原发性肝癌及慢性肝脏病变端粒酶活性的研究
作者：吴珊 刘宗石 李晓明 WY Lau CK leow 吴秉铨 李川军
单位：香港中文大学病理解剖和细胞学系[吴珊(130021 长春，白求恩医科大学病理学教研室)、刘宗石、李晓明、李川军]；外科学系(WY Lau、CK Leow)；北京医科大学病理学系(吴秉铨)
关键词：肝肿瘤；端粒；染色体；甲胎蛋白类
摘要 目的 摘要 目的：探讨荧光原位杂交(FISH)方法在细胞分子水平对Down综合征临床诊断意义。方法：采用Down综合征核心区(DSCR)Cosmid DNA探针做为检测Down综合征的特异性探针，此探针来源于21号染色体特异性KU21D文库，载体6.7 kb，插入顺序35 kb，定位于21q22.2。对48例Down综合征患者外周血淋巴细胞分别在经过细胞培养和不经细胞培养两种处理条件下同时进行FISH检测。结果：在中期染色体和间期细胞核中观察到3个杂交点，杂交率均为81%～95%。结论：DSCR Cosmid DNA探针可直接在未经培养的淋巴细胞间期核中进行FISH检测，对Down综合征做出快速、准确的基因诊断。
, 百拇医药
Diagnosis of Down Syndrome by Down Syndrome Cristical Region Cosmid DNA Probe
Jin Chunlian, Li Fucai, Zhang Li, et al
Department of Medical Genetics, College of Basic Medical Sciences, China Medical University, Shenyang, 110001
ABSTRACT Objective: This study was designed to explore the diagnosis on Down syndrome by fluorescence in situ hybridization (FISH). Methods: We detected trisomy 21 with Down syndrome cristical region cosmid DNA probe, which comes from specific KU21D library of chromosome 21 (carrier is 6.7 kb, insert sequence is 35 kb) and is located in 21q22.2. 48 cases of trisomy 21 were detected on cultured and uncultured lymphoblastoid cell by FISH. Results: There were three hybridization points in interphase nuclei and three hybridization signals on metaphase three chromosome 21. Hybridization rate was 81%～95%. Conclusion: Trisomy 21 could be diagnosed rapidly and accurately by DSCR Cosmid DNA probe in uncultured lymphoblastoid interphase unclei of patients.
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KEY WORDS Down syndrome; fluorescence in situ hybridization; DSCR cosmid DNA probe
Down综合征(先天愚型、21三体)为一种最常见染色体病，以先天性智力低下为主要症状。患儿呈特殊面容：脸圆,鼻扁平，睑裂细且向外上倾斜，眼距过宽，舌大常外伸。其发病率在1/700～1/800之间,由于21三体或易位引起21q22-ter部分三体所致。目前临床所用的染色体常规显带技术能对绝大多数患者进行诊断，但所需周期长，并且对微小的或复杂的畸变不易做出准确的诊断[1]。80年代后期建立的荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术利用13、21号染色体着丝粒探针和21号染色体的特异性探针在中期的染色体上和间期的核中杂交，经检测都可观察到一个独立的杂交信号[2，3]，能对21号染色体数目及结构畸变做出快速、准确的评价。但FISH分析的可靠性很大程度上依赖于探针的特异性和杂交率[4]，我们利用Down综合
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征核心区(Down syndrome critical region, DSCR)Cosmid DNA探针对48例Down综合征患者(1例 21/21易位，1例 15/21易位，1例 14/21易位，45例三体型)和2例正常人进行荧光原位杂交，探讨其探针临床应用的意义及价值。
1 材料与方法
1.1 材料 48例Down综合征患者外周血由中国医科大学第一、第二临床学院遗传室提供，其中男20例，女26例，年龄为2个月～8岁。
1.2 实验方法
1.2.1 染色体标本制备：48例Down综合征患者和2例正常人同时分别按下面二种方法制备染色体标本。(1)常规外周血淋巴细胞培养：1ml PBL加入到10ml含15%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37℃培养70 h，加入秋水仙素(30ng/ml)，继续培养2～3h，然后收获细胞，离心，弃上清液；加入约8 ml低渗液(KCl 0.075mol/L)低渗处理25min，离心，弃上清液，加入5～6ml固定液(甲醇3∶冰醋酸1)固定20min，反复固定2次，离心，弃上清液，加入适量的固定液制成细胞悬液，制片。标本置54℃烤箱1～2 h，自然冷却后-70℃保存待用。(2)外周血不经培养直接制片：1ml PBL 加入约8 ml低渗液(KCl 0.075mol/L)低渗处理25min，离心、固定、制片等过程同上。
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1.2.2 探针及其标记：
来源于21号染色体特异KU21D文库(日本庆应大学提供)，载体6.7 kb，插入顺序35 kb，定位于21q22.2[6]。应用Digxingenin-11-dUTP掺入，经缺口平移(nick translation)法标记探针[6]。反应体积50μl(探针DNA 250ng,DNA PoL I 2U,DNAaseI 2ng，digxingenin-11-dUTP 20 μm，dATP、dCTP、dGTP各20μm)，16℃ 90min后乙醇沉淀→干燥→加30μl杂交液(50ng/μl)，标记后的探针长度约200～500 bp。
1.2.3 原位杂交：标本置变性液(70%去离子甲酰胺/2×SSC)中，70℃～72℃处理2min，冷乙醇(70%→90%→100%)中系列脱水，探针混合液(探针2μl，杂交液6μl，基因组DNA 1μl(20ng)，BSA 1μl(20mg/ml)75℃变性10min，然后滴加于染色体标本上，用18mm×18mm盖玻片覆盖，置保温盒37℃孵育12 h。杂交之后去掉盖玻片，标本于50%甲酰胺/2×SSC混合液42℃洗2次各5min，2×SSC 42℃洗2次各5min，再于4×SSC室温洗脱2次，各5min，采用anti-digxingenin-fluorescence (0.2ng/μl)进行检测，滴于标本片上，于保温暗盒中孵育40 min，然后于4×SSC/0.05 Triton和4×SSC中漂洗2次，每次5min，碘化丙啶(PI)染色3～5min，加抗荧光淬灭剂后封片。
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2 结果
待测标本置荧光显微镜下观察，杂交信号呈橙黄色亮点。
2.1 经淋巴细胞培养的标本 Down综合征患者在中期核型中呈现3个杂交斑点(图1)，中期染色体中杂交率为80%～90%(计数100个分裂相)。在间期含有3个杂交斑点的细胞占83%～95%(计数100个细胞核)。正常人在中期核型中和间期细胞核中均呈现 2个杂交斑点。
2.2 未经细胞培养的标本 Down综合征患者在间期细胞核可呈现3个杂交点(图2)，杂交率也为81%～95%。正常人则呈现2个杂交点。
结果表明，经细胞培养与不经细胞培养制备的标本杂交率基本一致，为81%～95%。
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图1 Down综合征经淋巴细胞培养中期染色体核型(含3个杂交信号)
图2 Down综合征未经培养间期细胞核(含3个杂交信号)
48例Down综合征患者，经常规染色体G显带分析与FISH结果一致。
3 讨论
荧光原位杂交是应用非放射性物质(biotion或digoxigenine)标记探针，使其与固定的染色体标本进行特异性杂交，经偶联荧光素的相应抗体系统放大杂交信号，能在细胞分子水平对中期染色体数目和结构畸变及间期核做出准确的检测。据此原理，这一技术可对Down综合征进行基因诊断。据报道，对21号染色体在间期的分析似乎比其他染色体更困难，主要原因是没有特别适用特异的21号染色体探针[4]。近年来人们制备了若干种21号染色体特异性探针，如13号和21号染色体着丝粒探针及DSCR探针等，用13号和21号染色体着丝粒探针对Down综合征进行FISH检测，在外周血淋巴细胞间期和有丝分裂中期，能观察到5个杂交信号(13号染色体显示一对信号，21号染色体显示3个信号)，但在间期细胞核中多数情况下21号染色体有一个信号弱或不显示而逃避检测[5]。因此，此探针不是十分合适的探针。
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本实验所采用的DSCR Cosmid DNA探针其特异性强，来源于21号染色体特异性KU21D文库，载体为6.7 kb，插入顺序35 kb，定位于21q22.2，恰位于DSCR[6]。细胞遗传学研究证明，Down综合征异常体征的产生主要是由于21q22.1和21q22.2的异常复制所致[7]。21q22区对产生典型的Down综合征面部特征是非常重要的，缺乏21q22的21号染色体部分三体则不表现Down综合征典型特征，所以现认为21q22.2与Down综合征密切相关，并称为Down综合征核心区(DSCR)。
实验证明，DSCR Cosmid DNA探针在正常二倍体中期核型中二条21号染色体长臂各显示一个或一对杂交斑点，而在21三体细胞株间期细胞核和中期染色体上各显示3个杂交斑点，并且此探针在正常二倍体和21三体间期核和中期染色体上分布达95%，有高度特异性，除21号染色体外其它染色体上无同源顺序，是检测21号染色体特异性探针[8]。
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我室使用DSCR Cosmid DNA探针对48例Down综合征患者和2例正常人分别在经外周血淋巴细胞培养和未经细胞培养二种方法处理的标本进行FISH检测，在间期细胞核中得到相同的杂交信号，其杂交率基本一致，为81%～95%。研究表明DSCR Cosmid DNA探针特异性强，杂交率高，而且通过间期细胞核检测可在2天内完成诊断，大大缩短实验周期。故可对Down综合征在细胞分子水平做出快速、准确的诊断。但在Down综合征中嵌合型(即46/47+21)约占有1%～2%，如果三体细胞很少，则容易漏诊。为了避免产生假阳性和假阴性，临床确诊需加大分析细胞数目，Julien认为要确诊需计数200个细胞内的杂交信号[9]。
辽宁省科委资助项目 96802002
参考文献
1 王明荣，王秀琴，吴旻，等.应用荧光原位杂交技术测定不同的染色体畸变.中华医学遗传学杂志，1996，13(2)：108—109
, 百拇医药
2 Lichet P, Cremer T, Borden J, et al. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries. Hum Genet, 1988,80(3):224—226
3 Klinger K, Landes G, Shook D, et al. Rapid detection of chromosome aneuploidies in uncultured amniocytes by using fluorescence in situ hybridization (FISH). Am J Hum Genet, 1992,51(1):55—58
4 Zheng YL, Ferguson-Smith MA, Warner JP, et al. Analysis of chromosome 21 copy number in uncultured amniocytes by fluorescence in situ hybridization using a cosmid contig. Prenatal Diagnosis, 1992,12:931—943
, 百拇医药
5 Bossuyt PJ, Van Tienen M-N, De Gruyter L, et al. Incidence of low-fluorescence a satellite region on chromosome 21 escaping detection of aneuploidy at interphase by FISH. Cytogent Cell Genet, 1995,68:203—206
6 李福才，孙开来,N Shimizu. 21号染色体特异性柯斯质粒DNA克隆区域定位.中华医学遗传学杂志，1996，13(6)：329—332
7 Korenberg J R. Molecular definifion of a region of chromosome 21 the canses feafures of the Down syndrome phenotype. Am J Hum Genet, 1990,47:236—239
8 李福才，孙开来.Down综合征核心区Cosmid克隆探针在人二倍体21—三体间期核和中期染色体上分布.中国的医学生物学研究.成都：四川科学技术出版社，1995，210—213
9 Julien C, Bazin A, Gugot B, et al. Rapid prenatal diagnosis Down's syndrome with in situ hybridization of fluorescent DNA probes. Lancet, 1986,2(8611-8622):863—864
1998-08-31收稿, 百拇医药
单位：香港中文大学病理解剖和细胞学系[吴珊(130021 长春，白求恩医科大学病理学教研室)、刘宗石、李晓明、李川军]；外科学系(WY Lau、CK Leow)；北京医科大学病理学系(吴秉铨)
关键词：肝肿瘤；端粒；染色体；甲胎蛋白类
摘要 目的 摘要 目的：探讨荧光原位杂交(FISH)方法在细胞分子水平对Down综合征临床诊断意义。方法：采用Down综合征核心区(DSCR)Cosmid DNA探针做为检测Down综合征的特异性探针，此探针来源于21号染色体特异性KU21D文库，载体6.7 kb，插入顺序35 kb，定位于21q22.2。对48例Down综合征患者外周血淋巴细胞分别在经过细胞培养和不经细胞培养两种处理条件下同时进行FISH检测。结果：在中期染色体和间期细胞核中观察到3个杂交点，杂交率均为81%～95%。结论：DSCR Cosmid DNA探针可直接在未经培养的淋巴细胞间期核中进行FISH检测，对Down综合征做出快速、准确的基因诊断。
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Diagnosis of Down Syndrome by Down Syndrome Cristical Region Cosmid DNA Probe
Jin Chunlian, Li Fucai, Zhang Li, et al
Department of Medical Genetics, College of Basic Medical Sciences, China Medical University, Shenyang, 110001
ABSTRACT Objective: This study was designed to explore the diagnosis on Down syndrome by fluorescence in situ hybridization (FISH). Methods: We detected trisomy 21 with Down syndrome cristical region cosmid DNA probe, which comes from specific KU21D library of chromosome 21 (carrier is 6.7 kb, insert sequence is 35 kb) and is located in 21q22.2. 48 cases of trisomy 21 were detected on cultured and uncultured lymphoblastoid cell by FISH. Results: There were three hybridization points in interphase nuclei and three hybridization signals on metaphase three chromosome 21. Hybridization rate was 81%～95%. Conclusion: Trisomy 21 could be diagnosed rapidly and accurately by DSCR Cosmid DNA probe in uncultured lymphoblastoid interphase unclei of patients.
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KEY WORDS Down syndrome; fluorescence in situ hybridization; DSCR cosmid DNA probe
Down综合征(先天愚型、21三体)为一种最常见染色体病，以先天性智力低下为主要症状。患儿呈特殊面容：脸圆,鼻扁平，睑裂细且向外上倾斜，眼距过宽，舌大常外伸。其发病率在1/700～1/800之间,由于21三体或易位引起21q22-ter部分三体所致。目前临床所用的染色体常规显带技术能对绝大多数患者进行诊断，但所需周期长，并且对微小的或复杂的畸变不易做出准确的诊断[1]。80年代后期建立的荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术利用13、21号染色体着丝粒探针和21号染色体的特异性探针在中期的染色体上和间期的核中杂交，经检测都可观察到一个独立的杂交信号[2，3]，能对21号染色体数目及结构畸变做出快速、准确的评价。但FISH分析的可靠性很大程度上依赖于探针的特异性和杂交率[4]，我们利用Down综合
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征核心区(Down syndrome critical region, DSCR)Cosmid DNA探针对48例Down综合征患者(1例 21/21易位，1例 15/21易位，1例 14/21易位，45例三体型)和2例正常人进行荧光原位杂交，探讨其探针临床应用的意义及价值。
1 材料与方法
1.1 材料 48例Down综合征患者外周血由中国医科大学第一、第二临床学院遗传室提供，其中男20例，女26例，年龄为2个月～8岁。
1.2 实验方法
1.2.1 染色体标本制备：48例Down综合征患者和2例正常人同时分别按下面二种方法制备染色体标本。(1)常规外周血淋巴细胞培养：1ml PBL加入到10ml含15%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37℃培养70 h，加入秋水仙素(30ng/ml)，继续培养2～3h，然后收获细胞，离心，弃上清液；加入约8 ml低渗液(KCl 0.075mol/L)低渗处理25min，离心，弃上清液，加入5～6ml固定液(甲醇3∶冰醋酸1)固定20min，反复固定2次，离心，弃上清液，加入适量的固定液制成细胞悬液，制片。标本置54℃烤箱1～2 h，自然冷却后-70℃保存待用。(2)外周血不经培养直接制片：1ml PBL 加入约8 ml低渗液(KCl 0.075mol/L)低渗处理25min，离心、固定、制片等过程同上。
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1.2.2 探针及其标记：
来源于21号染色体特异KU21D文库(日本庆应大学提供)，载体6.7 kb，插入顺序35 kb，定位于21q22.2[6]。应用Digxingenin-11-dUTP掺入，经缺口平移(nick translation)法标记探针[6]。反应体积50μl(探针DNA 250ng,DNA PoL I 2U,DNAaseI 2ng，digxingenin-11-dUTP 20 μm，dATP、dCTP、dGTP各20μm)，16℃ 90min后乙醇沉淀→干燥→加30μl杂交液(50ng/μl)，标记后的探针长度约200～500 bp。
1.2.3 原位杂交：标本置变性液(70%去离子甲酰胺/2×SSC)中，70℃～72℃处理2min，冷乙醇(70%→90%→100%)中系列脱水，探针混合液(探针2μl，杂交液6μl，基因组DNA 1μl(20ng)，BSA 1μl(20mg/ml)75℃变性10min，然后滴加于染色体标本上，用18mm×18mm盖玻片覆盖，置保温盒37℃孵育12 h。杂交之后去掉盖玻片，标本于50%甲酰胺/2×SSC混合液42℃洗2次各5min，2×SSC 42℃洗2次各5min，再于4×SSC室温洗脱2次，各5min，采用anti-digxingenin-fluorescence (0.2ng/μl)进行检测，滴于标本片上，于保温暗盒中孵育40 min，然后于4×SSC/0.05 Triton和4×SSC中漂洗2次，每次5min，碘化丙啶(PI)染色3～5min，加抗荧光淬灭剂后封片。
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2 结果
待测标本置荧光显微镜下观察，杂交信号呈橙黄色亮点。
2.1 经淋巴细胞培养的标本 Down综合征患者在中期核型中呈现3个杂交斑点(图1)，中期染色体中杂交率为80%～90%(计数100个分裂相)。在间期含有3个杂交斑点的细胞占83%～95%(计数100个细胞核)。正常人在中期核型中和间期细胞核中均呈现 2个杂交斑点。
2.2 未经细胞培养的标本 Down综合征患者在间期细胞核可呈现3个杂交点(图2)，杂交率也为81%～95%。正常人则呈现2个杂交点。
结果表明，经细胞培养与不经细胞培养制备的标本杂交率基本一致，为81%～95%。
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图1 Down综合征经淋巴细胞培养中期染色体核型(含3个杂交信号)
图2 Down综合征未经培养间期细胞核(含3个杂交信号)
48例Down综合征患者，经常规染色体G显带分析与FISH结果一致。
3 讨论
荧光原位杂交是应用非放射性物质(biotion或digoxigenine)标记探针，使其与固定的染色体标本进行特异性杂交，经偶联荧光素的相应抗体系统放大杂交信号，能在细胞分子水平对中期染色体数目和结构畸变及间期核做出准确的检测。据此原理，这一技术可对Down综合征进行基因诊断。据报道，对21号染色体在间期的分析似乎比其他染色体更困难，主要原因是没有特别适用特异的21号染色体探针[4]。近年来人们制备了若干种21号染色体特异性探针，如13号和21号染色体着丝粒探针及DSCR探针等，用13号和21号染色体着丝粒探针对Down综合征进行FISH检测，在外周血淋巴细胞间期和有丝分裂中期，能观察到5个杂交信号(13号染色体显示一对信号，21号染色体显示3个信号)，但在间期细胞核中多数情况下21号染色体有一个信号弱或不显示而逃避检测[5]。因此，此探针不是十分合适的探针。
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本实验所采用的DSCR Cosmid DNA探针其特异性强，来源于21号染色体特异性KU21D文库，载体为6.7 kb，插入顺序35 kb，定位于21q22.2，恰位于DSCR[6]。细胞遗传学研究证明，Down综合征异常体征的产生主要是由于21q22.1和21q22.2的异常复制所致[7]。21q22区对产生典型的Down综合征面部特征是非常重要的，缺乏21q22的21号染色体部分三体则不表现Down综合征典型特征，所以现认为21q22.2与Down综合征密切相关，并称为Down综合征核心区(DSCR)。
实验证明，DSCR Cosmid DNA探针在正常二倍体中期核型中二条21号染色体长臂各显示一个或一对杂交斑点，而在21三体细胞株间期细胞核和中期染色体上各显示3个杂交斑点，并且此探针在正常二倍体和21三体间期核和中期染色体上分布达95%，有高度特异性，除21号染色体外其它染色体上无同源顺序，是检测21号染色体特异性探针[8]。
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辽宁省科委资助项目 96802002
参考文献
1 王明荣，王秀琴，吴旻，等.应用荧光原位杂交技术测定不同的染色体畸变.中华医学遗传学杂志，1996，13(2)：108—109
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2 Lichet P, Cremer T, Borden J, et al. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries. Hum Genet, 1988,80(3):224—226
3 Klinger K, Landes G, Shook D, et al. Rapid detection of chromosome aneuploidies in uncultured amniocytes by using fluorescence in situ hybridization (FISH). Am J Hum Genet, 1992,51(1):55—58
4 Zheng YL, Ferguson-Smith MA, Warner JP, et al. Analysis of chromosome 21 copy number in uncultured amniocytes by fluorescence in situ hybridization using a cosmid contig. Prenatal Diagnosis, 1992,12:931—943
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5 Bossuyt PJ, Van Tienen M-N, De Gruyter L, et al. Incidence of low-fluorescence a satellite region on chromosome 21 escaping detection of aneuploidy at interphase by FISH. Cytogent Cell Genet, 1995,68:203—206
6 李福才，孙开来,N Shimizu. 21号染色体特异性柯斯质粒DNA克隆区域定位.中华医学遗传学杂志，1996，13(6)：329—332
7 Korenberg J R. Molecular definifion of a region of chromosome 21 the canses feafures of the Down syndrome phenotype. Am J Hum Genet, 1990,47:236—239
8 李福才，孙开来.Down综合征核心区Cosmid克隆探针在人二倍体21—三体间期核和中期染色体上分布.中国的医学生物学研究.成都：四川科学技术出版社，1995，210—213
9 Julien C, Bazin A, Gugot B, et al. Rapid prenatal diagnosis Down's syndrome with in situ hybridization of fluorescent DNA probes. Lancet, 1986,2(8611-8622):863—864
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