通痹灵对大鼠滑膜成纤维细胞增殖反应的影响★
作者：陈纪藩 沈晓燕 赵会芳 李颂华 李迎敏 廖世煌黄仰模 奥西秀树 邱联群 关 彤 方永奇 刘晓玲
单位：广州中医药大学第一附属医院，广州市机场路16号(510405)；日本岛根医科大学
关键词：＠通痹灵；治疗应用；关节炎；类风湿性；中药疗法；成纤维细胞；疾病模型；动物
新中医990520 提 要 采用组织块培养的方法获得滑膜成纤维细胞；MTT法检测不同滑膜细胞培养上清液对滑膜成纤维细胞增殖反应的影响。结果：佐剂性关节炎(AA)大鼠不同稀释度滑膜细胞培养上清液均可促进成纤维细胞增殖反应，其最适稀释度为1∶40；TBL组的滑膜细胞培养上清液对成纤维细胞增殖无明显影响；甲氨喋呤组滑膜细胞培养上清液对成纤维细胞增殖有轻度的促进作用；消炎痛组滑膜细胞培养上清液对成纤维细胞的增殖具有明显的促进作用。提示：AA大鼠关节骨质破坏可能与滑膜细胞分泌细胞因子和炎症介质，促进成纤维细胞增殖有关；TBL治疗RA的机理之一可能是通过下调滑膜细胞的分泌功能，使AA大鼠滑膜成纤维细胞的过度增殖恢复正常。
, 百拇医药
中药复方制剂通痹灵(TBL)是以经方桂枝芍药知母汤为基础研制而成，文献[1]报道了TBL具有抗炎和免疫调节作用，能明显抑制模型动物关节骨质破坏。本研究通过观察TBL对滑膜成纤维细胞增殖反应影响，进一步研究TBL治疗类风湿性关节炎(RA)的作用机理。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂 TBL由本院制剂室生产，每片0.25 g；消炎痛(indometacin，IM)上海第十二制药厂产品；甲氨喋呤(methotrexate，MTX)广东石岐制药厂产品；完全佛氏佐剂，日本三光株式会社产品；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，Sigma公司产品；Ⅱ型胶原酶，Sigma公司产品；胰蛋白酶(1∶250)，Difco产品进口分装；上述三种试剂均用D-Hanks缓冲液配制。MII为Fluka AG产品；DMEM(Dubeccos modified Eagles medium)培养粉为Gibco公司产品，应用液另加25 mmol/LHEPES，1 mmol/L丙酮酸钠，2 mmol/L L-谷氨酰胺，50 μmol/L丙酮酸钠，100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素和10%小牛血清，pH调整至7.2。
, 百拇医药
1.2 仪器 CO2培养箱，HW0301T-VBA型，美国HARRIS产品；酶标仪，3550型，美国BIO-RAD公司产品；离心机，LDZ4-OB型，上海医用离心机厂。
1.3 佐剂性关节炎(AA)大鼠模型复制和分组用药清洁级Sprague-Dawley大鼠，50只，雌雄兼用，2～3月龄，体重180±20 g，由中山医科大学实验动物中心提供，动物合格证：96A49。随机分为5组，通痹灵组、甲氨喋呤组、消炎痛组、模型组、正常组，分别于各鼠右后肢足跖皮内注射0.1 ml完全佛氏佐剂致炎(正常组免注射)。于致炎后第24天分组灌药，通痹灵组和消炎痛组分别以5 g/kg*d及2 mg/kg*d灌胃，甲氨喋呤组以1.5 mg/kg*W灌胃给药。模型组、正常组按10 ml/kg*d灌以生理盐水。
1.4 大鼠滑膜细胞培养上清液的制备[3] 于实验第16周断头处死大鼠，无菌取出大鼠双侧膝关节滑膜组织，经胶原酶和胰酶消化后，分离成单个滑膜细胞，经Giemsa和台盼蓝染色，检测其纯度大于98%，活力大于95%。用含有5 mg/L LPS的DMEM培养液配制滑膜细胞悬液(5×105*L-1)，加入24孔培养板内，每孔1 ml，于37℃、5%CO2培养箱培养48小时，收集上清液，离心、过滤，-40℃保存待用。
, 百拇医药
1.5 滑膜成纤维细胞分离和培养[4，5] 无菌取出大鼠双侧膝关节滑膜组织，剪成直径1～2 mm小块，以DMEM培养液离心洗涤2～3次，去除脂肪组织。将组织小块均匀排列在培养瓶中的底壁上，轻轻侧转培养瓶，加入10%小牛血清-DMEM培养液少许，置于37℃、5%CO2培养箱培养2小时，轻轻放平培养瓶，以培养液刚刚覆盖组织块为宜，再于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。每隔1～2天换培养液1次，待有滑膜成纤维细胞长出组织块后，去除组织块，继续培养，待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养，大约传代2次后，滑膜成纤维细胞经台盼蓝和Giemsa染色，其纯度大于98%，活力大于95%。
1.6 滑膜成纤维细胞增殖反应检测[6] 用DMEM培养液制备滑膜成纤维悬液(1×107*L-1)，加至96孔培养板，每孔100 μl，置37℃、5%CO2培养箱培养24小时，使其贴壁，然后弃原培养液，分别加入滑膜组织培养上清液和培养液各100 μl，继续培养66小时，各孔加MTT(5 μg/ml)溶液20 μl再培养6小时，吸去上清液，加入DMSO 100 μl，振荡3分钟后置于酶标仪上测各孔OD值(波长490 nm)。
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2 结果
2.1 AA大鼠不同稀释度滑膜细胞培养上清液对滑膜成纤维细胞增殖反应的影响，见表1。结果表明，AA大鼠不同稀释度滑膜细胞培养上清液均能促进滑膜成纤维细胞增殖反应，其最适稀释度为1∶40。
表1 AA大鼠不同稀释度滑膜细胞培养上清液对滑膜成纤维细胞增殖反应的影响(x±s，n＝6)
培养上清液稀度
OD 值
对照
0.274±0.038
1∶10
0.411±0.036※
, 百拇医药
1∶20
0.483±0.055※
1∶40
0.747±0.061※
1∶80
0.593±0.053※
1∶160
0.428±0.049※
※与对照组相比，P<0.01
2.2 TBL对大鼠滑膜成纤维细胞增殖反应的影响，见表2。结果表明，TBL组滑膜细胞培养上清液对滑膜成纤维细胞增殖无明显影响；甲氨喋呤组滑膜细胞培养上清液在一定程度上增强了滑膜成纤维细胞增殖反应，但同AA组相比又有减轻；而消炎痛组滑膜细胞培养上清液则进一步促进了滑膜成纤维细胞增殖反应，同AA组相比更为明显。
, 百拇医药
表2 不同滑膜细胞培养上清液对大鼠滑膜成纤维细胞增殖反应的影响(x±s，n＝6)
培养上清液
OD值
正常组
0.352±0.033
模型组
0.747±0.061※ ※
通痹灵组
0.385±0.042＃ ＃
甲氨喋呤组
0.463±0.039※ ＃ ＃
, 百拇医药
消炎痛组
0.869±0.078※ ※ ＃
※P<0.05，※※P<0.01(与正常组相比)，＃P<0.05，＃＃P<0.01(与模型组相比)
3 讨论
从分子细胞水平研究RA的发病机理和抗RA药的治疗机理引起国内外的关注。文献表明RA患者及模型动物外周血、关节滑液及滑膜细胞培养上清液中IL-1和TNF-α活性明显增高，促进了滑膜成纤维细胞的增殖，形成RA特征性血管翳，在RA病理过程中起关键作用[5～8]。本实验采用组织块培养的方法，获取滑膜成纤维细胞，研究不同观察组滑膜细胞原代培养收集的上清液对成纤维细胞增殖反应的影响。力图从分子细胞角度研究RA的病理机制。结果证实，AA大鼠不同稀释度的滑膜细胞培养上清液均能促进成纤维细胞的增殖。
, 百拇医药
TBL是以经方桂枝芍药知母汤为基础研制而成，由桂枝、芍药、知母、生姜、甘草、麻黄、白术、防风、川乌、水牛角、乳香、没药、马钱子、蜈蚣、玉竹等15味药组成，具有清热除湿、滋阴通阳、活血通络、化瘀止痛的功效。本实验结果表明，TBL组滑膜细胞培养上清液对成纤维细胞的增殖无明显影响，提示TBL治疗RA的机理之一可能是通过下调滑膜细胞异常升高的分泌细胞因子和炎症介质的功能，从而使AA大鼠滑膜成纤维细胞的过度增殖恢复正常。
本项研究及我们以往的研究说明，中药复方制剂TBL不仅可以改善症状而且可以改变病情，其治疗RA的机理之一可能与其下调滑膜细胞异常升高的分泌能力，使高度增殖的成纤维细胞恢复正常有关。通痹灵安全、无毒、耐受性较MTX和IM好，还可以改善AA大鼠的一般状况，其进一步的作用机理尚待研究。
★ 广东省自然科学基金资助课题(960550)
参考文献
, http://www.100md.com
[1] Li S-H，Kobayashi Y，Yamauchi Y，Gondda T and T sunematsu T.Suppressive effects of a herbal for mula TBL-1 on type Ⅱ collagen-induced arthritis in DBA/1J mice.Clin Exp Pharmacol Physiol，1996，20∶236～240
[2] 陈纪藩，丘联群.通痹灵治疗类风湿病临床与实验研究.中国中西医结合杂志。1994，(增刊)：163～164
[3] 王 斌，陈敏珠，徐叔云.大鼠滑膜细胞的分离和培养.中国药理学通报，1994，10(1)∶73～74
[4] 鄂 征.组织培养技术.北京∶人民卫生出版社，1988.127～130
[5] 王 斌，陈敏珠，徐叔云.白芍总甙对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞功能和脾细胞增殖反应的影响.中国药理学与毒理学杂志，1994，8(2)∶128
, http://www.100md.com
[6] 王 斌，陈敏珠.滑膜细胞培养上清液对成纤维细胞增殖反应的影响.安徽医科大学学报，1997，32(5)∶534～536
[7] Freundlich B，Bomalrski JS，Neilson E.Regulation of fibroblast proliferation and collagen synthesis by cytokines.Immunol.Today，1986，(10)∶303～307
[8] Vilcek J，Palombella VJ，Henriksen-destefano D，et al.Fibroblast growth enhancing activity of tumor necrosis factor and its relationshio to other polypeptide growth factors.J exp.Med，1986，(163)∶632～638
(收稿日期：1998-09-07), 百拇医药
单位：广州中医药大学第一附属医院，广州市机场路16号(510405)；日本岛根医科大学
关键词：＠通痹灵；治疗应用；关节炎；类风湿性；中药疗法；成纤维细胞；疾病模型；动物
新中医990520 提 要 采用组织块培养的方法获得滑膜成纤维细胞；MTT法检测不同滑膜细胞培养上清液对滑膜成纤维细胞增殖反应的影响。结果：佐剂性关节炎(AA)大鼠不同稀释度滑膜细胞培养上清液均可促进成纤维细胞增殖反应，其最适稀释度为1∶40；TBL组的滑膜细胞培养上清液对成纤维细胞增殖无明显影响；甲氨喋呤组滑膜细胞培养上清液对成纤维细胞增殖有轻度的促进作用；消炎痛组滑膜细胞培养上清液对成纤维细胞的增殖具有明显的促进作用。提示：AA大鼠关节骨质破坏可能与滑膜细胞分泌细胞因子和炎症介质，促进成纤维细胞增殖有关；TBL治疗RA的机理之一可能是通过下调滑膜细胞的分泌功能，使AA大鼠滑膜成纤维细胞的过度增殖恢复正常。
, 百拇医药
中药复方制剂通痹灵(TBL)是以经方桂枝芍药知母汤为基础研制而成，文献[1]报道了TBL具有抗炎和免疫调节作用，能明显抑制模型动物关节骨质破坏。本研究通过观察TBL对滑膜成纤维细胞增殖反应影响，进一步研究TBL治疗类风湿性关节炎(RA)的作用机理。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂 TBL由本院制剂室生产，每片0.25 g；消炎痛(indometacin，IM)上海第十二制药厂产品；甲氨喋呤(methotrexate，MTX)广东石岐制药厂产品；完全佛氏佐剂，日本三光株式会社产品；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，Sigma公司产品；Ⅱ型胶原酶，Sigma公司产品；胰蛋白酶(1∶250)，Difco产品进口分装；上述三种试剂均用D-Hanks缓冲液配制。MII为Fluka AG产品；DMEM(Dubeccos modified Eagles medium)培养粉为Gibco公司产品，应用液另加25 mmol/LHEPES，1 mmol/L丙酮酸钠，2 mmol/L L-谷氨酰胺，50 μmol/L丙酮酸钠，100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素和10%小牛血清，pH调整至7.2。
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1.2 仪器 CO2培养箱，HW0301T-VBA型，美国HARRIS产品；酶标仪，3550型，美国BIO-RAD公司产品；离心机，LDZ4-OB型，上海医用离心机厂。
1.3 佐剂性关节炎(AA)大鼠模型复制和分组用药清洁级Sprague-Dawley大鼠，50只，雌雄兼用，2～3月龄，体重180±20 g，由中山医科大学实验动物中心提供，动物合格证：96A49。随机分为5组，通痹灵组、甲氨喋呤组、消炎痛组、模型组、正常组，分别于各鼠右后肢足跖皮内注射0.1 ml完全佛氏佐剂致炎(正常组免注射)。于致炎后第24天分组灌药，通痹灵组和消炎痛组分别以5 g/kg*d及2 mg/kg*d灌胃，甲氨喋呤组以1.5 mg/kg*W灌胃给药。模型组、正常组按10 ml/kg*d灌以生理盐水。
1.4 大鼠滑膜细胞培养上清液的制备[3] 于实验第16周断头处死大鼠，无菌取出大鼠双侧膝关节滑膜组织，经胶原酶和胰酶消化后，分离成单个滑膜细胞，经Giemsa和台盼蓝染色，检测其纯度大于98%，活力大于95%。用含有5 mg/L LPS的DMEM培养液配制滑膜细胞悬液(5×105*L-1)，加入24孔培养板内，每孔1 ml，于37℃、5%CO2培养箱培养48小时，收集上清液，离心、过滤，-40℃保存待用。
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1.5 滑膜成纤维细胞分离和培养[4，5] 无菌取出大鼠双侧膝关节滑膜组织，剪成直径1～2 mm小块，以DMEM培养液离心洗涤2～3次，去除脂肪组织。将组织小块均匀排列在培养瓶中的底壁上，轻轻侧转培养瓶，加入10%小牛血清-DMEM培养液少许，置于37℃、5%CO2培养箱培养2小时，轻轻放平培养瓶，以培养液刚刚覆盖组织块为宜，再于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。每隔1～2天换培养液1次，待有滑膜成纤维细胞长出组织块后，去除组织块，继续培养，待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养，大约传代2次后，滑膜成纤维细胞经台盼蓝和Giemsa染色，其纯度大于98%，活力大于95%。
1.6 滑膜成纤维细胞增殖反应检测[6] 用DMEM培养液制备滑膜成纤维悬液(1×107*L-1)，加至96孔培养板，每孔100 μl，置37℃、5%CO2培养箱培养24小时，使其贴壁，然后弃原培养液，分别加入滑膜组织培养上清液和培养液各100 μl，继续培养66小时，各孔加MTT(5 μg/ml)溶液20 μl再培养6小时，吸去上清液，加入DMSO 100 μl，振荡3分钟后置于酶标仪上测各孔OD值(波长490 nm)。
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2 结果
2.1 AA大鼠不同稀释度滑膜细胞培养上清液对滑膜成纤维细胞增殖反应的影响，见表1。结果表明，AA大鼠不同稀释度滑膜细胞培养上清液均能促进滑膜成纤维细胞增殖反应，其最适稀释度为1∶40。
表1 AA大鼠不同稀释度滑膜细胞培养上清液对滑膜成纤维细胞增殖反应的影响(x±s，n＝6)
培养上清液稀度
OD 值
对照
0.274±0.038
1∶10
0.411±0.036※
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1∶20
0.483±0.055※
1∶40
0.747±0.061※
1∶80
0.593±0.053※
1∶160
0.428±0.049※
※与对照组相比，P<0.01
2.2 TBL对大鼠滑膜成纤维细胞增殖反应的影响，见表2。结果表明，TBL组滑膜细胞培养上清液对滑膜成纤维细胞增殖无明显影响；甲氨喋呤组滑膜细胞培养上清液在一定程度上增强了滑膜成纤维细胞增殖反应，但同AA组相比又有减轻；而消炎痛组滑膜细胞培养上清液则进一步促进了滑膜成纤维细胞增殖反应，同AA组相比更为明显。
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表2 不同滑膜细胞培养上清液对大鼠滑膜成纤维细胞增殖反应的影响(x±s，n＝6)
培养上清液
OD值
正常组
0.352±0.033
模型组
0.747±0.061※ ※
通痹灵组
0.385±0.042＃ ＃
甲氨喋呤组
0.463±0.039※ ＃ ＃
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消炎痛组
0.869±0.078※ ※ ＃
※P<0.05，※※P<0.01(与正常组相比)，＃P<0.05，＃＃P<0.01(与模型组相比)
3 讨论
从分子细胞水平研究RA的发病机理和抗RA药的治疗机理引起国内外的关注。文献表明RA患者及模型动物外周血、关节滑液及滑膜细胞培养上清液中IL-1和TNF-α活性明显增高，促进了滑膜成纤维细胞的增殖，形成RA特征性血管翳，在RA病理过程中起关键作用[5～8]。本实验采用组织块培养的方法，获取滑膜成纤维细胞，研究不同观察组滑膜细胞原代培养收集的上清液对成纤维细胞增殖反应的影响。力图从分子细胞角度研究RA的病理机制。结果证实，AA大鼠不同稀释度的滑膜细胞培养上清液均能促进成纤维细胞的增殖。
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TBL是以经方桂枝芍药知母汤为基础研制而成，由桂枝、芍药、知母、生姜、甘草、麻黄、白术、防风、川乌、水牛角、乳香、没药、马钱子、蜈蚣、玉竹等15味药组成，具有清热除湿、滋阴通阳、活血通络、化瘀止痛的功效。本实验结果表明，TBL组滑膜细胞培养上清液对成纤维细胞的增殖无明显影响，提示TBL治疗RA的机理之一可能是通过下调滑膜细胞异常升高的分泌细胞因子和炎症介质的功能，从而使AA大鼠滑膜成纤维细胞的过度增殖恢复正常。
本项研究及我们以往的研究说明，中药复方制剂TBL不仅可以改善症状而且可以改变病情，其治疗RA的机理之一可能与其下调滑膜细胞异常升高的分泌能力，使高度增殖的成纤维细胞恢复正常有关。通痹灵安全、无毒、耐受性较MTX和IM好，还可以改善AA大鼠的一般状况，其进一步的作用机理尚待研究。
★ 广东省自然科学基金资助课题(960550)
参考文献
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[1] Li S-H，Kobayashi Y，Yamauchi Y，Gondda T and T sunematsu T.Suppressive effects of a herbal for mula TBL-1 on type Ⅱ collagen-induced arthritis in DBA/1J mice.Clin Exp Pharmacol Physiol，1996，20∶236～240
[2] 陈纪藩，丘联群.通痹灵治疗类风湿病临床与实验研究.中国中西医结合杂志。1994，(增刊)：163～164
[3] 王 斌，陈敏珠，徐叔云.大鼠滑膜细胞的分离和培养.中国药理学通报，1994，10(1)∶73～74
[4] 鄂 征.组织培养技术.北京∶人民卫生出版社，1988.127～130
[5] 王 斌，陈敏珠，徐叔云.白芍总甙对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞功能和脾细胞增殖反应的影响.中国药理学与毒理学杂志，1994，8(2)∶128
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[6] 王 斌，陈敏珠.滑膜细胞培养上清液对成纤维细胞增殖反应的影响.安徽医科大学学报，1997，32(5)∶534～536
[7] Freundlich B，Bomalrski JS，Neilson E.Regulation of fibroblast proliferation and collagen synthesis by cytokines.Immunol.Today，1986，(10)∶303～307
[8] Vilcek J，Palombella VJ，Henriksen-destefano D，et al.Fibroblast growth enhancing activity of tumor necrosis factor and its relationshio to other polypeptide growth factors.J exp.Med，1986，(163)∶632～638
(收稿日期：1998-09-07), 百拇医药