地中海贫血高危妊娠胎儿产前绒毛、羊水中巨细胞病毒DNA的检测
作者：周小玲 林伟雄 龙桂芳 李 琪
单位：周小玲 广西医科大学病理生理学教研室 南宁 530021; 林伟雄 龙桂芳 第一附属医院儿科血红蛋白室; 李琪 第一附属医院妇产科
关键词：PCR；地中海贫血；HCMV-DNA；绒毛；羊水
广西医科大学学报990526
摘要 目的：了解地中海贫血高危妊娠胎儿宫内人巨细胞病毒(HCMV)感染状况。方法：应用聚合酶链反应技术(PCR)对47例地中海贫血高危妊娠胎儿产前绒毛组织、羊水细胞DNA进行回顾性人巨细胞病毒DNA(HCMV-DNA)检测。结果：产前绒毛组织29例，检出HCMV-DNA 2例，阳性率为6.9%；羊水细胞18例,检出HCMV-DNA1例,阳性率为5.6%。结论：地中海贫血高危妊娠胎儿与本地区的正常人群一样，产前绒毛、羊水中HCMV感染率较低。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R714.55
DETECTION OF HUMAN CYTOMEGALOVIRUS-DNA IN THE PRENATAL CHORIONIC VILLI AND AMNIONIC FLUID OF THE FETUSES WITH THE RISK OF THALASSEMIA MAJOR DURING GESTATION
Zhou Xiaoling,Lin Weixiong,Long Guifang, et al.
(Dep.of Pathophysiology, Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:To investigate HCMV infection states of the fetuses with the risk of thalassemia major during gestation.Methods:Polymerase chain reaction (PCR)was used to detect Human Cytomegalovirus-DNA (HCMV-DNA) in 29 chorionic villi samples and 18 amnionic fliud samples with the risk of thalassemia major.Results:2 of the 29 chorionic villi samples and 1 of 18 amnionic fluid samples were positive in HCMV-DNA. Positive rates were 6.9% and 5.6%.Conclusion:HCMV infection rate in the fetuses with the risk of thalassemia major during pregnancy was the same as the normal natives.
, 百拇医药
Key words PCR；thalassemia；HCMV-DNA；chorion；amnionic fluid
人巨细胞病毒(HCMV)属疱疹病毒属，人类普遍对巨细胞病毒易感，而在不同地区、不同人群感染状况不尽相同，孕妇感染HCMV是导致死胎、流产或胎儿宫内发育迟缓以及听力损害、智力发育障碍等新生儿疾病的重要致病因素之一[1～3]。我们对47例已经完成了地中海贫血产前基因诊断的绒毛组织、羊水细胞DNA进行回顾性HCMV-DNA检测，借此掌握地中海贫血高危妊娠胎儿宫内HCMV感染状况，指导地中海贫血高危胎儿的产前基因诊断优生工作。
1 材料与方法
1.1 对象：47例孕妇均有地贫胎儿孕产史，要求做产前基因诊断者。其中23例生育过重型β-地贫胎儿，19例有Bart's水肿胎儿妊娠史，5例生育过HbH病胎儿。
, http://www.100md.com
2.2 取材：妊娠54～68 d取胚胎绒毛组织或16～22周经腹壁行羊膜腔穿刺抽取羊水。
3.3 标本处理：绒毛组织用生理盐水洗涤后在显微镜下充分分离母体蜕膜组织;羊水离心后留取沉淀细胞,遇上有母血污染的羊水细胞用悬浮法[4]进行分离。绒毛或羊水细胞加入15 mmol/L TES、蛋白酶K及SDS于55℃消化10～20 min，饱和酚及氯仿抽提2次，无水乙醇沉淀获纤维状DNA，用体积分数为75%乙醇洗绦，室温风干，无菌双蒸水溶解备用。
1.4 PCR检测HCMV-DNA：引物设计参照文献[5]，引物序列选用能扩增HCMV-DNA中的编码即早期抗原一部分的保守序列，片段长435bp，引物由中科院微生物所合成，序列如下：
P1 5'CCA AGC GGC CTC TAT AAC CAA GCC 3'
, http://www.100md.com
P2 5'CAG CAC CAT CCT CCT CTT CCT CTG G 3'
PCR反应总体积25 μl,含10×PCR缓冲液2.5 μl,5 mmol/L dNTP 2 μl,二甲基亚枫(DMSO)1 μl，体积分数为1%小牛血清白蛋白(BSA)1 μl，引物P\-\{1\}P\-\{2\}各0.5 μl(500 pmol/L),待检DNA约0.1 μg,双蒸水17 μl,TaqE 1.5IU(华美公司产品)。热循环条件是：95℃10 min，加TaqE，94℃60 s～55℃60 s～72℃90 s，30个循环。PCR产物在质量浓度为2%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察结果。
2 结 果
47例地贫高危胎儿产前绒毛、羊水细胞DNA检测HCMV-DNA的PCR扩增结果见表1。
表1 绒毛和羊水HCMV-DNA PCR检测结果 标本
, 百拇医药
n
阳性例数
阳性率(%)
绒毛
29
2
6.9
羊水
18
1
5.6
3 讨 论
巨细胞病毒是宫内感染中最常见、危害最大的病毒之一，它可以引起胚胎发育异常，造成流产、早产、胎儿发育迟缓，出生缺陷、幼儿智力障碍及听力损害等。地中海贫血是广西地区最常见的遗传性溶血性疾病，本组所检测的47例绒毛、羊水DNA病例，均有过重型β-地中海贫血、Bart's水肿胎儿、HbH病的生育史，出于避免再次生育地贫胎儿的要求而就诊，没有进行过HCMV的检测。本组地贫高危妊娠胎儿产前绒毛和羊水细胞DNA中HCMV-DNA检出率较低，与本地区覃靖[2]报道的相接近。对于HCMV感染对胎儿的影响虽有许多报道，但仍因缺乏足够的直接资料支持，因而没能广泛地在产前优生工作中将HCMV的检测推广，作者认为有必要对已经排除地贫，但测出HCMV-DNA阳性的产前诊断病例进行追踪监测。对于孕妇HCMV的感染率，各地区绒毛、羊水细胞的HCMV检测结果相差较为悬殊[5,6]，反映了HCMV感染的各地区水平，也可能与所选择的检测方法有关。但是大多数的报道认为，绒毛细胞DNA的HCMV-DNA检出率高于羊水细胞，这可能与胎盘的屏障保护以及胎儿逐渐发育的免疫自我保护作用有关，至于HCMV感染对本组的地中海贫血产前诊断胎儿的影响，由于是回顾性检测，所以没有随访资料。
, http://www.100md.com
参考文献
1 邵振堂，易广才，郑广英.链置换式扩增检测羊水中巨细胞 病毒DNA.中国优生与遗传杂志，1998,6(3):23
2 覃靖，陈荔丽，张海燕，等.应用聚合酶链反应技术产前诊断人巨细胞病毒及其追踪监测结果.广西医学，1997,19(5):738
3 徐平，汤春园.用聚合酶反应诊断新生儿人巨细胞病毒感染25例分析.中国优生与遗传杂志，1996,4(6):21
4 李卫，林伟雄，龙桂芳，等.一种从母血污染的羊水中分离胎儿脱落细胞的简易方法.广西医科大学学报，1995,12(3):462
5 李钰，张贵寅，李敏，等.采用PCR技术对绒毛和羊水巨细胞病毒感染研究的比较分析.中国优生与遗传杂志,1997,5(4):19
6 王福祥，赵景波，应长青，等.孕妇人巨细胞病毒感染危险因素的研究.哈尔滨医科大学学报，1997,31(3):207
收稿日期：1999-01-05, http://www.100md.com
单位：周小玲 广西医科大学病理生理学教研室 南宁 530021; 林伟雄 龙桂芳 第一附属医院儿科血红蛋白室; 李琪 第一附属医院妇产科
关键词：PCR；地中海贫血；HCMV-DNA；绒毛；羊水
广西医科大学学报990526
摘要 目的：了解地中海贫血高危妊娠胎儿宫内人巨细胞病毒(HCMV)感染状况。方法：应用聚合酶链反应技术(PCR)对47例地中海贫血高危妊娠胎儿产前绒毛组织、羊水细胞DNA进行回顾性人巨细胞病毒DNA(HCMV-DNA)检测。结果：产前绒毛组织29例，检出HCMV-DNA 2例，阳性率为6.9%；羊水细胞18例,检出HCMV-DNA1例,阳性率为5.6%。结论：地中海贫血高危妊娠胎儿与本地区的正常人群一样，产前绒毛、羊水中HCMV感染率较低。
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中国图书资料分类法分类号 R714.55
DETECTION OF HUMAN CYTOMEGALOVIRUS-DNA IN THE PRENATAL CHORIONIC VILLI AND AMNIONIC FLUID OF THE FETUSES WITH THE RISK OF THALASSEMIA MAJOR DURING GESTATION
Zhou Xiaoling,Lin Weixiong,Long Guifang, et al.
(Dep.of Pathophysiology, Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:To investigate HCMV infection states of the fetuses with the risk of thalassemia major during gestation.Methods:Polymerase chain reaction (PCR)was used to detect Human Cytomegalovirus-DNA (HCMV-DNA) in 29 chorionic villi samples and 18 amnionic fliud samples with the risk of thalassemia major.Results:2 of the 29 chorionic villi samples and 1 of 18 amnionic fluid samples were positive in HCMV-DNA. Positive rates were 6.9% and 5.6%.Conclusion:HCMV infection rate in the fetuses with the risk of thalassemia major during pregnancy was the same as the normal natives.
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Key words PCR；thalassemia；HCMV-DNA；chorion；amnionic fluid
人巨细胞病毒(HCMV)属疱疹病毒属，人类普遍对巨细胞病毒易感，而在不同地区、不同人群感染状况不尽相同，孕妇感染HCMV是导致死胎、流产或胎儿宫内发育迟缓以及听力损害、智力发育障碍等新生儿疾病的重要致病因素之一[1～3]。我们对47例已经完成了地中海贫血产前基因诊断的绒毛组织、羊水细胞DNA进行回顾性HCMV-DNA检测，借此掌握地中海贫血高危妊娠胎儿宫内HCMV感染状况，指导地中海贫血高危胎儿的产前基因诊断优生工作。
1 材料与方法
1.1 对象：47例孕妇均有地贫胎儿孕产史，要求做产前基因诊断者。其中23例生育过重型β-地贫胎儿，19例有Bart's水肿胎儿妊娠史，5例生育过HbH病胎儿。
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2.2 取材：妊娠54～68 d取胚胎绒毛组织或16～22周经腹壁行羊膜腔穿刺抽取羊水。
3.3 标本处理：绒毛组织用生理盐水洗涤后在显微镜下充分分离母体蜕膜组织;羊水离心后留取沉淀细胞,遇上有母血污染的羊水细胞用悬浮法[4]进行分离。绒毛或羊水细胞加入15 mmol/L TES、蛋白酶K及SDS于55℃消化10～20 min，饱和酚及氯仿抽提2次，无水乙醇沉淀获纤维状DNA，用体积分数为75%乙醇洗绦，室温风干，无菌双蒸水溶解备用。
1.4 PCR检测HCMV-DNA：引物设计参照文献[5]，引物序列选用能扩增HCMV-DNA中的编码即早期抗原一部分的保守序列，片段长435bp，引物由中科院微生物所合成，序列如下：
P1 5'CCA AGC GGC CTC TAT AAC CAA GCC 3'
, http://www.100md.com
P2 5'CAG CAC CAT CCT CCT CTT CCT CTG G 3'
PCR反应总体积25 μl,含10×PCR缓冲液2.5 μl,5 mmol/L dNTP 2 μl,二甲基亚枫(DMSO)1 μl，体积分数为1%小牛血清白蛋白(BSA)1 μl，引物P\-\{1\}P\-\{2\}各0.5 μl(500 pmol/L),待检DNA约0.1 μg,双蒸水17 μl,TaqE 1.5IU(华美公司产品)。热循环条件是：95℃10 min，加TaqE，94℃60 s～55℃60 s～72℃90 s，30个循环。PCR产物在质量浓度为2%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察结果。
2 结 果
47例地贫高危胎儿产前绒毛、羊水细胞DNA检测HCMV-DNA的PCR扩增结果见表1。
表1 绒毛和羊水HCMV-DNA PCR检测结果 标本
, 百拇医药
n
阳性例数
阳性率(%)
绒毛
29
2
6.9
羊水
18
1
5.6
3 讨 论
巨细胞病毒是宫内感染中最常见、危害最大的病毒之一，它可以引起胚胎发育异常，造成流产、早产、胎儿发育迟缓，出生缺陷、幼儿智力障碍及听力损害等。地中海贫血是广西地区最常见的遗传性溶血性疾病，本组所检测的47例绒毛、羊水DNA病例，均有过重型β-地中海贫血、Bart's水肿胎儿、HbH病的生育史，出于避免再次生育地贫胎儿的要求而就诊，没有进行过HCMV的检测。本组地贫高危妊娠胎儿产前绒毛和羊水细胞DNA中HCMV-DNA检出率较低，与本地区覃靖[2]报道的相接近。对于HCMV感染对胎儿的影响虽有许多报道，但仍因缺乏足够的直接资料支持，因而没能广泛地在产前优生工作中将HCMV的检测推广，作者认为有必要对已经排除地贫，但测出HCMV-DNA阳性的产前诊断病例进行追踪监测。对于孕妇HCMV的感染率，各地区绒毛、羊水细胞的HCMV检测结果相差较为悬殊[5,6]，反映了HCMV感染的各地区水平，也可能与所选择的检测方法有关。但是大多数的报道认为，绒毛细胞DNA的HCMV-DNA检出率高于羊水细胞，这可能与胎盘的屏障保护以及胎儿逐渐发育的免疫自我保护作用有关，至于HCMV感染对本组的地中海贫血产前诊断胎儿的影响，由于是回顾性检测，所以没有随访资料。
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参考文献
1 邵振堂，易广才，郑广英.链置换式扩增检测羊水中巨细胞 病毒DNA.中国优生与遗传杂志，1998,6(3):23
2 覃靖，陈荔丽，张海燕，等.应用聚合酶链反应技术产前诊断人巨细胞病毒及其追踪监测结果.广西医学，1997,19(5):738
3 徐平，汤春园.用聚合酶反应诊断新生儿人巨细胞病毒感染25例分析.中国优生与遗传杂志，1996,4(6):21
4 李卫，林伟雄，龙桂芳，等.一种从母血污染的羊水中分离胎儿脱落细胞的简易方法.广西医科大学学报，1995,12(3):462
5 李钰，张贵寅，李敏，等.采用PCR技术对绒毛和羊水巨细胞病毒感染研究的比较分析.中国优生与遗传杂志,1997,5(4):19
6 王福祥，赵景波，应长青，等.孕妇人巨细胞病毒感染危险因素的研究.哈尔滨医科大学学报，1997,31(3):207
收稿日期：1999-01-05, http://www.100md.com