鼻咽癌及鼻咽部粘膜中EB病毒DNA的检测
作者：李西融 姚春宝
单位：广西第二人民医院病理科 桂林 541002
关键词：鼻咽癌；EB病毒；基因
广西医科大学学报990524
摘要 目的：检测鼻咽部粘膜及鼻咽癌中的EBV DNA片段，作为癌前病变的确立和癌变风险的评估指标。方法：用PCR扩增EBV的Bam HI W片段。结果：鼻咽癌中阳性率为87.9%(102/116)，颈淋巴结转移灶66.6%(2/3)，鼻咽癌放疗后鼻咽慢性炎75.6%(28/37)，鼻咽粘膜不典型增生71.1%(15/21)，鼻咽粘膜慢性炎和正常鼻咽粘膜上皮分别为21%及20%。结论：EBV感染在鼻咽癌发生过程中起重要作用，并在转移中并不掉失。用PCR检测石蜡块中EBV DNA，可作为评估癌变和复发风险指标之一。
中国图书资料分类法分类号 R730.2
, 百拇医药
DETECTION OF EPSTEIN-BARR VIRUS IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMA AND NASOPHARYNGEAL MUCOSAS
Li Xirong,Yiao Chenbao
(Department of Pathology,the Second People's Hospital of Guangxi,Guilin 541002)
Abstract Objective:Detection of genomic DNA sequence of Epstein-Barr virus(EBV) in the nasopharyngeal carcinoma(NPC) and nasopharyngeal mucosas,it may serve as an auxiliary indicators for idenitfying the determination of precancar lesion and risk of canceration.Method:Polymerase chain reaction(PCR) was used to amplify the genomic DNA Bam HI W sequence of EBV.Results:Positive rate was 87.9%(102/116) in NPC and 66.6%(2/3) in neck metastatic lesions. 75.6%(28/37) in chronic nasopharyngitis from NPC patients houing received radiotherapy;71.1%(15/21) in nasopharyngeal epithelium dysplasia;21%(4/19) in chronic nasopharyngitis and 20%(3/15) in non-tumor nasopharyngeal epithelium.Conclusion:The results show that EBV infection may play an important role in the development and carcinogenesis process of NPC. In metastatic process EBV was not lost.
, http://www.100md.com
Key words nasopharyneal carcinoma;Epstein-Barr virus;Gene
Epstein-Barr Virus(EBV)是一种双螺旋DNA病毒，Lung[1]认为呼吸道是EBV的重要储存场所。但上皮细胞感染的机制仍不明确。我们对正常鼻咽部粘膜、粘膜慢性炎和不典型增生、鼻咽癌和转移灶、鼻咽癌放疗后的鼻咽粘膜慢性炎等几组活检标本中的EBV DNA用多聚酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)进行检测，对它们之间的相对关系进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 材料 取本院1978～1995年间随访病例共119例，其中鼻咽癌原发灶116例，颈淋巴结转移灶3例。年龄22～70岁，随访时间3～12年，其中病人已死亡58例，其余病人存活为14～128个月不等。另随机抽取1993～1995三年间的正常鼻咽癌粘膜标本15例、鼻咽部粘膜慢性炎19例、粘膜不典型增生21例、鼻咽癌放疗后的粘膜慢性炎37例。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 DNA提取：石蜡块取10 μm厚2～4片置入Eppendorf管中，脱蜡、消化抽取、沉淀DNA离心后TE缓冲液溶解DNA，该液用于PCR扩增，或-20℃贮存待用。
1.2.2 PCR扩增：引物对为非多形性EBV核抗原1(EBNA-1)。引物序列为E1：5’GTAGAAGGCCATTTTTCCAC3’和E2：5’CTCCATCGCAAAGCTGCA3’[2](中科院微生物所合成)。扩增产物为EBV基因组Bam HI W区内295 bp片段，扩增后经2.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯观察，记录照相。
2 结 果
按1978年WHO的组织学分类，116例NPC中鳞状细胞癌60例，非角化癌42例，未分化癌14例。
, 百拇医药
2.1 鼻咽癌组织中EBV DNA检测：结果见表1。表明EBV DNA不但在未分化癌和低分化的非角化癌，而且同样在高分化的鳞状细胞癌中亦有较高的感染率。
表1 NPC分组与EBV DNA检测 组织学类型
n
EBV
(-)
DNA
(+)
阳性率
(%)
鼻咽癌
116
, http://www.100md.com
14
102
87.936
鳞状细胞癌
60
10
50
83.3362
非角化癌
42
1
38
90.4733
, 百拇医药
未分化癌
14
0
14
1008
NPC颈淋巴结转移
3
1
2
66.66
2.2 其它几组鼻咽部粘膜标本中EBV DNA检测：见表2。表2 其它鼻咽部粘膜组织中EBV DNA检测 鼻咽部粘膜病理类型
n
, 百拇医药
EBV
(-)
DNA
(+)
%
正常鼻咽部粘膜
15
12
3
20
鼻咽部粘膜慢性炎
19
15
, 百拇医药
4
21.05
鼻咽部粘膜不典型增生
21
6
15
71.14
NPC放疗后的鼻咽慢性炎
37
9
28
75.67
3 讨 论
, http://www.100md.com
EBV是一类NDA致瘤病毒，它感染细胞有两种不同方式：产病毒感染和潜伏感染[3]。其流行病学发现它符合呼吸道传播模式，个体原发感染EBV后会周期性向唾液中释放病毒。从健康者口咽部[4]、腮腺[5]中均有检出EBV的报道。肺癌中亦有较高的感染率[6]。本组检测116例鼻咽癌，阳性率87.93%。Bam HI W序列不但含有EBNA-1的转录启动子序列Wp，而且还编码它的mRNA的部分拼接序列。它的表达间接反映了病毒DNA复制状态。检测结果表明在鼻咽癌组织中有很高的EBV感染率，尤其在分化差或未分化癌中EBNA-1的转录呈活动状态，证明EBV在鼻咽癌发生过程的某一阶段起重要作用而且影响肿瘤细胞的表型或分化程度[7]。
在3例鼻咽癌颈淋巴结转移灶标本中，有2例阳性，说明EBV在鼻咽癌转移过程中并不掉失。EBV可能以潜伏感染形式随癌细胞转移到颈部淋巴结中，跟随癌细胞分裂而在细胞持续下去[8]。
, http://www.100md.com
在正常鼻咽部粘膜和鼻咽粘膜慢性炎的石蜡标本中，阳性率分别为20%和21.05%，比国外文献[4]报告要低，是否说明在正常上皮和粘膜慢性炎的上皮细胞对EBV感染具有相对抑制作用，导致EBV的转录相对呈抑制状态。Becker Y[9]总结了一些上皮细胞对病毒感染的抑制功能，并证明了某些因素能破坏这一功能。
而在鼻咽部粘膜不典型增生和鼻咽癌放疗1～3年间所取的鼻咽粘膜慢性炎这两个标本组中，EBV DNA检出率又达71.14%和75.67%，表明在这两种类型的上皮中EBNA-1的转录或复制呈相对活跃状态，并不断释放病毒，导致上皮细胞裂解。提示着这类上皮细胞早期感染EBV，继而长时间的这一个过程上皮细胞从增生发展到不典型增生，最后发生恶变，继而肿瘤细胞克隆性增殖[7，10]，发生鼻咽癌或者导致鼻咽癌放疗后的再复发，从感染到上皮细胞畸变，两者有一定关系。因此，我们认为常规石蜡切片用PCR检测EBV DNA，可以作为癌前变的确立和癌变风险的评估，以及鼻咽癌放疗后复发风险预测的评估，列为一项指标进行检测。
, 百拇医药
参考文献
1 Lung ML,Lam WX, So Sy，et al. Evidence that respiratory tract is major reservoir for Epstein-Barr Virus. Lancet, 1985，(1):889
2 Feinmesser R,Miyazaki I, Cheung R,et al. Diagnosis of nasopharyngeal carcinoma by DNA amplification of tissue obtained by Fine-Needle aspiration. N Engl J Med, 1992;326(1):17.13
3 汪慧民,陈军,曾木圣,等.鼻咽癌中EB病毒基因组状态研究.癌症,1997;16(2):85
, 百拇医药 4 Van Rensburg EJ, Engelbrecht S, Van Heerden W，et al. Deteclion of EBV DNA in oral squamous gland cell carcinoma in a Black African population sample. In Vivo, 1995;9:199
5 Hamilton SJ,Therkilden MH,Neilsen NH,et al.Undifferentiated carcinoma of the salivary gland in Greenlandic Eskimos.Hum Pathol，1991;22:811
6 张雷,刘鸿瑞,王志永,等.EB病毒感染及感染拷贝数与肺癌的关系.中华病理学杂志,1995;24(3):132
7 韩安家;熊敏,宗永生.肺淋巴上皮瘤样癌与EB病毒的相关性.中华病理学杂志,1997;26(4):222
8 黄腾波,汪慧民,李景廉,等.鼻咽癌高危人群、癌前病变的确立.癌症,1997:16(2):18
9 Backer Y.Anticancer role of dendritic cells (DC) in human and experimental carcer——a review. Anticancer Res，1992;12:511
10 黄海,潘星华,孙喜元,等.EB病毒BHRF1基因表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响.中华耳鼻咽喉科杂志,1997;32(5):290
收稿日期：1998-07-28, 百拇医药
单位：广西第二人民医院病理科 桂林 541002
关键词：鼻咽癌；EB病毒；基因
广西医科大学学报990524
摘要 目的：检测鼻咽部粘膜及鼻咽癌中的EBV DNA片段，作为癌前病变的确立和癌变风险的评估指标。方法：用PCR扩增EBV的Bam HI W片段。结果：鼻咽癌中阳性率为87.9%(102/116)，颈淋巴结转移灶66.6%(2/3)，鼻咽癌放疗后鼻咽慢性炎75.6%(28/37)，鼻咽粘膜不典型增生71.1%(15/21)，鼻咽粘膜慢性炎和正常鼻咽粘膜上皮分别为21%及20%。结论：EBV感染在鼻咽癌发生过程中起重要作用，并在转移中并不掉失。用PCR检测石蜡块中EBV DNA，可作为评估癌变和复发风险指标之一。
中国图书资料分类法分类号 R730.2
, 百拇医药
DETECTION OF EPSTEIN-BARR VIRUS IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMA AND NASOPHARYNGEAL MUCOSAS
Li Xirong,Yiao Chenbao
(Department of Pathology,the Second People's Hospital of Guangxi,Guilin 541002)
Abstract Objective:Detection of genomic DNA sequence of Epstein-Barr virus(EBV) in the nasopharyngeal carcinoma(NPC) and nasopharyngeal mucosas,it may serve as an auxiliary indicators for idenitfying the determination of precancar lesion and risk of canceration.Method:Polymerase chain reaction(PCR) was used to amplify the genomic DNA Bam HI W sequence of EBV.Results:Positive rate was 87.9%(102/116) in NPC and 66.6%(2/3) in neck metastatic lesions. 75.6%(28/37) in chronic nasopharyngitis from NPC patients houing received radiotherapy;71.1%(15/21) in nasopharyngeal epithelium dysplasia;21%(4/19) in chronic nasopharyngitis and 20%(3/15) in non-tumor nasopharyngeal epithelium.Conclusion:The results show that EBV infection may play an important role in the development and carcinogenesis process of NPC. In metastatic process EBV was not lost.
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Key words nasopharyneal carcinoma;Epstein-Barr virus;Gene
Epstein-Barr Virus(EBV)是一种双螺旋DNA病毒，Lung[1]认为呼吸道是EBV的重要储存场所。但上皮细胞感染的机制仍不明确。我们对正常鼻咽部粘膜、粘膜慢性炎和不典型增生、鼻咽癌和转移灶、鼻咽癌放疗后的鼻咽粘膜慢性炎等几组活检标本中的EBV DNA用多聚酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)进行检测，对它们之间的相对关系进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 材料 取本院1978～1995年间随访病例共119例，其中鼻咽癌原发灶116例，颈淋巴结转移灶3例。年龄22～70岁，随访时间3～12年，其中病人已死亡58例，其余病人存活为14～128个月不等。另随机抽取1993～1995三年间的正常鼻咽癌粘膜标本15例、鼻咽部粘膜慢性炎19例、粘膜不典型增生21例、鼻咽癌放疗后的粘膜慢性炎37例。
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1.2 方法
1.2.1 DNA提取：石蜡块取10 μm厚2～4片置入Eppendorf管中，脱蜡、消化抽取、沉淀DNA离心后TE缓冲液溶解DNA，该液用于PCR扩增，或-20℃贮存待用。
1.2.2 PCR扩增：引物对为非多形性EBV核抗原1(EBNA-1)。引物序列为E1：5’GTAGAAGGCCATTTTTCCAC3’和E2：5’CTCCATCGCAAAGCTGCA3’[2](中科院微生物所合成)。扩增产物为EBV基因组Bam HI W区内295 bp片段，扩增后经2.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯观察，记录照相。
2 结 果
按1978年WHO的组织学分类，116例NPC中鳞状细胞癌60例，非角化癌42例，未分化癌14例。
, 百拇医药
2.1 鼻咽癌组织中EBV DNA检测：结果见表1。表明EBV DNA不但在未分化癌和低分化的非角化癌，而且同样在高分化的鳞状细胞癌中亦有较高的感染率。
表1 NPC分组与EBV DNA检测 组织学类型
n
EBV
(-)
DNA
(+)
阳性率
(%)
鼻咽癌
116
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14
102
87.936
鳞状细胞癌
60
10
50
83.3362
非角化癌
42
1
38
90.4733
, 百拇医药
未分化癌
14
0
14
1008
NPC颈淋巴结转移
3
1
2
66.66
2.2 其它几组鼻咽部粘膜标本中EBV DNA检测：见表2。表2 其它鼻咽部粘膜组织中EBV DNA检测 鼻咽部粘膜病理类型
n
, 百拇医药
EBV
(-)
DNA
(+)
%
正常鼻咽部粘膜
15
12
3
20
鼻咽部粘膜慢性炎
19
15
, 百拇医药
4
21.05
鼻咽部粘膜不典型增生
21
6
15
71.14
NPC放疗后的鼻咽慢性炎
37
9
28
75.67
3 讨 论
, http://www.100md.com
EBV是一类NDA致瘤病毒，它感染细胞有两种不同方式：产病毒感染和潜伏感染[3]。其流行病学发现它符合呼吸道传播模式，个体原发感染EBV后会周期性向唾液中释放病毒。从健康者口咽部[4]、腮腺[5]中均有检出EBV的报道。肺癌中亦有较高的感染率[6]。本组检测116例鼻咽癌，阳性率87.93%。Bam HI W序列不但含有EBNA-1的转录启动子序列Wp，而且还编码它的mRNA的部分拼接序列。它的表达间接反映了病毒DNA复制状态。检测结果表明在鼻咽癌组织中有很高的EBV感染率，尤其在分化差或未分化癌中EBNA-1的转录呈活动状态，证明EBV在鼻咽癌发生过程的某一阶段起重要作用而且影响肿瘤细胞的表型或分化程度[7]。
在3例鼻咽癌颈淋巴结转移灶标本中，有2例阳性，说明EBV在鼻咽癌转移过程中并不掉失。EBV可能以潜伏感染形式随癌细胞转移到颈部淋巴结中，跟随癌细胞分裂而在细胞持续下去[8]。
, http://www.100md.com
在正常鼻咽部粘膜和鼻咽粘膜慢性炎的石蜡标本中，阳性率分别为20%和21.05%，比国外文献[4]报告要低，是否说明在正常上皮和粘膜慢性炎的上皮细胞对EBV感染具有相对抑制作用，导致EBV的转录相对呈抑制状态。Becker Y[9]总结了一些上皮细胞对病毒感染的抑制功能，并证明了某些因素能破坏这一功能。
而在鼻咽部粘膜不典型增生和鼻咽癌放疗1～3年间所取的鼻咽粘膜慢性炎这两个标本组中，EBV DNA检出率又达71.14%和75.67%，表明在这两种类型的上皮中EBNA-1的转录或复制呈相对活跃状态，并不断释放病毒，导致上皮细胞裂解。提示着这类上皮细胞早期感染EBV，继而长时间的这一个过程上皮细胞从增生发展到不典型增生，最后发生恶变，继而肿瘤细胞克隆性增殖[7，10]，发生鼻咽癌或者导致鼻咽癌放疗后的再复发，从感染到上皮细胞畸变，两者有一定关系。因此，我们认为常规石蜡切片用PCR检测EBV DNA，可以作为癌前变的确立和癌变风险的评估，以及鼻咽癌放疗后复发风险预测的评估，列为一项指标进行检测。
, 百拇医药
参考文献
1 Lung ML,Lam WX, So Sy，et al. Evidence that respiratory tract is major reservoir for Epstein-Barr Virus. Lancet, 1985，(1):889
2 Feinmesser R,Miyazaki I, Cheung R,et al. Diagnosis of nasopharyngeal carcinoma by DNA amplification of tissue obtained by Fine-Needle aspiration. N Engl J Med, 1992;326(1):17.13
3 汪慧民,陈军,曾木圣,等.鼻咽癌中EB病毒基因组状态研究.癌症,1997;16(2):85
, 百拇医药 4 Van Rensburg EJ, Engelbrecht S, Van Heerden W，et al. Deteclion of EBV DNA in oral squamous gland cell carcinoma in a Black African population sample. In Vivo, 1995;9:199
5 Hamilton SJ,Therkilden MH,Neilsen NH,et al.Undifferentiated carcinoma of the salivary gland in Greenlandic Eskimos.Hum Pathol，1991;22:811
6 张雷,刘鸿瑞,王志永,等.EB病毒感染及感染拷贝数与肺癌的关系.中华病理学杂志,1995;24(3):132
7 韩安家;熊敏,宗永生.肺淋巴上皮瘤样癌与EB病毒的相关性.中华病理学杂志,1997;26(4):222
8 黄腾波,汪慧民,李景廉,等.鼻咽癌高危人群、癌前病变的确立.癌症,1997:16(2):18
9 Backer Y.Anticancer role of dendritic cells (DC) in human and experimental carcer——a review. Anticancer Res，1992;12:511
10 黄海,潘星华,孙喜元,等.EB病毒BHRF1基因表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响.中华耳鼻咽喉科杂志,1997;32(5):290
收稿日期：1998-07-28, 百拇医药