造血干细胞多药耐药P-糖蛋白的表达及多药耐药逆转剂对其功能的影响
作者：
单位：陈智超 邹萍 游泳 刘仲萍 宋善俊 武汉 同济医科大学血液病研究所
关键词：造血干细胞；P-糖蛋白；多药耐药逆转剂
临床血液学杂志990502 陈智超 竹下明裕 邹萍 游泳 高阪勉 刘仲萍 宋善俊 大西一功 大野
三
摘要 目的：了解多药耐药P-糖蛋白(P-gp)在造血干/祖细胞的表达，探讨多药耐药逆转剂在临床应用过程中可能对造血干细胞的损害。方法：采用MRK16单克隆抗体，利用流式细胞仪测定健康人骨髓CD34阳性细胞表面P-gp的表达；将多药耐药逆转剂MS-209作用于造血细胞，检测MS-209对CD34阳性细胞摄取染料Rhodamin-123的影响。结果：骨髓CD34阳性细胞的P-gp表达率为13.3%，MS-209明显增加CD34阳性细胞对Rhodamin-123的摄入(18.1%)。结论：造血干细胞表达P-gp蛋白并且具有活性功能；多药耐药逆转剂可以抑制其P-gp的膜泵出功能，提示在临床应用中可能会增加化疗药物对造血干细胞的损害。
, 百拇医药
The Expression of P-glycoprotein in Hemapoietic Stem Cells and the Influence of Multidrug Resistance Modifier to the Activity of P-glycoprotein
Chen Zhichao1，Takeshita Akihiro2,Zou Ping1,et al
1 Institute of Hematology,Union Hospital,Tongji Medical Univ.,Wuhan
2 Department of Medicaine Ⅲ,Hamamatsu Univ.School of Med,Japan
, 百拇医药
Abstract Objective:To investigate the possible clinical side effect of multidrug resistance (MDR) modifier to hemapoietic stem cells during chemotherapy.Method:The expression and activity of MDR P-glycoprotein (P-gp) in CD34 positive subpopulation from normal bone marrow cells were detected using MRK16 monoclonal antibody and a new MDR modifier MS-209 with flowcytometry techn.Result:The expression of P-gp in the CD34 positive subpopulation in normal bone marrow were confirmed (positive rate were 13.3%),MS-209 can significantly increase the uptake of Rhodamin-123 of CD34 positive cells (increase rate were 18.1%).Conclusion:MDR modifier can inhibit the function of P-gp CD34 positive cells.The clinical using of MDR modifier possibly increase the cytotoxicity of antitumor drugs to normal hemapoietic stem cells.
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Key words CD34 P-glycoprotein Multidrug resistance
急性白血病治疗中的一大障碍是白血病细胞常常出现多药耐药现象。细胞膜上多药耐药P-糖蛋白(P-gp)的表达是其主要原因之一〔1〕。最近，能阻滞P-糖蛋白功能的多药耐药逆转剂的研究已成为一大热点，有些已开始进入临床试验〔2〕。这些多药耐药逆转剂对正常造血细胞的影响尚不清楚，在临床应用中是否会增加化疗药物对造血干细胞的损害，是人们关心的问题。为此，我们采用流式细胞仪及双标记单克隆抗体检测了正常骨髓CD34阳性细胞上P-gp的表达及新型多药耐药逆转剂MS-209(为奎宁类衍生物，化学结构见附图)对其P-gp功能的影响。
附图 MS-209的化学结构式
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞的采集与分离 抽取健康志愿献髓者的骨髓，肝素抗凝。以Ficoll-Hypaque作梯度密度离心收集单个核细胞(MNC)，用红细胞溶解液(0.826%NH4Cl，0.1%KHCO3，0.0037%EDTA-2Na，pH7.3)将其中的红细胞溶解后，以含2%胎牛血清(FCS)的磷酸缓冲生理盐水(PBS)洗涤细胞2次，调整细胞浓度在2×106/ml。苔盼蓝据染试验活细胞数>95%。
1.2 P-gp抗原量(positivity)检测 悬浮细胞与0.5%Polyglobin孵育1 h，以抑制非特异性反应。将细胞与生物素化的MRK 16单抗(b-MRK-16，由日本东京大学医科研鹤尾隆教授惠赠)，在冰上孵育后、洗净，然后与FITC标记的抗HPCA2(CD34)(Becton Dickinson)单抗及SA-RED670(GIBCD BRL)孵育，洗涤2次后用流式细胞仪检测(Epics Elite)。计数分析30万个细胞。对照抗体为与MRK 16同型的生物素化IgG2a。
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1.3 MS-209对细胞内Rhodamin-123(Rh123)浓度的影响 细胞在37℃下与MS-209(由日本东京大学医科研鹤尾隆教授惠赠，终浓度10 μm)孵育，不作洗涤，然后与PE标记的抗HPCA2(CD34)单抗及Rh123在室温下孵育，洗涤2次后上机检测，计数分析30万个细胞。对照为未与MS-209作用的细胞，步骤同前。
1.4 数据分析 将实验组与对照组的荧光强度组方图进行叠加，以Epics Elite流式细胞仪的组方图统计软件，按channel-by-channel方法计算出组间的差异值。
2 结果
在SS-CD34散点图上对CD34阳性细胞设门进行分析。门内细胞MRK 16抗体的荧光强度为1.95±1.54，对照IgG2a的荧光强度为1.61±1.33，其差异即CD34阳性细胞的P-gp表达量为13.3%。MS-209作用后细胞内Rh123荧光强度为8.54±7.32，无MS-209作用的对照细胞内Rh123荧光强度为6.73±6.60。MS-209使CD34阳性细胞内Rh123的浓度增加18.1%。
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3 讨论
肿瘤的治疗过程中常常出现多药耐药现象，其主要分子生物学基础之一是肿瘤细胞膜上表达P-gp，此蛋白具有膜泵出功能，可以将化疗药物等物质泵出细胞外，从而导致肿瘤细胞的抗药性。而在部分正常组织细胞膜上也有此蛋白的表达，其生理功能可能属于细胞的一种自我保护作用。理论上通过拮抗P-gp的功能而起逆转肿瘤细胞多药耐药的药物，如不具备选择性，也应对正常细胞上的P-gp功能有所抑制，其程度高低直接影响到此类药物在临床的应用。
为了证实造血干细胞上有这种P-gp的表达，我们采用了目前公认的识别P-gp最为特异的MRK 16单克隆抗体。考虑到造血干细胞数量较少及其表达抗原可能相对较弱，我们采用了日本学者Takeshita报道的方法〔3〕，即以生物素化的MRK 16与亲和素化的RED 670相结合的间接法，结合流式细胞检测技术来提高检出P-gp的敏感性。结果证实，在CD34阳性细胞上具有一定程度的P-gp表达。CD34阳性造血细胞表达P-gp的生理意义尚不清楚。有报道它与造血干细胞的分化等有关，但从P-gp的膜泵出功能考虑，它亦是干细胞能够避免一些外来物质(如体内毒物、化疗药物等)对细胞损害的分子基础。
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自1981年鹤尾等发现异博定能够逆转肿瘤细胞的多药耐药以来，又发现很多钙拮抗剂及环胞素等药物具有此类作用，并有部分药物已用于临床研究〔4，5〕。但这些药物的主要药理作用限制了它们在逆转多药耐药方面的应用。因此，主要药理作用为拮抗P-gp而起逆转耐药作用的新一代多药耐药逆转剂正在进行研究，MS-209由日本学者鹤尾等研制，具有较强的拮抗P-gp功能，在体外能有效逆转肿瘤细胞的多药耐药性，目前在日本已进入临床试验阶段〔2〕。然而，有关MS-209等P-gp抑制剂对正常造血干细胞的作用尚未引起重视，而这种作用会影响该类药物在临床应用效果的发挥及应用范围。本研究证实MS-209能够部分阻滞CD34阳性细胞上P-gp的功能，从而导致细胞对Rh123泵出功能的减低，提示MS-209在化疗中应用时可能会增加造血干细胞对化疗药物的摄取，从而导致化疗药物临床毒性的增加。因此，临床使用多药耐药逆转药物来逆转肿瘤的多药耐药性时，应充分考虑到对正常造血干细胞的毒副作用。如何研制具有选择性作用于肿瘤细胞的多药耐药逆转剂是今后的重要课题。
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*邮政编码：武汉，430022
作者单位：竹下明裕 高阪勉 大西一功 大野三 日本滨松医科大学第三内科
参考文献
[1] Musto P,Melillo L,Lombardi G,et al.High risk of early resistant relapse for leukemia patients with presence of multidrug resistance associated P-glycoprotein positive cells in complete remission.Br J Haematotol,1991,77:50～53
[2] 冢本文英，芝英一.多剂耐性克服剂MS-209の效果.医学のあゆみ，1998，184(5)：305～307
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[3] Tekeshita A,Shinjo K,Kozaka M,et al.New flow cytometer method for dectection of minimally expressed multidrug resistance P-glycoprotein on normal and acute leukemia cells using biotinylated MRK 16 and Streptavidin-RED 670 conjugate.Jan Cancer Res,1995,86:607～615
[4] Tsuruo T,lida H,Tsukagoshi S,et al.Overcoming of vincristine resistance in P388 leukemia in vivo and vitro through enhanced cytotoxicity of vincristine and vinblastine by verapamil.Cancer Res,1981,41:1967～1975
[5] Yano S,Sone S,Nishioka Y,et al.Cyclosporin A enhances susceptibility of multidrug resistance human cancer cells to anti-P-glycoprotein antibody-dependent cytotoxicity of monocytes,but not of lymphocytes.Jap J Cancer Res,1994,85(2):194～197
1999-05-24 收稿, 百拇医药
单位：陈智超 邹萍 游泳 刘仲萍 宋善俊 武汉 同济医科大学血液病研究所
关键词：造血干细胞；P-糖蛋白；多药耐药逆转剂
临床血液学杂志990502 陈智超 竹下明裕 邹萍 游泳 高阪勉 刘仲萍 宋善俊 大西一功 大野
三摘要 目的：了解多药耐药P-糖蛋白(P-gp)在造血干/祖细胞的表达，探讨多药耐药逆转剂在临床应用过程中可能对造血干细胞的损害。方法：采用MRK16单克隆抗体，利用流式细胞仪测定健康人骨髓CD34阳性细胞表面P-gp的表达；将多药耐药逆转剂MS-209作用于造血细胞，检测MS-209对CD34阳性细胞摄取染料Rhodamin-123的影响。结果：骨髓CD34阳性细胞的P-gp表达率为13.3%，MS-209明显增加CD34阳性细胞对Rhodamin-123的摄入(18.1%)。结论：造血干细胞表达P-gp蛋白并且具有活性功能；多药耐药逆转剂可以抑制其P-gp的膜泵出功能，提示在临床应用中可能会增加化疗药物对造血干细胞的损害。
, 百拇医药
The Expression of P-glycoprotein in Hemapoietic Stem Cells and the Influence of Multidrug Resistance Modifier to the Activity of P-glycoprotein
Chen Zhichao1，Takeshita Akihiro2,Zou Ping1,et al
1 Institute of Hematology,Union Hospital,Tongji Medical Univ.,Wuhan
2 Department of Medicaine Ⅲ,Hamamatsu Univ.School of Med,Japan
, 百拇医药
Abstract Objective:To investigate the possible clinical side effect of multidrug resistance (MDR) modifier to hemapoietic stem cells during chemotherapy.Method:The expression and activity of MDR P-glycoprotein (P-gp) in CD34 positive subpopulation from normal bone marrow cells were detected using MRK16 monoclonal antibody and a new MDR modifier MS-209 with flowcytometry techn.Result:The expression of P-gp in the CD34 positive subpopulation in normal bone marrow were confirmed (positive rate were 13.3%),MS-209 can significantly increase the uptake of Rhodamin-123 of CD34 positive cells (increase rate were 18.1%).Conclusion:MDR modifier can inhibit the function of P-gp CD34 positive cells.The clinical using of MDR modifier possibly increase the cytotoxicity of antitumor drugs to normal hemapoietic stem cells.
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Key words CD34 P-glycoprotein Multidrug resistance
急性白血病治疗中的一大障碍是白血病细胞常常出现多药耐药现象。细胞膜上多药耐药P-糖蛋白(P-gp)的表达是其主要原因之一〔1〕。最近，能阻滞P-糖蛋白功能的多药耐药逆转剂的研究已成为一大热点，有些已开始进入临床试验〔2〕。这些多药耐药逆转剂对正常造血细胞的影响尚不清楚，在临床应用中是否会增加化疗药物对造血干细胞的损害，是人们关心的问题。为此，我们采用流式细胞仪及双标记单克隆抗体检测了正常骨髓CD34阳性细胞上P-gp的表达及新型多药耐药逆转剂MS-209(为奎宁类衍生物，化学结构见附图)对其P-gp功能的影响。
附图 MS-209的化学结构式
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1 材料与方法
1.1 细胞的采集与分离 抽取健康志愿献髓者的骨髓，肝素抗凝。以Ficoll-Hypaque作梯度密度离心收集单个核细胞(MNC)，用红细胞溶解液(0.826%NH4Cl，0.1%KHCO3，0.0037%EDTA-2Na，pH7.3)将其中的红细胞溶解后，以含2%胎牛血清(FCS)的磷酸缓冲生理盐水(PBS)洗涤细胞2次，调整细胞浓度在2×106/ml。苔盼蓝据染试验活细胞数>95%。
1.2 P-gp抗原量(positivity)检测 悬浮细胞与0.5%Polyglobin孵育1 h，以抑制非特异性反应。将细胞与生物素化的MRK 16单抗(b-MRK-16，由日本东京大学医科研鹤尾隆教授惠赠)，在冰上孵育后、洗净，然后与FITC标记的抗HPCA2(CD34)(Becton Dickinson)单抗及SA-RED670(GIBCD BRL)孵育，洗涤2次后用流式细胞仪检测(Epics Elite)。计数分析30万个细胞。对照抗体为与MRK 16同型的生物素化IgG2a。
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1.3 MS-209对细胞内Rhodamin-123(Rh123)浓度的影响 细胞在37℃下与MS-209(由日本东京大学医科研鹤尾隆教授惠赠，终浓度10 μm)孵育，不作洗涤，然后与PE标记的抗HPCA2(CD34)单抗及Rh123在室温下孵育，洗涤2次后上机检测，计数分析30万个细胞。对照为未与MS-209作用的细胞，步骤同前。
1.4 数据分析 将实验组与对照组的荧光强度组方图进行叠加，以Epics Elite流式细胞仪的组方图统计软件，按channel-by-channel方法计算出组间的差异值。
2 结果
在SS-CD34散点图上对CD34阳性细胞设门进行分析。门内细胞MRK 16抗体的荧光强度为1.95±1.54，对照IgG2a的荧光强度为1.61±1.33，其差异即CD34阳性细胞的P-gp表达量为13.3%。MS-209作用后细胞内Rh123荧光强度为8.54±7.32，无MS-209作用的对照细胞内Rh123荧光强度为6.73±6.60。MS-209使CD34阳性细胞内Rh123的浓度增加18.1%。
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3 讨论
肿瘤的治疗过程中常常出现多药耐药现象，其主要分子生物学基础之一是肿瘤细胞膜上表达P-gp，此蛋白具有膜泵出功能，可以将化疗药物等物质泵出细胞外，从而导致肿瘤细胞的抗药性。而在部分正常组织细胞膜上也有此蛋白的表达，其生理功能可能属于细胞的一种自我保护作用。理论上通过拮抗P-gp的功能而起逆转肿瘤细胞多药耐药的药物，如不具备选择性，也应对正常细胞上的P-gp功能有所抑制，其程度高低直接影响到此类药物在临床的应用。
为了证实造血干细胞上有这种P-gp的表达，我们采用了目前公认的识别P-gp最为特异的MRK 16单克隆抗体。考虑到造血干细胞数量较少及其表达抗原可能相对较弱，我们采用了日本学者Takeshita报道的方法〔3〕，即以生物素化的MRK 16与亲和素化的RED 670相结合的间接法，结合流式细胞检测技术来提高检出P-gp的敏感性。结果证实，在CD34阳性细胞上具有一定程度的P-gp表达。CD34阳性造血细胞表达P-gp的生理意义尚不清楚。有报道它与造血干细胞的分化等有关，但从P-gp的膜泵出功能考虑，它亦是干细胞能够避免一些外来物质(如体内毒物、化疗药物等)对细胞损害的分子基础。
, http://www.100md.com
自1981年鹤尾等发现异博定能够逆转肿瘤细胞的多药耐药以来，又发现很多钙拮抗剂及环胞素等药物具有此类作用，并有部分药物已用于临床研究〔4，5〕。但这些药物的主要药理作用限制了它们在逆转多药耐药方面的应用。因此，主要药理作用为拮抗P-gp而起逆转耐药作用的新一代多药耐药逆转剂正在进行研究，MS-209由日本学者鹤尾等研制，具有较强的拮抗P-gp功能，在体外能有效逆转肿瘤细胞的多药耐药性，目前在日本已进入临床试验阶段〔2〕。然而，有关MS-209等P-gp抑制剂对正常造血干细胞的作用尚未引起重视，而这种作用会影响该类药物在临床应用效果的发挥及应用范围。本研究证实MS-209能够部分阻滞CD34阳性细胞上P-gp的功能，从而导致细胞对Rh123泵出功能的减低，提示MS-209在化疗中应用时可能会增加造血干细胞对化疗药物的摄取，从而导致化疗药物临床毒性的增加。因此，临床使用多药耐药逆转药物来逆转肿瘤的多药耐药性时，应充分考虑到对正常造血干细胞的毒副作用。如何研制具有选择性作用于肿瘤细胞的多药耐药逆转剂是今后的重要课题。
, http://www.100md.com
*邮政编码：武汉，430022
作者单位：竹下明裕 高阪勉 大西一功 大野
三 日本滨松医科大学第三内科参考文献
[1] Musto P,Melillo L,Lombardi G,et al.High risk of early resistant relapse for leukemia patients with presence of multidrug resistance associated P-glycoprotein positive cells in complete remission.Br J Haematotol,1991,77:50～53
[2] 冢本文英，芝英一.多剂耐性克服剂MS-209の效果.医学のあゆみ，1998，184(5)：305～307
, http://www.100md.com
[3] Tekeshita A,Shinjo K,Kozaka M,et al.New flow cytometer method for dectection of minimally expressed multidrug resistance P-glycoprotein on normal and acute leukemia cells using biotinylated MRK 16 and Streptavidin-RED 670 conjugate.Jan Cancer Res,1995,86:607～615
[4] Tsuruo T,lida H,Tsukagoshi S,et al.Overcoming of vincristine resistance in P388 leukemia in vivo and vitro through enhanced cytotoxicity of vincristine and vinblastine by verapamil.Cancer Res,1981,41:1967～1975
[5] Yano S,Sone S,Nishioka Y,et al.Cyclosporin A enhances susceptibility of multidrug resistance human cancer cells to anti-P-glycoprotein antibody-dependent cytotoxicity of monocytes,but not of lymphocytes.Jap J Cancer Res,1994,85(2):194～197
1999-05-24 收稿, 百拇医药