非低温保存的自体外周血干细胞移植治疗白血病和恶性肿瘤临床研究
作者：徐薇 吴文淼 欧阳桂芳 汤晓娴 谢浩芬 冯鸣 顾雪薇 倪丽芬
单位：宁波市第一医院血液科*
关键词：非低温保存；外周血干细胞移植/自体；白血病；肿瘤，恶性
临床血液学杂志990513 继自体骨髓移植(ABMT)之后，自体外周血干细胞移植(APBSCT)作为治疗恶性血液病和某些实体瘤的又一有效方法。近年来在国内外进展很快，已成为血液学领域的热门课题之一。我院自1996年11月以来应用APBSCT治疗10例恶性肿瘤患者，报道如下。
1 病例和方法
1.1 病例选择 10例均系住院患者，经临床、血象、骨髓象、淋巴结活检病理，纤支镜活检病理及其他有关检查确诊。其中急性淋巴细胞性白血病(ALL)3例，均为L3；急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)中M2a2例，M31例，M51例；非霍奇金淋巴瘤2例、ⅢB中高度恶性、B细胞性；晚期小细胞肺癌(SCLC)1例。男3例，女7例，中位年龄31(17～49)岁。急性白血病除M3采用全反式维甲酸+小剂量高三尖酯碱诱导缓解外，余均用联合化疗后获完全缓解(CR)。CR后包括HD-Ara-C和ME(米托蒽醌+VP16)方案巩固强化4～5个疗程，ALL还采用大剂量甲氨喋磷和大剂量联合化疗交替进行巩固治疗作为体内净化。移植时急性白血病均处于CR1。CR至APBSCT中位时间208 d(196～289 d)；NHL用CHOP方案诱导巩固治疗6个疗程；晚期肺癌用插管化疗后骨髓抑制合并败血症经对症支持控制感染获部分缓解后行APBSCT。
, 百拇医药
1.2 外周血干细胞(PBSC)动员、采集、保存和回输 ①PBSC动员：所有病例采用联合化疗加G-CSF(惠尔血)进行动员。化疗方案：ANLL用原敏感方案(DA或HD-Ara-C)方案；ALL用MEVP(米托蒽醌(Mit) 20 mg/m2+VP16 600 mg/m2、VCR 2 mg,强的松40 mg/m2方案，NHL用CHOP方案；小细胞肺癌用VECD方案。当白细胞降低到最低值开始稳定回升时，使用G-CSF(Kirin公司产品)300 μg/d，皮下注射，一般应用5～7 d。②PBSC的采集，保存及回输：患者接受细胞因子应用，当白细胞上升到>3.0×109/L时进行PBSC采集，用CS-3000 PLus血细胞分离机分离干细胞，选择程序1；全血流速50～55 ml/min，每次分离12 000～15 000 ml，1次/d，连续分离2次。收集的PBSC悬液直接放于4℃冰箱，并预留一段作单个核细胞MNC及CD+34测定，在预处理结束后72 h内，无需解冻直接回输。
, 百拇医药
1.3 预处理方案 ANLL与NHL均用MAC方案预处理(马法兰140～160 mg/m2，Ara-C3 g/m2、CTX×120 mg/kg)；ALL用AEC(Ara-C3 g/m2、VP16 1g/m2、CTX 120 mg/kg方案，小细胞肺癌用VECD〔VP160.8/m2、EPIA(表阿霉素)100 mg/m2、CTX 120 mg/kg、卡铂1 g/d×1 d〕方案。
1.4 支持治疗及并发症的预防 预处理前1周至造血重建为止，口服肠道不吸收抗生素，并彻底清除体内潜在可能感染灶，尤其是龋齿的处理。在第2次外周血干细胞分离结束的当天下午，经药浴后入无菌层流病房。预处理期间用枢复宁预防消化道反应，给予肠外营养。用美斯钠及水化碱化尿液、强迫利尿等措施，预防环磷酰胺所致的出血性膀胱炎。严格反向隔离及无菌操作，予无菌食物，常规口腔及肛周护理。当中性粒细胞<0.5×109/L时应用氟康唑预防霉菌感染，用无环鸟苷预防病毒感染。输照射后浓缩红细胞及机采血小板，使血色素维持在80 g/L，血小板维持在>20×109/L。当出现感染时首选强有力的抗生素如复达欣或泰能联合丁胺卡那霉素。在+8 d后，如外周血片中未见中性粒细胞出现时加用G-CSF 5～10 μg/kg。
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1.5 移植后的治疗 7例AL 3例用白介素-Ⅱ10万U/d×3～6个月，3例于移植后半年用小剂量化疗，ALL用6-MP.MTX及VP16片剂交替维持治疗，1例ALL在首次APBSCT后8个月又作APBSCT 1次。NHL在APBSCT后半年用CHOP方案化疗1次。
2 结果
2.1 APBSC的采集、回输的MNC及CD+阳性细胞的比较 (见附表)
附表 APBSC的采集、回输MNC、CD+34与造血功能恢复 病
例
号
采集时
WBC
, http://www.100md.com
(×109/L)
MNC
(×108/L)
CD+34
(×106/L)
保存
时间
(h)
造血恢复
WBC(d)
(>0.5×109/L)
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1
9.6
4.9
未测
68
11
2
5.5
3.8
2.1
64
13
3
4.6
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4.2
3.9
67
10
4
11.2
3.1
1.9
65
12
5
7.5
2.8
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68
8
6
5.6
3.9
3.7
66
15
7
4.4
5.1
4.0
67
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13
8
5.5
3.6
2.9
65
9
9
6.2
1.9
3.5
69
11
10
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8.2
5.4
8.4
62
8
2.2 造血功能恢复情况 10例患者于移植后外周血白细胞均降至0，血小板最低为(0.5～1)×109/L，造血功能恢复时间见附表，白细胞降到零的时间平均4(2～7) d，中性粒细胞>0.5×109/L为11 d，骨髓开始增生的时间为2～3周，增生活跃的时间4～6周，2例在骨髓恢复过程中发现原+早幼粒细胞比例增高(12%～19%)，经随访未发现白血病复发。
2.3 预处理后的不良反应及合并症 所有患者均有严重的消化道反应，恶心、呕吐(100%)；腹泻(60%)；谷丙转氨酶升高7例(70%)；口腔粘膜溃疡3例(30%)；肛周感染、败血症、出血性膀胱炎各1例，未出现间质性肺炎及肝静脉闭塞病，无移植相关死亡发生。
, 百拇医药
2.4 疗效与随访 10例中7例呈CCR，中位CCR时间258(52～669)d。复发2例，其中1例M2a于移植后194 d复发，经用小剂量联合化疗获第2次CR已132 d，仍在随访中。1例ALL于移植后52 d复发，用联合化疗获第2次CR，但CR期只42 d又复发，目前尚在治疗中。1例晚期肺癌于移植后176 d出现中枢神经转移而死亡。未复发7例中，3例恢复工作，1例考上中专，随访23个月，多次检查血常规和CT均正常。
3 讨论
3.1 APBSCT的优点 APBSCT不受供者来源的限制，它与ABMT相比尚具如下优点：患者不需要全麻或硬膜外麻醉，可免于采髓引起的不适；为以往骨髓接受过化疗或骨髓已受肿瘤细胞浸润的恶性实体瘤患者开辟了一个干细胞来源；受肿瘤细胞污染机会少，可减少移植后复发的可能性；移植后造血及免疫功能恢复快，可减少感染和出血并发症，从而减低移植相关死亡率。从我们10例APBSCT看，中性粒细胞恢复至0.5×109/L，中位时间11(9～15)d和不输血小板，维持血小板计数>20×109/L，中位时间10(8～26)d，比文献报道〔1〕中位时间21(10～57)d和32.5(11～388)d为短。由于重建造血快，移植期间未发生严重感染和出血，抗生素及机采血小板应用次数减少，从而降低了移植费用。
, http://www.100md.com
3.2 PBSC的动员采集与保存 在正常情况下，PBSC只有骨髓含量的1%～10%，要收集到足够的造血干细胞保证移植成功比较困难。早在1976年已发现在化疗骨髓抑制后的恢复早期PBSC升高〔2〕。在动员情况下，PBSC可增高数10倍甚至数百倍。目前对AL多主张采用HD-Ara-C或HD-CTX加G-CSF或GM-CSF进行动员〔3〕。而对于ALL或NHL多采用包括CTX和VP16在内的联合化疗方案加G-CSF或GM-CSF进行动员。一般当外周血的细胞上升至1.0×109/L，外周血CD+34阳性细胞>1%时采集，分离得到的PBSC用10%DMSO保存，经二步法降温后，置于-196℃液氮中贮存，当临床需要时，将冻存的PBSC置于40℃恒温水浴箱中快速解冻，并尽快回输。然而二步法降温需超低温保存设备与技术，且冻存过程中造血干细胞有一定的损害。据文献报道，骨髓4℃贮存可使造血干细胞活性保持7 d，贮存3 d可使80%～100%造血干细胞保持活性〔4〕。我们采用非低温4℃保存，简化了移植过程，既减少了冻存过程对干细胞的损害，又避免了PBSC在体外污染的机会，有利于造血功能重建，减少并发症，从而进一步降低了移植费用。
, http://www.100md.com
3.3 大容量连续采集PBSC能否满足非低温保存APBSCT重建造血的细胞数 对于外周血干细胞移植所需的造血干细胞数量各家文献报道不一〔5〕。一般主张输入MNC在(4～6)×108/kg较合适，CD+34阳性细胞数(2.5～5)×106/kg。获得重建造血的干细胞，一般经4～5次的分离才能达到，因为我们采用的非低温保存方法。为保持造血干细胞的活性，又保证预处理方案的顺利实施，分离的次数明显受到时间限制。我们采用联合化疗+G-CSF作为动员剂外，采用1～2次大容量连续分离法，均采集到足够的造血细胞，回输的MNC总数平均为3.8×108/kg，全部病人均获造血重建。本结果表明，利用4℃贮存72 h作APSCT具有许多优点，不但不需昂贵的冷藏设备，而且简便可行，安全、经济、有效，值得基层医院开展。
*邮政编码：宁波，315010
, 百拇医药 汤晓娴 宁波市中心血站(315040)
参考文献
[1] 郑华金，苏毅，袁良平，等.自体外周血干细胞移植的治疗恶性血液病的临床研究.中华血液学杂志，1998，19：309～311
[2] Lowry PA,Tabbara IA.Peripheral hematopoietic Stem call Transplantation;Current concepts.EXP Hematol,1992,20:937～940
[3] David C,Linch.G-CSF after peripheral blood stem cell tansplantation in Lymphoma pationts significantly accelerated neutrophil recovery and Shortened time in hospital.British Haematel,1997,99:933～938
[4] Koppler H.Haemopoietic.recorvery after high-dose chemritry and no slow freezing autolegous marrow transplat.Ann Hematol,1991,63(5):253～256
[5] Craig JIO.Peripheral blood stem cell.Mobilisation and engraftement.BMT,1994,14(Suppl 2):10～11
1998-12-10 收稿, 百拇医药
单位：宁波市第一医院血液科*
关键词：非低温保存；外周血干细胞移植/自体；白血病；肿瘤，恶性
临床血液学杂志990513 继自体骨髓移植(ABMT)之后，自体外周血干细胞移植(APBSCT)作为治疗恶性血液病和某些实体瘤的又一有效方法。近年来在国内外进展很快，已成为血液学领域的热门课题之一。我院自1996年11月以来应用APBSCT治疗10例恶性肿瘤患者，报道如下。
1 病例和方法
1.1 病例选择 10例均系住院患者，经临床、血象、骨髓象、淋巴结活检病理，纤支镜活检病理及其他有关检查确诊。其中急性淋巴细胞性白血病(ALL)3例，均为L3；急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)中M2a2例，M31例，M51例；非霍奇金淋巴瘤2例、ⅢB中高度恶性、B细胞性；晚期小细胞肺癌(SCLC)1例。男3例，女7例，中位年龄31(17～49)岁。急性白血病除M3采用全反式维甲酸+小剂量高三尖酯碱诱导缓解外，余均用联合化疗后获完全缓解(CR)。CR后包括HD-Ara-C和ME(米托蒽醌+VP16)方案巩固强化4～5个疗程，ALL还采用大剂量甲氨喋磷和大剂量联合化疗交替进行巩固治疗作为体内净化。移植时急性白血病均处于CR1。CR至APBSCT中位时间208 d(196～289 d)；NHL用CHOP方案诱导巩固治疗6个疗程；晚期肺癌用插管化疗后骨髓抑制合并败血症经对症支持控制感染获部分缓解后行APBSCT。
, 百拇医药
1.2 外周血干细胞(PBSC)动员、采集、保存和回输 ①PBSC动员：所有病例采用联合化疗加G-CSF(惠尔血)进行动员。化疗方案：ANLL用原敏感方案(DA或HD-Ara-C)方案；ALL用MEVP(米托蒽醌(Mit) 20 mg/m2+VP16 600 mg/m2、VCR 2 mg,强的松40 mg/m2方案，NHL用CHOP方案；小细胞肺癌用VECD方案。当白细胞降低到最低值开始稳定回升时，使用G-CSF(Kirin公司产品)300 μg/d，皮下注射，一般应用5～7 d。②PBSC的采集，保存及回输：患者接受细胞因子应用，当白细胞上升到>3.0×109/L时进行PBSC采集，用CS-3000 PLus血细胞分离机分离干细胞，选择程序1；全血流速50～55 ml/min，每次分离12 000～15 000 ml，1次/d，连续分离2次。收集的PBSC悬液直接放于4℃冰箱，并预留一段作单个核细胞MNC及CD+34测定，在预处理结束后72 h内，无需解冻直接回输。
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1.3 预处理方案 ANLL与NHL均用MAC方案预处理(马法兰140～160 mg/m2，Ara-C3 g/m2、CTX×120 mg/kg)；ALL用AEC(Ara-C3 g/m2、VP16 1g/m2、CTX 120 mg/kg方案，小细胞肺癌用VECD〔VP160.8/m2、EPIA(表阿霉素)100 mg/m2、CTX 120 mg/kg、卡铂1 g/d×1 d〕方案。
1.4 支持治疗及并发症的预防 预处理前1周至造血重建为止，口服肠道不吸收抗生素，并彻底清除体内潜在可能感染灶，尤其是龋齿的处理。在第2次外周血干细胞分离结束的当天下午，经药浴后入无菌层流病房。预处理期间用枢复宁预防消化道反应，给予肠外营养。用美斯钠及水化碱化尿液、强迫利尿等措施，预防环磷酰胺所致的出血性膀胱炎。严格反向隔离及无菌操作，予无菌食物，常规口腔及肛周护理。当中性粒细胞<0.5×109/L时应用氟康唑预防霉菌感染，用无环鸟苷预防病毒感染。输照射后浓缩红细胞及机采血小板，使血色素维持在80 g/L，血小板维持在>20×109/L。当出现感染时首选强有力的抗生素如复达欣或泰能联合丁胺卡那霉素。在+8 d后，如外周血片中未见中性粒细胞出现时加用G-CSF 5～10 μg/kg。
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1.5 移植后的治疗 7例AL 3例用白介素-Ⅱ10万U/d×3～6个月，3例于移植后半年用小剂量化疗，ALL用6-MP.MTX及VP16片剂交替维持治疗，1例ALL在首次APBSCT后8个月又作APBSCT 1次。NHL在APBSCT后半年用CHOP方案化疗1次。
2 结果
2.1 APBSC的采集、回输的MNC及CD+阳性细胞的比较 (见附表)
附表 APBSC的采集、回输MNC、CD+34与造血功能恢复 病
例
号
采集时
WBC
, http://www.100md.com
(×109/L)
MNC
(×108/L)
CD+34
(×106/L)
保存
时间
(h)
造血恢复
WBC(d)
(>0.5×109/L)
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1
9.6
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2.2 造血功能恢复情况 10例患者于移植后外周血白细胞均降至0，血小板最低为(0.5～1)×109/L，造血功能恢复时间见附表，白细胞降到零的时间平均4(2～7) d，中性粒细胞>0.5×109/L为11 d，骨髓开始增生的时间为2～3周，增生活跃的时间4～6周，2例在骨髓恢复过程中发现原+早幼粒细胞比例增高(12%～19%)，经随访未发现白血病复发。
2.3 预处理后的不良反应及合并症 所有患者均有严重的消化道反应，恶心、呕吐(100%)；腹泻(60%)；谷丙转氨酶升高7例(70%)；口腔粘膜溃疡3例(30%)；肛周感染、败血症、出血性膀胱炎各1例，未出现间质性肺炎及肝静脉闭塞病，无移植相关死亡发生。
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2.4 疗效与随访 10例中7例呈CCR，中位CCR时间258(52～669)d。复发2例，其中1例M2a于移植后194 d复发，经用小剂量联合化疗获第2次CR已132 d，仍在随访中。1例ALL于移植后52 d复发，用联合化疗获第2次CR，但CR期只42 d又复发，目前尚在治疗中。1例晚期肺癌于移植后176 d出现中枢神经转移而死亡。未复发7例中，3例恢复工作，1例考上中专，随访23个月，多次检查血常规和CT均正常。
3 讨论
3.1 APBSCT的优点 APBSCT不受供者来源的限制，它与ABMT相比尚具如下优点：患者不需要全麻或硬膜外麻醉，可免于采髓引起的不适；为以往骨髓接受过化疗或骨髓已受肿瘤细胞浸润的恶性实体瘤患者开辟了一个干细胞来源；受肿瘤细胞污染机会少，可减少移植后复发的可能性；移植后造血及免疫功能恢复快，可减少感染和出血并发症，从而减低移植相关死亡率。从我们10例APBSCT看，中性粒细胞恢复至0.5×109/L，中位时间11(9～15)d和不输血小板，维持血小板计数>20×109/L，中位时间10(8～26)d，比文献报道〔1〕中位时间21(10～57)d和32.5(11～388)d为短。由于重建造血快，移植期间未发生严重感染和出血，抗生素及机采血小板应用次数减少，从而降低了移植费用。
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3.2 PBSC的动员采集与保存 在正常情况下，PBSC只有骨髓含量的1%～10%，要收集到足够的造血干细胞保证移植成功比较困难。早在1976年已发现在化疗骨髓抑制后的恢复早期PBSC升高〔2〕。在动员情况下，PBSC可增高数10倍甚至数百倍。目前对AL多主张采用HD-Ara-C或HD-CTX加G-CSF或GM-CSF进行动员〔3〕。而对于ALL或NHL多采用包括CTX和VP16在内的联合化疗方案加G-CSF或GM-CSF进行动员。一般当外周血的细胞上升至1.0×109/L，外周血CD+34阳性细胞>1%时采集，分离得到的PBSC用10%DMSO保存，经二步法降温后，置于-196℃液氮中贮存，当临床需要时，将冻存的PBSC置于40℃恒温水浴箱中快速解冻，并尽快回输。然而二步法降温需超低温保存设备与技术，且冻存过程中造血干细胞有一定的损害。据文献报道，骨髓4℃贮存可使造血干细胞活性保持7 d，贮存3 d可使80%～100%造血干细胞保持活性〔4〕。我们采用非低温4℃保存，简化了移植过程，既减少了冻存过程对干细胞的损害，又避免了PBSC在体外污染的机会，有利于造血功能重建，减少并发症，从而进一步降低了移植费用。
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3.3 大容量连续采集PBSC能否满足非低温保存APBSCT重建造血的细胞数 对于外周血干细胞移植所需的造血干细胞数量各家文献报道不一〔5〕。一般主张输入MNC在(4～6)×108/kg较合适，CD+34阳性细胞数(2.5～5)×106/kg。获得重建造血的干细胞，一般经4～5次的分离才能达到，因为我们采用的非低温保存方法。为保持造血干细胞的活性，又保证预处理方案的顺利实施，分离的次数明显受到时间限制。我们采用联合化疗+G-CSF作为动员剂外，采用1～2次大容量连续分离法，均采集到足够的造血细胞，回输的MNC总数平均为3.8×108/kg，全部病人均获造血重建。本结果表明，利用4℃贮存72 h作APSCT具有许多优点，不但不需昂贵的冷藏设备，而且简便可行，安全、经济、有效，值得基层医院开展。
*邮政编码：宁波，315010
, 百拇医药 汤晓娴 宁波市中心血站(315040)
参考文献
[1] 郑华金，苏毅，袁良平，等.自体外周血干细胞移植的治疗恶性血液病的临床研究.中华血液学杂志，1998，19：309～311
[2] Lowry PA,Tabbara IA.Peripheral hematopoietic Stem call Transplantation;Current concepts.EXP Hematol,1992,20:937～940
[3] David C,Linch.G-CSF after peripheral blood stem cell tansplantation in Lymphoma pationts significantly accelerated neutrophil recovery and Shortened time in hospital.British Haematel,1997,99:933～938
[4] Koppler H.Haemopoietic.recorvery after high-dose chemritry and no slow freezing autolegous marrow transplat.Ann Hematol,1991,63(5):253～256
[5] Craig JIO.Peripheral blood stem cell.Mobilisation and engraftement.BMT,1994,14(Suppl 2):10～11
1998-12-10 收稿, 百拇医药