一些病例在经CD34+分选后CD3+细胞含量仍在1×105/kg以上，故可采用两步法提高去除T细胞的效果[24]。如先采用CD34+细胞阳性分选法，再用抗CD3单克隆抗体进一步去除T细胞；或先采用E花结去除T细胞后再分选和富集CD34+细胞等，如此可将CD3+细胞控制在1×105/kg以下水平。“两步法”CD34+细胞的回收率达50%左右，而T或B或肿瘤细胞的去除达4个对数级以上[25]。
, 百拇医药
最后需要注意CD34+分选后CD34-细胞组分的保存和再回输。一般在分选CD34+细胞后，CD34-组分中约含CD3+细胞>107/kg。回输CD34-组分细胞的实质是回输其中的CD3+细胞，以诱发或增强移植物抗肿瘤反应、加速免疫功能重建，防治肿瘤复发。它的主要应用指征是：(1)移植后原肿瘤标志仍然阳性；(2)移植后2～3月供体仍然是混合嵌合体且受体细胞有较高比例；(3)白血病或肿瘤有基因或临床复发等。有效资料证明，虽然CD34-细胞的回复对以上治疗目的显示一定疗效，然而，CD34-细胞回复后常可诱发较重甚至致命的GVHD，因此对于CD34-细胞组分回复的时机、剂量、方法和策略有待深入的研究。
新近较大样本的临床应用结果进一步显示：(1)allo-PBCD34+细胞移植可显著降低急性及慢性GVHD的发生率及严重度，提高了临床移植的安全性；(2)初步结果提示移植后造血和免疫功能重建较allo-BMT者快；(3)其安全性使年龄偏大的患者(50～60岁)也能耐受移植；(4)拓宽了供者选择范围，使更多的缺少HLA相合同胞供者的患者有可能从HLA半相合或无关供者移植中受益。但对CD34+细胞移植的适应范围，移植后并发症，白血病复发率和生存率的评估，尚需更多病例和更长时间的随访分析。
, 百拇医药
7 CD34+细胞移植在基因治疗、免疫治疗等方面的前景
7.1 CD34+细胞的体外扩增 即便在动员后，从骨髓或外周血中有时也很难分选到临床应用所需的量，因此研究将有限的CD34+细胞在体外扩增，以获得足够临床应用量是近年来研究的重要课题之一。初步证明，CD34+细胞扩增后移植能够建立稳定的长期造血功能[26]。CD34+细胞的体外扩增还有如下好处：(1)可应用多次强化后的支持治疗；(2)减少外周血白细胞分离次数；(3)移植后造血重建的速度可与未经培养的CD34+细胞移植相媲美；(4)尤其有意义的是，可将有限的脐血CD34+扩增到成人临床所需移植的剂量。
7.2 从CD34+细胞发生树突状细胞的免疫治疗 近年的研究证实树突状细胞在T细胞免疫中发挥着关键的作用，研究还证实，体外培养生长的树突状细胞也具有正常的抗原递呈能力，甚至更强[27]。
, 百拇医药
7.3 CD34+细胞与基因治疗 分选富集的CD34+细胞移植其实就是造血干/祖细胞移植，自体造血干细胞具有转导基因靶细胞的一切条件，因而，CD34+细胞是理想的基因治疗靶细胞。目前，对Gaucher氏病及其它遗传性血液病，如Fanconi贫血及X-性联重症联合免疫缺陷症等的基因治疗中已获得初步成果[28，29]。
总之CD34+细胞移植是造血细胞移植领域的前沿课题之一，随着对造血干细胞分子生物学特性的深入认识，细胞分选富集技术的精益求精和日趋成熟，体外培养扩增质量的进一步提高等，其在自体或异体移植临床及基因治疗中的应用必将越来越广泛。然而，在自体移植中，为了提高移植物中肿瘤细胞的清除率，应寻找CD34阳性筛选与其它净化方法相结合的新的更加高效特异的方法，同时探讨进一步降低移植后的复发率。在异体移植中，CD34+细胞移植物中T淋巴细胞被去除，移植后排斥率和复发率增高趋势问题仍有待研究。还有脐血CD34+的体外扩增；基因治疗时如何提高靶基因转染率和永久性高表达等，这些问题都是今后继续探求的课题。
, 百拇医药
作者简介：达万明(1946-)，男，甘肃永登县人，中国人民解放军总医院、解放军军医进修学院教授，主任医师，硕士，1984年赴澳大利亚新南威尔士州立大学圣.文森特医院研修，1989年赴法国巴黎居里大学圣.安托万医学院客座研究，主要从事血液学的基础和临床研究。
参考文献：
[20]Stoppa AM,Aurran T,Chabannon C,et al.Feasibility of CD34+ seleced allogeneic bone marrow transplantation followed after 2 months by prophylactic donor lymphocytes infusion in high risk hematologic malignancies[J].Blood,1998,92(Suppl 1):454a.
, 百拇医药
[21]Urbano-Ispizua A,Solano C,Bruner S,et al.Allogeneic transplantation of selected CD34+ cells from peripheral blood :experience of 62 cases using immunoadsorption or immunomagnetic technique[J].Bone Marrow Transplant,1998,22:519-525.
[22]Briones J,Urbano-Ispizua A,Lawler M,et al.High frequency of donor chimerism after allogenetic transplantation of CD34+ selected peripheral blood cells[J].Exp Hematol,1998,26:415-420.
, 百拇医药
[23]Barrett J,Bahceci E,Childs R,et al.High CD34+ dose lowers relapse risk in standard and high risk recipients of allogeneic bone marrow or peripheral blood stem cell transplantation[J].Blood,1998,92(Suppl 2):139a.
[24]Dazey B,Boiron JM,Hamsany M,et al.CD34+ hematopoietic progenitor cells selection from peripheral blood:allogeneic stem cells transplantation for refractory leukemia[J].Bone Marrow Transplant,1998,21(Suppl 1):s17.
, 百拇医药
[25]Bertolini F,Thomas T,Battaglia M,et al.A new "two step" procedure for 4.5 depletion of T and B cells in allogeneic transplantation and of neoplastic cells in autologous transplantation[J].Bone Marrow Transplant,1997,19:615-620.
[26]Williams SF,Lee WJ,Bender JG,et al.Selection and expansion of peripheral blood CD34+ cells ia autologous stem cell transplantation for breast cancer[J].Blood,1996,87:1687-1691.
[27]Jonathan M,Austyn MA.Dendritic cells[J].Current Opin Hematol,1998,5:3-15.
, 百拇医药
[28]Nolta JA,YU XJ,Bahner I,et al.Retroviral-mediated transfer of the human glucocerebrosidase gene into cultured Gaucher bone marrow[J].J Clin Invest,1992,90:342-348.
[29]Nimgaokar M,Mierski J,Beeler M,et al.Cytokine mobilization of peripheral blood stem cells in patients with Gaucher disease with a view to gene therapy[J].Exp Hematol,1995,23:1633-1641.
收稿日期：1999-06-18, 百拇医药