丙肝患者外周血T细胞亚群及mIL-2R的检测
作者：王健 李朝品 许礼发
单位：232001 淮南工业学院医学分院病原学与免疫学教研室
关键词：肝炎，病毒性，丙型；受体，抗原，T-细胞；白细胞介素类
蚌埠医学院学报990504摘要 目的：探讨丙型病毒性肝炎(丙肝)患者的细胞免疫水平及其在丙肝发病机理中的作用。方法：用生物素-链霉亲和素法对112例抗-HCV阳性患者外周血单个核细胞进行T细胞亚群及植物血凝素(PHA)诱导前后mIL-2R的检测。结果：急慢性丙肝患者与正常对照相比，外周血CD3+、CD4+百分率降低，CD8+百分率增高，CD4+/CD8+比值下降(P<0.05～P<0.01)。外周血单个核细胞在静息状态和在PHA诱导状态，其mIL-2R表达水平与正常对照组相比均低下(P<0.01)，但急慢性丙肝患者中T细胞亚群及mIL-2R表达水平类似(P>0.05)。结论：丙肝患者体内存在明显的细胞免疫功能紊乱，T细胞活化障碍，并与肝病的慢性化有关。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 512.63 R 392.11
T cells subsets and mIL-2R in peripheral blood of patients with hepatitis C
Wang Jian,Li Chaopin,Xu Lifa
(Department of Medical Etiology and Immunology,Medical College,Huainan Industrial Institute,Anhui 232001)
Abstract Objective:To study the cellular immunity level and its role in the pathogenesis of hepatitis C.Methods:T cells subsets and the level of membrance interleukin-2 receptor(mIL-2R) in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) were detected with biotin-streptavidin techinque before and after PHA induction in 112 cases of hepatitis C with positive anti-HCV.Results:In acute and chronic hepatitis C with positive anti-HCV the levels of CD3+、CD4+、CD4+/CD8+ were lower and CD8+ was higher than those in normal controls(P<0.01).The expression of mIL-2R before and after PHA induction were all lower in hepatitis C than those in normal controls(P<0.01).But the level of T cells subsets and mIL-2R showed no significant difference between acute and chronic hepatitis C(P>0.05).Conclusions:The function of cellular immunity and activation of T cells are obviously in disorder in patients with hepatitis C,and that is closely associated with changing of the hepatitis into chronic.
, 百拇医药
Key words hepatitis,viral，C；receptors,antigen,T-cell;interleukins
以往认为丙型病毒性肝炎(丙肝)是丙型肝炎病毒(HCV)对肝细胞的直接损害，近年来发现也与患者的细胞免疫功能有关。T淋巴细胞亚群和膜白介素-2受体(membrance interleukin-2 receptor,mIL-2R)是反映机体细胞免疫功能和T细胞活化程度的最新指标，较传统的淋巴细胞转化试验、E花环试验具有更高的特异性和灵敏性。生物素-链霉亲和素(biotin-streptavidin,BSA)是一种新型的酶免疫组织化学法，具有较高的特异性和敏感性〔1〕。本文用该法对112例急慢性丙肝患者进行细胞免疫功能检测分析，以探讨其在丙肝发病机理中的作用和临床应用价值。
1 资料与方法
1.1 病例选择 所选112例丙型病毒性肝炎患者系我院教学医院、附属医院门诊及住院患者；其中，抗-HCV阳性急性丙肝患者28例，抗-HCV阳性慢性丙肝患者84例。诊断标准参照1990年上海第6届全国肝炎会议讨论修订的诊断标准。男76例，女36例。另选取本市中心血站体检正常献血员20名为正常对照。
, 百拇医药
1.2 试剂与仪器 BSA法T细胞亚群及诊断试剂购自上海某医化所。淋巴细胞分离液系上海产品，批号951215。ELISA抗-HCV诊断试剂购自上海华美公司，批号960318。MDF-135型CO2培养箱。
1.3 方法
1.3.1 标本采集 分批集中采集丙肝患者晨起空腹新鲜外周静脉血5 ml，分装于1支无菌试管和1支肝素抗凝管，立即送检。
1.3.2 外周血单个核细胞分离及T细胞亚群、mIL-2R检测 将新鲜肝素抗凝血用无Ca2+、Mg2+ Hank液等量稀释后，以淋巴细胞分离液常规分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)，用Hank液洗涤2次，以1640完全培养液配成(1～3)×106/ml细胞悬液，取10 μl涂布于印有防酸漆圈的玻片孔内，做CD3+、CD4+、CD8+及静息期mIL-2R检测。另取细胞悬液，加入最终浓度为200 μg/ml PHA的1640完全培养液0.5 ml，置37℃含5% CO2的CO2培养箱中孵育72 h，再以1 500 r/min离心5 min，取沉淀细胞用1640完全培养液稀释成1×106/ml，同上法涂片，做诱导期mIL-2R检测。
, 百拇医药
1.3.3 BSA法免疫组化染色 取自然干燥的涂片，用新鲜丙酮固定15～20 min，干后分别分步加入抗CD3+、抗CD4+、抗CD8+、抗-Tac的McAb及生物素化羊抗鼠IgG、SA-HRP于各孔中，经37℃孵育30 min后，用Tris缓冲液(TBS)漂洗，最终加入当天新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)显色液，待显色明显时用TBS漂洗，终止显色。高倍镜下观察，细胞质或细胞膜呈棕色，为阳性，不着色为阴性，共计数200个单个核细胞，分别计算阳性百分率。
2 结果
抗-HCV阳性外周血CD3+、CD4+百分率降低，CD8+百分率升高，CD4+/CD8+比值下降(P<0.05～P<0.01)。但抗-HCV阳性急性患者CD4+/CD8+与对照组差异无显著性(P>0.05)；而急慢性丙肝患者T细胞亚群水平相比，差异也无显著性(P>0.05)。丙肝患者外周血T细胞对PHA诱导反应能力，在静息状态时，急慢性丙肝患者T细胞的mIL-2R表达水平偏低，与正常对照相比，差异有显著性(P<0.01)。经PHA体外诱导后，急慢性丙肝患者T细胞的mIL-2R表达水平均较诱导前明显增高，但仍低于正常对照(P<0.01)；而急慢性丙肝患者在静息期和诱导后均差异无显著性(P>0.05)(见表1)。
, http://www.100md.com
表1 丙肝患者外周血T细胞亚群和mIL-2R检测结果〔
±s，百分率(%)〕 组别
n
CD3+
CD4+
CD8+
CD4+/CD8+
mIL-2R
静息期
诱导期
, 百拇医药 抗HCV(+)AH
28
62.12±5.29*
37.12±5.25**
35.24±6.50*
1.18±0.30
3.32±0.95**
34.15±1.94**
抗HCV(+)CH
84
60.68±6.53**
, 百拇医药
36.65±4.74**
36.10±5.58**
1.04±0.42**
3.05±1.15**
33.86±2.26**
正常对照
20
65.80±6.92
41.20±6.36
31.25±4.62
, 百拇医药
1.39±0.33
4.24±1.52
36.30±2.95
F
—
5.30
6.46
5.94
7.06
8.30
9.04
P
<0.01
, http://www.100md.com
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
MS组内
40.346
26.183
32.020
0.148
1.380
5.356
, 百拇医药
AH：急性肝炎；CH：慢性肝炎；q检验：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01
3 讨论
丙肝患者较乙肝易发生慢性化〔2〕，本文用BSA法对112例丙肝患者外周血T细胞亚群检测发现，各淋巴细胞亚群数目及相互比例与正常相比有明显差异(P<0.05～P<0.01)，与文献报道相似〔3〕，表明丙肝患者体内存在明显细胞免疫功能紊乱，并通过细胞免疫介导细胞免疫损伤。
CD3+、CD4+、CD8+是T细胞的主要功能亚群，在机体抗病毒免疫反应中起重要作用，其数目及相互关系可反应丙肝患者体内的细胞免疫水平及免疫调节状态，是预测病情转归有价值的指标。急慢性丙肝患者外周血CD3+百分率均下降，且慢性丙肝患者CD3+降低更为显著，反映丙肝患者抗病毒免疫应答功能部分缺损。急慢性丙肝患者CD4+减少可能是机体免疫功能失调的结果，与机体不能及时清除HCV有关。丙肝患者CD8+升高，且慢性活动性丙肝患者更为显著，是造成肝细胞持续性破坏、引起临床上ALT增高的原因之一。CD4+/CD8+比例是机体免疫调控网络中的重要枢纽。丙肝患者特别是慢性活动性丙肝患者CD8+增高，表明杀伤性T细胞参与活动性肝病的肝损伤，它既限制机体对HCV抗原的体液免疫应答，也限制机体对HCV感染的细胞免疫应答，导致HCV在肝细胞内持续存在，促使病情由急性向慢性化方向转化。
, 百拇医药
mIL-2R是T细胞活化的标志〔4〕，在IL-2发挥生物学效应上起关键作用，其表达水平可反应T细胞的激活过程和机体的免疫状态。用BSA系统检测发现丙肝患者外周血T细胞在静息时表达水平降低，与正常对照相比差异有高度显著性(P<0.01)。提示有T细胞功能表达障碍，可能的原因是：(1)丙肝患者体内的HCV可抑制T细胞表达mIL-2R，使部分T细胞处于抑制状态。(2)HCV-RNA可通过感染PBMC而在其中复制增殖〔5〕，促使T细胞产生并释放大量血清可溶性白介素-2受体(soluble interleukin-2 receptor,sIL-2R)，限制mIL-2R表达，这不仅是机体对入侵的HCV细胞免疫诱导能力低下的表现，同时部分活化的Tc细胞通过T细胞受体(T cell receptor)与肝细胞膜表面的HCV抗原-MHC-Ⅰ类分子复合体紧密结合，释放穿孔蛋白等溶细胞介质，使肝细胞发生不可逆的、进行性的损伤，成为丙肝患者病情迁延反复、久治难愈的原因之一。(3)sIL-2R可与mIL-2R竞相与IL-2结合〔6〕，作为一种免疫抑制因子，作用类似封闭因子，中和活化T细胞周围的IL-2，以减弱T细胞的自分泌效应，加重宿主的细胞免疫功能紊乱，从而使HCV感染持续化。
, 百拇医药
T细胞表面含有PHA受体，用PHA体外刺激T细胞72 h后，在诱导状态下，mIL-2R表达水平较静息状态时明显提高，提示PHA可诱导T细胞的mIL-2R表达，提高其与sIL-2R的竞争能力。丙肝患者T细胞经PHA诱导后，其mIL-2R表达水平较静息状态明显提高，但与正常对照相比表达水平仍较低，差异有显著性(P<0.01)。提示丙肝患者T细胞体外培养时对PHA的诱导反应弱，与文献报道相似〔7〕，同时未充分表达mIL-2R的T细胞不利于HCV的清除，使HCV感染慢性化。
国家煤炭工业局高校优秀青年科学基金资助课题
参考文献
1 王 健，祁新兰.BSA系统检测慢性乙肝患者T淋巴细胞亚群.皖南医学院学报，1997，16(1)∶5
2 Barnaba V,Zaccari C,Levrero M,et al.Immunoregulatory T cell in HBV-induced chronic liver disease as defined by monoclonal antibodies.Clin Immunol Immunopathol,1983,26(2)∶83
, 百拇医药
3 章幼弈.丙型肝炎病毒感染者外周血淋巴细胞亚群变化及意义.临床肝胆病杂志，1993，9(4)∶212
4 张 瑞，顾长海，李梦东.乙型慢性活动性肝炎患者外周血淋巴细胞亚群功能变化与细胞内HBV感染的关系.临床肝胆病杂志，1994，10(1)∶46
5 吴海滨，窦晓光，曲以琴.慢性丙型肝炎患者外周血单核细胞中丙型肝炎病毒RNA正、负链的检测.中国公共卫生，1997，13(5)∶270
6 叶红军，杨世忠，邵 建，等.乙型肝炎患者淋巴细胞转化功能和可溶性白细胞介素-2受体的观察.临床肝胆病杂志，1995，11(2)∶75
7 Sarobe P.Production of interleukin-2 in response to synthetic peptides from hepatitis C viral,E protein in patients with chronic hepatitis C:Relationship with the response to interferon treatment.J Hepatol,1996,25(1)∶1
〔收稿日期 1999-02-15〕, 百拇医药
单位：232001 淮南工业学院医学分院病原学与免疫学教研室
关键词：肝炎，病毒性，丙型；受体，抗原，T-细胞；白细胞介素类
蚌埠医学院学报990504摘要 目的：探讨丙型病毒性肝炎(丙肝)患者的细胞免疫水平及其在丙肝发病机理中的作用。方法：用生物素-链霉亲和素法对112例抗-HCV阳性患者外周血单个核细胞进行T细胞亚群及植物血凝素(PHA)诱导前后mIL-2R的检测。结果：急慢性丙肝患者与正常对照相比，外周血CD3+、CD4+百分率降低，CD8+百分率增高，CD4+/CD8+比值下降(P<0.05～P<0.01)。外周血单个核细胞在静息状态和在PHA诱导状态，其mIL-2R表达水平与正常对照组相比均低下(P<0.01)，但急慢性丙肝患者中T细胞亚群及mIL-2R表达水平类似(P>0.05)。结论：丙肝患者体内存在明显的细胞免疫功能紊乱，T细胞活化障碍，并与肝病的慢性化有关。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 512.63 R 392.11
T cells subsets and mIL-2R in peripheral blood of patients with hepatitis C
Wang Jian,Li Chaopin,Xu Lifa
(Department of Medical Etiology and Immunology,Medical College,Huainan Industrial Institute,Anhui 232001)
Abstract Objective:To study the cellular immunity level and its role in the pathogenesis of hepatitis C.Methods:T cells subsets and the level of membrance interleukin-2 receptor(mIL-2R) in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) were detected with biotin-streptavidin techinque before and after PHA induction in 112 cases of hepatitis C with positive anti-HCV.Results:In acute and chronic hepatitis C with positive anti-HCV the levels of CD3+、CD4+、CD4+/CD8+ were lower and CD8+ was higher than those in normal controls(P<0.01).The expression of mIL-2R before and after PHA induction were all lower in hepatitis C than those in normal controls(P<0.01).But the level of T cells subsets and mIL-2R showed no significant difference between acute and chronic hepatitis C(P>0.05).Conclusions:The function of cellular immunity and activation of T cells are obviously in disorder in patients with hepatitis C,and that is closely associated with changing of the hepatitis into chronic.
, 百拇医药
Key words hepatitis,viral，C；receptors,antigen,T-cell;interleukins
以往认为丙型病毒性肝炎(丙肝)是丙型肝炎病毒(HCV)对肝细胞的直接损害，近年来发现也与患者的细胞免疫功能有关。T淋巴细胞亚群和膜白介素-2受体(membrance interleukin-2 receptor,mIL-2R)是反映机体细胞免疫功能和T细胞活化程度的最新指标，较传统的淋巴细胞转化试验、E花环试验具有更高的特异性和灵敏性。生物素-链霉亲和素(biotin-streptavidin,BSA)是一种新型的酶免疫组织化学法，具有较高的特异性和敏感性〔1〕。本文用该法对112例急慢性丙肝患者进行细胞免疫功能检测分析，以探讨其在丙肝发病机理中的作用和临床应用价值。
1 资料与方法
1.1 病例选择 所选112例丙型病毒性肝炎患者系我院教学医院、附属医院门诊及住院患者；其中，抗-HCV阳性急性丙肝患者28例，抗-HCV阳性慢性丙肝患者84例。诊断标准参照1990年上海第6届全国肝炎会议讨论修订的诊断标准。男76例，女36例。另选取本市中心血站体检正常献血员20名为正常对照。
, 百拇医药
1.2 试剂与仪器 BSA法T细胞亚群及诊断试剂购自上海某医化所。淋巴细胞分离液系上海产品，批号951215。ELISA抗-HCV诊断试剂购自上海华美公司，批号960318。MDF-135型CO2培养箱。
1.3 方法
1.3.1 标本采集 分批集中采集丙肝患者晨起空腹新鲜外周静脉血5 ml，分装于1支无菌试管和1支肝素抗凝管，立即送检。
1.3.2 外周血单个核细胞分离及T细胞亚群、mIL-2R检测 将新鲜肝素抗凝血用无Ca2+、Mg2+ Hank液等量稀释后，以淋巴细胞分离液常规分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)，用Hank液洗涤2次，以1640完全培养液配成(1～3)×106/ml细胞悬液，取10 μl涂布于印有防酸漆圈的玻片孔内，做CD3+、CD4+、CD8+及静息期mIL-2R检测。另取细胞悬液，加入最终浓度为200 μg/ml PHA的1640完全培养液0.5 ml，置37℃含5% CO2的CO2培养箱中孵育72 h，再以1 500 r/min离心5 min，取沉淀细胞用1640完全培养液稀释成1×106/ml，同上法涂片，做诱导期mIL-2R检测。
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1.3.3 BSA法免疫组化染色 取自然干燥的涂片，用新鲜丙酮固定15～20 min，干后分别分步加入抗CD3+、抗CD4+、抗CD8+、抗-Tac的McAb及生物素化羊抗鼠IgG、SA-HRP于各孔中，经37℃孵育30 min后，用Tris缓冲液(TBS)漂洗，最终加入当天新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)显色液，待显色明显时用TBS漂洗，终止显色。高倍镜下观察，细胞质或细胞膜呈棕色，为阳性，不着色为阴性，共计数200个单个核细胞，分别计算阳性百分率。
2 结果
抗-HCV阳性外周血CD3+、CD4+百分率降低，CD8+百分率升高，CD4+/CD8+比值下降(P<0.05～P<0.01)。但抗-HCV阳性急性患者CD4+/CD8+与对照组差异无显著性(P>0.05)；而急慢性丙肝患者T细胞亚群水平相比，差异也无显著性(P>0.05)。丙肝患者外周血T细胞对PHA诱导反应能力，在静息状态时，急慢性丙肝患者T细胞的mIL-2R表达水平偏低，与正常对照相比，差异有显著性(P<0.01)。经PHA体外诱导后，急慢性丙肝患者T细胞的mIL-2R表达水平均较诱导前明显增高，但仍低于正常对照(P<0.01)；而急慢性丙肝患者在静息期和诱导后均差异无显著性(P>0.05)(见表1)。
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表1 丙肝患者外周血T细胞亚群和mIL-2R检测结果〔
±s，百分率(%)〕 组别n
CD3+
CD4+
CD8+
CD4+/CD8+
mIL-2R
静息期
诱导期
, 百拇医药 抗HCV(+)AH
28
62.12±5.29*
37.12±5.25**
35.24±6.50*
1.18±0.30
3.32±0.95**
34.15±1.94**
抗HCV(+)CH
84
60.68±6.53**
, 百拇医药
36.65±4.74**
36.10±5.58**
1.04±0.42**
3.05±1.15**
33.86±2.26**
正常对照
20
65.80±6.92
41.20±6.36
31.25±4.62
, 百拇医药
1.39±0.33
4.24±1.52
36.30±2.95
F
—
5.30
6.46
5.94
7.06
8.30
9.04
P
<0.01
, http://www.100md.com
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
MS组内
40.346
26.183
32.020
0.148
1.380
5.356
, 百拇医药
AH：急性肝炎；CH：慢性肝炎；q检验：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01
3 讨论
丙肝患者较乙肝易发生慢性化〔2〕，本文用BSA法对112例丙肝患者外周血T细胞亚群检测发现，各淋巴细胞亚群数目及相互比例与正常相比有明显差异(P<0.05～P<0.01)，与文献报道相似〔3〕，表明丙肝患者体内存在明显细胞免疫功能紊乱，并通过细胞免疫介导细胞免疫损伤。
CD3+、CD4+、CD8+是T细胞的主要功能亚群，在机体抗病毒免疫反应中起重要作用，其数目及相互关系可反应丙肝患者体内的细胞免疫水平及免疫调节状态，是预测病情转归有价值的指标。急慢性丙肝患者外周血CD3+百分率均下降，且慢性丙肝患者CD3+降低更为显著，反映丙肝患者抗病毒免疫应答功能部分缺损。急慢性丙肝患者CD4+减少可能是机体免疫功能失调的结果，与机体不能及时清除HCV有关。丙肝患者CD8+升高，且慢性活动性丙肝患者更为显著，是造成肝细胞持续性破坏、引起临床上ALT增高的原因之一。CD4+/CD8+比例是机体免疫调控网络中的重要枢纽。丙肝患者特别是慢性活动性丙肝患者CD8+增高，表明杀伤性T细胞参与活动性肝病的肝损伤，它既限制机体对HCV抗原的体液免疫应答，也限制机体对HCV感染的细胞免疫应答，导致HCV在肝细胞内持续存在，促使病情由急性向慢性化方向转化。
, 百拇医药
mIL-2R是T细胞活化的标志〔4〕，在IL-2发挥生物学效应上起关键作用，其表达水平可反应T细胞的激活过程和机体的免疫状态。用BSA系统检测发现丙肝患者外周血T细胞在静息时表达水平降低，与正常对照相比差异有高度显著性(P<0.01)。提示有T细胞功能表达障碍，可能的原因是：(1)丙肝患者体内的HCV可抑制T细胞表达mIL-2R，使部分T细胞处于抑制状态。(2)HCV-RNA可通过感染PBMC而在其中复制增殖〔5〕，促使T细胞产生并释放大量血清可溶性白介素-2受体(soluble interleukin-2 receptor,sIL-2R)，限制mIL-2R表达，这不仅是机体对入侵的HCV细胞免疫诱导能力低下的表现，同时部分活化的Tc细胞通过T细胞受体(T cell receptor)与肝细胞膜表面的HCV抗原-MHC-Ⅰ类分子复合体紧密结合，释放穿孔蛋白等溶细胞介质，使肝细胞发生不可逆的、进行性的损伤，成为丙肝患者病情迁延反复、久治难愈的原因之一。(3)sIL-2R可与mIL-2R竞相与IL-2结合〔6〕，作为一种免疫抑制因子，作用类似封闭因子，中和活化T细胞周围的IL-2，以减弱T细胞的自分泌效应，加重宿主的细胞免疫功能紊乱，从而使HCV感染持续化。
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T细胞表面含有PHA受体，用PHA体外刺激T细胞72 h后，在诱导状态下，mIL-2R表达水平较静息状态时明显提高，提示PHA可诱导T细胞的mIL-2R表达，提高其与sIL-2R的竞争能力。丙肝患者T细胞经PHA诱导后，其mIL-2R表达水平较静息状态明显提高，但与正常对照相比表达水平仍较低，差异有显著性(P<0.01)。提示丙肝患者T细胞体外培养时对PHA的诱导反应弱，与文献报道相似〔7〕，同时未充分表达mIL-2R的T细胞不利于HCV的清除，使HCV感染慢性化。
国家煤炭工业局高校优秀青年科学基金资助课题
参考文献
1 王 健，祁新兰.BSA系统检测慢性乙肝患者T淋巴细胞亚群.皖南医学院学报，1997，16(1)∶5
2 Barnaba V,Zaccari C,Levrero M,et al.Immunoregulatory T cell in HBV-induced chronic liver disease as defined by monoclonal antibodies.Clin Immunol Immunopathol,1983,26(2)∶83
, 百拇医药
3 章幼弈.丙型肝炎病毒感染者外周血淋巴细胞亚群变化及意义.临床肝胆病杂志，1993，9(4)∶212
4 张 瑞，顾长海，李梦东.乙型慢性活动性肝炎患者外周血淋巴细胞亚群功能变化与细胞内HBV感染的关系.临床肝胆病杂志，1994，10(1)∶46
5 吴海滨，窦晓光，曲以琴.慢性丙型肝炎患者外周血单核细胞中丙型肝炎病毒RNA正、负链的检测.中国公共卫生，1997，13(5)∶270
6 叶红军，杨世忠，邵 建，等.乙型肝炎患者淋巴细胞转化功能和可溶性白细胞介素-2受体的观察.临床肝胆病杂志，1995，11(2)∶75
7 Sarobe P.Production of interleukin-2 in response to synthetic peptides from hepatitis C viral,E protein in patients with chronic hepatitis C:Relationship with the response to interferon treatment.J Hepatol,1996,25(1)∶1
〔收稿日期 1999-02-15〕, 百拇医药