采用白桂木凝集素-HRP测定唾液SIgA方法的建立
作者：朱其芳 吴耀生 邓 勇 周素芳
单位：广西医科大学生物化学教研室 南宁 530021
关键词：白桂木凝集素(AHL)；SIgA；夹心酶联法
广西医科大学学报990512
摘要 目的：建立白桂木凝集素-HRP夹心法检测唾液中分泌型IgA(SIgA)。方法：制备AHL-HRP作为酶标凝集素，AHL为包被物，确定最适包被浓度及AHL-HRP工作稀释度，夹心酶联检测SIgA，进行检出限、精密度、准确性等实验并制备标准曲线，初步测定 71 例正常人唾液SIgA含量。结果：AHL-HRP夹心法检测SIgA标准曲线线性检测范围5～337mg/L。 本法测定71例健康人唾液SIgA含量为( 509.15±296.75 )mg/L。其中5份标本批内平均变异7.4% ，批间变异10.56%，回收率平均94%。结论：AHL-HRP夹心法测定SIgA的作用模式为 AHL→SIgA→AHL-HRP，可用于唾液中的SIgA含量的测定。方法简便、准确、便于推广。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R392-33
DETERMINING SIgA IN SALIVA BY SANDWICH ENZYME-LINKED ASSAY WITH AHL-HRP
Zhu Qifang，Wu Yaosheng，Deng yong，et al
(Department of Biochemistry, Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective：AHL- HRP Sandwich assay was developed for the measurement of SIgA.Methods：AHL- HRP was prepared, and optimum concentration of the coating AHL and working dilution degree of AHL-HRP was determined for the measure-ment of SIgA with Sandwich enzyme-linked assay.The working rang of the standard curves,precision and accuracy was performed.The standard curves were prepared for SIgA.Results：The working range of the standard curves were 5～337mg/L for SIgA respectively. The value of SIgA in the saliva of 71 healthy persons was(509.15±296. 75) mg/L with the assay.Intra-assay cv 7.4%. Inter-assay cv 10.56%. Reclamation was 94%.Conclusion：The sandwich enzyme-linked assay with AHL-HRP is simple and precise,and be used in wide range.
, 百拇医药
Key word AHL; SIgA;sandwich enzyme-linked assay
分泌型IgA(SIgA)广泛存在于乳汁、唾液、泪液、尿液、生殖系分泌液、呼吸道分泌液、胃肠液中，是人体粘膜免疫的主要抗体。现知一些感染性疾病、免疫缺陷病、泌尿生殖系疾病及一些肿瘤均同SIgA质和量改变有关[1]，为此寻找一种能准确定量， 反映外分泌液中SIgA改变情况的检测方法具有重要的临床意义。测定SIgA的方法有多种，在临床应用中各有其局限性，本文首次报道一种采用酶标白桂木凝集素检测SIgA的酶联夹心法。我们利用白桂木凝集素(Artocarpus hypargyreus Lectin，AHL)能与SIgA特异结合的性质，制备AHL-HRP，建立了AHL-HRP夹心法检测唾液SIgA。探讨 AHL- HRP 夹心法检测唾液SIgA的条件及其在临床应用的可能性。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 材料
1.1.1 主要试剂：AHL、SIgA(均为本室提供)；HRP(上海丽珠东风生物技术有限公司产)；底物TMB，A、B液、终止液(华美生物公司产)。
1.1.2 主要仪器：MODELΣ960酶标仪(台湾产)；96孔酶标板。
1.1.3 健康人唾液由本校健康大学生提供。
1.2 方法
1.2.1 SIgA标准的制备：将提纯的AHL制备AHL-Sepharose4B，用于初乳的亲和层析， 收集AHL结合蛋白，经SDS-PAGE鉴定，用酚试剂法定蛋白。
1.2.2 AHL-HRP的制备：按郭春祥的HRP标记抗体的过碘酸钠法[2]稍加改进，其酶结合物中HRP浓度按蒋成诠法[3]计算。加甘油至50%分装后于-20℃贮存备用。 AHL-HRP用PBS-吐温以1/2500稀释应用。
, 百拇医药
1.2.3 夹心法检测SIgA：AHL包被浓度为5mg/L，100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-吐温洗板3次，加入已稀释至一定浓度的待测物100μl/孔，37℃30min，同上洗板，加AHL-HRP，37℃30min，洗板后加底物TMB A、B液各1滴，混匀，37℃10min后加终止液1滴，混匀后测A450。每次同时设空白及阴性对照。
2 结 果
2.1 SIgA测定标准曲线
将SIgA倍比稀释后按夹心法测定，A450作纵座标，稀释滴度倒数对数为横座标制备标准曲线。SIgA的线性检测范围为5～377mg/L。 直线的回归系数为r=-0.9819。见图1。
图1 SIgA测定标准曲线
, 百拇医药
2.2 唾液SIgA含量测定
将收集到的唾液标本在冰浴中用超声处理，以1500r/min离心10min，取出稀释5 倍，按AHL-HRP夹心法测定，根据标准曲线回归方程及其稀释倍数求出各份标本的SIgA含量，本法测定的正常人唾液SIgA含量为(509.15±296.75)mg/L。
2.3 精密度
2.3.1 批内误差：5份标本在同批内各做4次测定，其批内平均变异系数为7.4%，见表1。
表1 AHL-HRP夹心法测唾液SIgA批内误差 标本号
SIgA含量(ρB/mg.L-1)
±S
, http://www.100md.com
CV(%)
1
184.8
218.4
168
192.3
190.08±18.16
9.5
2
571.2
554.4
621.6
672
, http://www.100md.com
604.80±46.01
7.6
3
627.6
806.4
705.6
722.4
715.50±63.51
8.9
4
113.4
119.7
106.5
, http://www.100md.com
115.5
113.78±4.78
4.2
5
495.6
420.8
470.4
423.6
452.60±31.69
7.0
2.3.2 批间误差：将5份标本每份都分4批进行测定，批间平均变异系数为10.56%，见表2。表2 AHL-HRP夹心法测唾液SIgA批间误差 标本号
, http://www.100md.com
SIgA含量(ρB/mg.L-1)±S
CV(%)
1
184.8
225.6
192.3
228.0
207.68±19.33
9.3
2
756.0
, 百拇医药
806.4
921.0
924.0
851.85± 72.87
8.6
3
453.6
504.0
453.6
360.0
442.80±52.04
11.75
, 百拇医药 4
117. 6
134.4
109.2
102.1
115.83±12.05
10.4
5
260.4
286.4
235.2
201.6
245.90±31.33
, 百拇医药
12.74
2.3 准确性：在样品中加入已知量的SIgA，测定其结果，并计算回收率。见表3。表3 AHL-HRP夹心法测唾液SIgA回收试验 标本号
标本SIg含量
(ρB/mg.L-1)
加入SIgA量
(m/mg)
回收SIgA量
(ρB/mg.L-1)
回收率
(%)
, 百拇医药
1
102.9
10
105.2
93
2
235.2
20
240.4
102
3
260.4
30
, 百拇医药
273
94
4
277.2
40
285.5
90
5
252
50
276.8
92
3 讨 论
, http://www.100md.com
SIgA主要存在于外分泌液中，外分泌液中SIgA含量平均占其总IgA 70%，在唾液中达90%[4]。SIgA含有SIgA1和SIgA2，SIgA1主要含有O-连接糖链，SIgA2则仅含有N-连接糖链。国外资料报道[5，6]木菠萝凝集素(Jacalin)结合唾液的分泌成分主要是SIgA1，而不与其他游离的分泌成分结合，据此Cullina M.J等人建立了酶联免疫分析法测唾液SIgA1，Jacalin主要与SIgA1绞链区中的O-连接半乳糖寡糖链结合，SIgA 2因仅含有N-连接糖链而不被Jacalin结合[7]。SIgA2和唾液其他游离分泌成分不被Jacalin结合证明了凝集素结合糖蛋白的专一性。我室周德义等对桂木属植物(包括木菠萝、红桂木、白桂木)凝集素的系统研究表明，这三种凝集素有非常相似的生物学性质及理化特性[8，9]。根据我们对AHL糖结合特性的研究发现，AHL存在有O-糖苷键结合位点，也存在N-糖苷键结合位点。因此，能结合SIgA1和SIgA2。对AHL结合蛋白的免疫扩散及SDS-PAGE等实验证明唾液AHL结合蛋白主要是SIgA。(另文报道)，因此，建立AHL-HRP夹心法测定唾液SIgA是可行的。
, 百拇医药
本法采用AHL作为包被物，并将AHL制备为HRP酶联复合物夹心检测唾液中的SIgA， 获得较好结果。其线性测定范围较大，为5～337mg/L，有较好的准确性及精密度，回收率平均为94%，批内变异系数7.4%，批间平均变异系数为10.56%。所测正常人唾液SIgA含量(509.15±296.75)mg/L与扬镜明等人[10]用放射免疫双抗体法测定的正常人唾液SIgA含量基本一致。我们已用本法对一些临床病人唾液SIgA进行含量测定，资料将另行报道。
用酶标桂木凝集素检测SIgA比常规的抗原抗体免疫测定法具有特定的优势，因前者不必制备抗体，且来源方便经济。AHL纯化得率高，性质稳定，冻干粉于-20℃贮存二年凝集红细胞活力未见下降，将AHL制备为AHL-HRP后，保存于-20℃， 其活性仍至少可稳定半年以上。本法操作简单，结果准确，重现性较好，对临床疾病SIgA含量的测定，具有推广应用的实用价值。
参与文献
, 百拇医药
1 杨永清，陈汉平.SIgA的基础和临床研究进展.上海免疫学杂志，1991,11(3) :176～179
2 郭春祥，郭锡琼.介绍一种简单、快速、高效的辣根过氧化物酶标记抗体的过碘酸钠法.上海免疫学杂志，1983,3(2)：97
3 蒋成诠编著.酶免疫测定法.北京：人民卫生出版社.1984.71
4 杨永清，蒋冰冰，赵粹芙，等.唾液SIgA的超速离心测定方法.上海免疫学杂志，1991,11(6)：371～373
5 Kondoh H, Kobayashi K, Hagiwara K，et al. Jacalin, a jackfruit lectin,Precipitates lgA1 but not IgA2 subclass on gel diffusion reaction. J lmmunolMethods 1986; 88:171～173
, 百拇医药
6 Cullina MJ ， Greally JF.A novel lectin-based enzyme-linked immunosorbent assay for the measurement of IgA1 in serum and secretory IgA1 in secretions. Clinica chimica Acta 1993 216(1-2):23～28
7 Gregory RL，Rundegren J，Arnold RR.Separation of human IgA1 and IgA2 using Jacalin-agarose chromatography.J lmmunol Methods,1987,99:101～106
8 邓勇，周德义，关祺芳，等.红桂木、白桂木和木菠萝凝集素生物学性质的比较分析.广西医科大学学报，1995，12(2):183～185
9 周德义，杨尔滨、邓勇，等.白桂木凝集素的纯化与性质研究，生物化学与生物物理学报，1995，27(1):61～66
10 杨镜明，杨淑蓉，任梅玉.急性白血病患者尿、唾液SIgA的变化.上海免疫学杂志，1992,12(2)：96
收稿日期：1999-01-12, 百拇医药
单位：广西医科大学生物化学教研室 南宁 530021
关键词：白桂木凝集素(AHL)；SIgA；夹心酶联法
广西医科大学学报990512
摘要 目的：建立白桂木凝集素-HRP夹心法检测唾液中分泌型IgA(SIgA)。方法：制备AHL-HRP作为酶标凝集素，AHL为包被物，确定最适包被浓度及AHL-HRP工作稀释度，夹心酶联检测SIgA，进行检出限、精密度、准确性等实验并制备标准曲线，初步测定 71 例正常人唾液SIgA含量。结果：AHL-HRP夹心法检测SIgA标准曲线线性检测范围5～337mg/L。 本法测定71例健康人唾液SIgA含量为( 509.15±296.75 )mg/L。其中5份标本批内平均变异7.4% ，批间变异10.56%，回收率平均94%。结论：AHL-HRP夹心法测定SIgA的作用模式为 AHL→SIgA→AHL-HRP，可用于唾液中的SIgA含量的测定。方法简便、准确、便于推广。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R392-33
DETERMINING SIgA IN SALIVA BY SANDWICH ENZYME-LINKED ASSAY WITH AHL-HRP
Zhu Qifang，Wu Yaosheng，Deng yong，et al
(Department of Biochemistry, Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective：AHL- HRP Sandwich assay was developed for the measurement of SIgA.Methods：AHL- HRP was prepared, and optimum concentration of the coating AHL and working dilution degree of AHL-HRP was determined for the measure-ment of SIgA with Sandwich enzyme-linked assay.The working rang of the standard curves,precision and accuracy was performed.The standard curves were prepared for SIgA.Results：The working range of the standard curves were 5～337mg/L for SIgA respectively. The value of SIgA in the saliva of 71 healthy persons was(509.15±296. 75) mg/L with the assay.Intra-assay cv 7.4%. Inter-assay cv 10.56%. Reclamation was 94%.Conclusion：The sandwich enzyme-linked assay with AHL-HRP is simple and precise,and be used in wide range.
, 百拇医药
Key word AHL; SIgA;sandwich enzyme-linked assay
分泌型IgA(SIgA)广泛存在于乳汁、唾液、泪液、尿液、生殖系分泌液、呼吸道分泌液、胃肠液中，是人体粘膜免疫的主要抗体。现知一些感染性疾病、免疫缺陷病、泌尿生殖系疾病及一些肿瘤均同SIgA质和量改变有关[1]，为此寻找一种能准确定量， 反映外分泌液中SIgA改变情况的检测方法具有重要的临床意义。测定SIgA的方法有多种，在临床应用中各有其局限性，本文首次报道一种采用酶标白桂木凝集素检测SIgA的酶联夹心法。我们利用白桂木凝集素(Artocarpus hypargyreus Lectin，AHL)能与SIgA特异结合的性质，制备AHL-HRP，建立了AHL-HRP夹心法检测唾液SIgA。探讨 AHL- HRP 夹心法检测唾液SIgA的条件及其在临床应用的可能性。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 材料
1.1.1 主要试剂：AHL、SIgA(均为本室提供)；HRP(上海丽珠东风生物技术有限公司产)；底物TMB，A、B液、终止液(华美生物公司产)。
1.1.2 主要仪器：MODELΣ960酶标仪(台湾产)；96孔酶标板。
1.1.3 健康人唾液由本校健康大学生提供。
1.2 方法
1.2.1 SIgA标准的制备：将提纯的AHL制备AHL-Sepharose4B，用于初乳的亲和层析， 收集AHL结合蛋白，经SDS-PAGE鉴定，用酚试剂法定蛋白。
1.2.2 AHL-HRP的制备：按郭春祥的HRP标记抗体的过碘酸钠法[2]稍加改进，其酶结合物中HRP浓度按蒋成诠法[3]计算。加甘油至50%分装后于-20℃贮存备用。 AHL-HRP用PBS-吐温以1/2500稀释应用。
, 百拇医药
1.2.3 夹心法检测SIgA：AHL包被浓度为5mg/L，100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-吐温洗板3次，加入已稀释至一定浓度的待测物100μl/孔，37℃30min，同上洗板，加AHL-HRP，37℃30min，洗板后加底物TMB A、B液各1滴，混匀，37℃10min后加终止液1滴，混匀后测A450。每次同时设空白及阴性对照。
2 结 果
2.1 SIgA测定标准曲线
将SIgA倍比稀释后按夹心法测定，A450作纵座标，稀释滴度倒数对数为横座标制备标准曲线。SIgA的线性检测范围为5～377mg/L。 直线的回归系数为r=-0.9819。见图1。
图1 SIgA测定标准曲线
, 百拇医药
2.2 唾液SIgA含量测定
将收集到的唾液标本在冰浴中用超声处理，以1500r/min离心10min，取出稀释5 倍，按AHL-HRP夹心法测定，根据标准曲线回归方程及其稀释倍数求出各份标本的SIgA含量，本法测定的正常人唾液SIgA含量为(509.15±296.75)mg/L。
2.3 精密度
2.3.1 批内误差：5份标本在同批内各做4次测定，其批内平均变异系数为7.4%，见表1。
表1 AHL-HRP夹心法测唾液SIgA批内误差 标本号
SIgA含量(ρB/mg.L-1)
±S, http://www.100md.com
CV(%)
1
184.8
218.4
168
192.3
190.08±18.16
9.5
2
571.2
554.4
621.6
672
, http://www.100md.com
604.80±46.01
7.6
3
627.6
806.4
705.6
722.4
715.50±63.51
8.9
4
113.4
119.7
106.5
, http://www.100md.com
115.5
113.78±4.78
4.2
5
495.6
420.8
470.4
423.6
452.60±31.69
7.0
2.3.2 批间误差：将5份标本每份都分4批进行测定，批间平均变异系数为10.56%，见表2。表2 AHL-HRP夹心法测唾液SIgA批间误差 标本号
, http://www.100md.com
SIgA含量(ρB/mg.L-1)
±SCV(%)
1
184.8
225.6
192.3
228.0
207.68±19.33
9.3
2
756.0
, 百拇医药
806.4
921.0
924.0
851.85± 72.87
8.6
3
453.6
504.0
453.6
360.0
442.80±52.04
11.75
, 百拇医药 4
117. 6
134.4
109.2
102.1
115.83±12.05
10.4
5
260.4
286.4
235.2
201.6
245.90±31.33
, 百拇医药
12.74
2.3 准确性：在样品中加入已知量的SIgA，测定其结果，并计算回收率。见表3。表3 AHL-HRP夹心法测唾液SIgA回收试验 标本号
标本SIg含量
(ρB/mg.L-1)
加入SIgA量
(m/mg)
回收SIgA量
(ρB/mg.L-1)
回收率
(%)
, 百拇医药
1
102.9
10
105.2
93
2
235.2
20
240.4
102
3
260.4
30
, 百拇医药
273
94
4
277.2
40
285.5
90
5
252
50
276.8
92
3 讨 论
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SIgA主要存在于外分泌液中，外分泌液中SIgA含量平均占其总IgA 70%，在唾液中达90%[4]。SIgA含有SIgA1和SIgA2，SIgA1主要含有O-连接糖链，SIgA2则仅含有N-连接糖链。国外资料报道[5，6]木菠萝凝集素(Jacalin)结合唾液的分泌成分主要是SIgA1，而不与其他游离的分泌成分结合，据此Cullina M.J等人建立了酶联免疫分析法测唾液SIgA1，Jacalin主要与SIgA1绞链区中的O-连接半乳糖寡糖链结合，SIgA 2因仅含有N-连接糖链而不被Jacalin结合[7]。SIgA2和唾液其他游离分泌成分不被Jacalin结合证明了凝集素结合糖蛋白的专一性。我室周德义等对桂木属植物(包括木菠萝、红桂木、白桂木)凝集素的系统研究表明，这三种凝集素有非常相似的生物学性质及理化特性[8，9]。根据我们对AHL糖结合特性的研究发现，AHL存在有O-糖苷键结合位点，也存在N-糖苷键结合位点。因此，能结合SIgA1和SIgA2。对AHL结合蛋白的免疫扩散及SDS-PAGE等实验证明唾液AHL结合蛋白主要是SIgA。(另文报道)，因此，建立AHL-HRP夹心法测定唾液SIgA是可行的。
, 百拇医药
本法采用AHL作为包被物，并将AHL制备为HRP酶联复合物夹心检测唾液中的SIgA， 获得较好结果。其线性测定范围较大，为5～337mg/L，有较好的准确性及精密度，回收率平均为94%，批内变异系数7.4%，批间平均变异系数为10.56%。所测正常人唾液SIgA含量(509.15±296.75)mg/L与扬镜明等人[10]用放射免疫双抗体法测定的正常人唾液SIgA含量基本一致。我们已用本法对一些临床病人唾液SIgA进行含量测定，资料将另行报道。
用酶标桂木凝集素检测SIgA比常规的抗原抗体免疫测定法具有特定的优势，因前者不必制备抗体，且来源方便经济。AHL纯化得率高，性质稳定，冻干粉于-20℃贮存二年凝集红细胞活力未见下降，将AHL制备为AHL-HRP后，保存于-20℃， 其活性仍至少可稳定半年以上。本法操作简单，结果准确，重现性较好，对临床疾病SIgA含量的测定，具有推广应用的实用价值。
参与文献
, 百拇医药
1 杨永清，陈汉平.SIgA的基础和临床研究进展.上海免疫学杂志，1991,11(3) :176～179
2 郭春祥，郭锡琼.介绍一种简单、快速、高效的辣根过氧化物酶标记抗体的过碘酸钠法.上海免疫学杂志，1983,3(2)：97
3 蒋成诠编著.酶免疫测定法.北京：人民卫生出版社.1984.71
4 杨永清，蒋冰冰，赵粹芙，等.唾液SIgA的超速离心测定方法.上海免疫学杂志，1991,11(6)：371～373
5 Kondoh H, Kobayashi K, Hagiwara K，et al. Jacalin, a jackfruit lectin,Precipitates lgA1 but not IgA2 subclass on gel diffusion reaction. J lmmunolMethods 1986; 88:171～173
, 百拇医药
6 Cullina MJ ， Greally JF.A novel lectin-based enzyme-linked immunosorbent assay for the measurement of IgA1 in serum and secretory IgA1 in secretions. Clinica chimica Acta 1993 216(1-2):23～28
7 Gregory RL，Rundegren J，Arnold RR.Separation of human IgA1 and IgA2 using Jacalin-agarose chromatography.J lmmunol Methods,1987,99:101～106
8 邓勇，周德义，关祺芳，等.红桂木、白桂木和木菠萝凝集素生物学性质的比较分析.广西医科大学学报，1995，12(2):183～185
9 周德义，杨尔滨、邓勇，等.白桂木凝集素的纯化与性质研究，生物化学与生物物理学报，1995，27(1):61～66
10 杨镜明，杨淑蓉，任梅玉.急性白血病患者尿、唾液SIgA的变化.上海免疫学杂志，1992,12(2)：96
收稿日期：1999-01-12, 百拇医药