阿片样肽在人胎儿胸腺组织的表达
作者：李柏青 居弘 李涤臣 承泽农 章可仪
单位：李柏青 居弘 蚌埠医学院微生物学教研室 233003；李涤臣 承泽农 章可仪 病理学教研室
关键词：胸腺；内啡肽类；脑啡肽类；胎儿
蚌埠医学院学报990501摘要 目的：探讨阿片样肽在人胎儿胸腺组织及其上皮细胞的表达。方法：用放射免疫测定药盒测定人胎儿胸腺组织匀浆提取物中β-内啡肽(β-EP)和亮氨酸脑啡肽(L-ENK)，同时用免疫组化方法检测胎儿胸腺组织冷冻切片和石蜡切片中的β-EP和L-ENK的表达。结果：人胎儿胸腺组织提取液中β-EP(12例)和L-ENK(11例)的含量(pg/100 mg湿重组织) 分别为550.89±195.11和1 028.44±632.78。比较胎龄<20周组和≥20周组的胸腺组织提取液中两种阿片样肽的含量差异均无显著性(P>0.05)。免疫组化检测发现，胸腺组织中β-EP和L-ENK阳性反应细胞的分布部位与角蛋白阳性反应细胞相一致，表明胸腺上皮细胞可表达这两种阿片样肽。结论：本研究结果表明，人胎儿胸腺组织在胎龄16～20周时即可表达β-EP和L-ENK，胸腺上皮细胞与产生这两种阿片样肽有关。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 322.53 R 971.9
Expression of opioid peptides in human fetal thymus
Li Baiqing,Ju Hong,Li Dichen，Cheng Zenong,Zhang Keyi
(Departments of Microbiology and Pathology,Bengbu Medical College,Anhui 233003)
Abstract Objective:To investigate expression of opioid peptides in human fetal thymus.Methods:By using radio immunoassay the concentrations of β-endorphin(β-EP) and leucine enkephalin(L-ENK) were evaluated in extracts of human fetal thymus and immunohistochemistry technique was used to detect the expression of two opioid peptides in fetal thymus sections.Results:The concentrations (pg/100 mg wet tissue) of β-EP(n=12) and L-ENK(n=11) in extracts of fetal human thymus were 550.89±195.11 and 1 028.44±632.78 respectively. In both concentrations of β-EP and L-ENK in thymus extracts there were no significant differences between groups of <20 week and ≥20 week fetus. Immunohistochemistry employed in fetal thymus sections revealed that most cells that were monoclonal antibodies positively reactive against to β-EP and L-ENK were consistent in location with the cells that reacted to keratin monoclonal antibody.Conclusions:This study demonstrated that opioid peptides β-EP and L-ENK in human fetal thymus expressed as earlier as in 16 to 20 week fetuses. The resources of two opioid peptides generated in fetal thymus were related to thymic epithelial cells.
, 百拇医药
Key words thymus;endorphins;enkephalins;fetal
内源性阿片样肽不仅在中枢和外周有镇痛、调节神经内分泌系统的作用，还有增强淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性的免疫调节作用〔1〕。研究证明，淋巴细胞表面有阿片样肽受体〔1〕。Savino 等〔2〕还发现，β-内啡肽(β-EP)和亮氨酸脑啡肽(L-ENK)能刺激胸腺上皮细胞分泌胸腺血清因子(thymulin)。另有研究报道，免疫细胞也可产生阿片样肽物质〔3〕。
胸腺是神经内分泌免疫调节网络中的关键性器官。笔者以前的工作证明,新生期小鼠去除胸腺后可阻碍神经内分泌系统的功能发育〔4〕,而甲状腺激素T3对胸腺上皮细胞分泌活性产物有促进作用〔5〕。Geenen等〔6〕以及笔者最近〔7〕的研究工作发现，人胎儿胸腺上皮细胞可表达神经垂体多肽激素。本文探讨阿片样肽在人胎儿胸腺组织以及胸腺上皮细胞中的表达。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本采集及处理 本研究所用的12例胎儿胸腺标本均取自健康孕妇的水囊引产胎儿，孕龄16～24周；其中，孕龄<20周的为5例，≥20周龄的为7例。胸腺在胎儿引产后以最快速度(4 h内)取出，分成3份后分别处理：(1)取约0.1 g的胸腺组织块，放入100℃生理盐水中煮沸3 min；用分析天平称得实际重量；放入含有1 mol/L冰醋酸0.5 ml的玻璃匀浆器中碾磨获得组织匀浆，用1 mol/L NaOH 0.5 ml中和；低温离心3 000 r/min，30 min；取上清液置-20℃保存。(2)取部分胸腺组织做冷冻切片5～6张，置-20℃保存。(3)剩余胸腺组织分别用副甲醛和10%福尔马林固定后，作常规石蜡切片。
1.2 阿片样肽的测定 胸腺组织提取液中β-EP和L-EK含量的测定用放射免疫测定药盒在上海第二军医大学神经生物学教研室完成。
1.3 免疫组化测定 胎儿胸腺组织的冷冻切片和常规石蜡切片用ABC法作免疫组化染色，所用的β-EP和L-ENK抗体均购自上海第二军医大学，有效工作浓度β-EP,1∶500;L-ENK,1∶300。另外，角蛋白(keratin)抗体购自DAKO公司。
, http://www.100md.com
1.4 统计学方法 采用t检验。
2 结果
2.1 人胎儿胸腺组织中阿片样肽的含量 12例胎儿胸腺组织提取液的β-EP含量(pg/100 mg湿重组织)(
±s)为550.89±195.11，范围在196.21～811.80；而11例胸腺组织提取液中的L-ENK的含量为1 028.44±632.78，范围在305.38～2 048.94。这两种阿片样肽含量在不同标本间的差异均较大。比较胎龄<20周组和≥20周组的胸腺组织提取液中的这两种阿片样肽的含量，差异均无显著性(P>0.05)(见表1)。
表1 不同胎龄胸腺组织中β-EP和L-ENK含量比较(±s,pg/100 mg湿重组织) 胎龄(周)
, 百拇医药
n
β-EP
L-ENK
<20
5
510.56±237.80
1 254.94±862.77
≥20
7
579.71±172.55
839.68±333.57△
t
, 百拇医药
—
0.59
1.02
P
—
>0.05
>0.05
△示t′值;n=6
2.2 胎儿胸腺上皮细胞表达阿片样肽 用免疫组化方法检测胎儿胸腺组织冷冻切片和石蜡切片，结果显示keratin阳性反应细胞多位于胸腺小体处，而对β-EP和L-ENK单抗呈阳性反应的细胞也多数分布在胸腺小体处。冷冻切片和福尔马林固定的常规切片同时作免疫组化对照，未见有明显差别。
3 讨论
, 百拇医药
在神经内分泌免疫调节网络中，神经内分泌系统产生的激素、神经肽以及神经递质可以调控免疫系统的功能。许多研究资料表明，内源性阿片样肽可能是精神、神经因素影响和调节免疫功能重要的效应物质。β-EP在体外能明显促进淋巴细胞的增殖反应和NK细胞的活性〔1〕，也有研究报道有抑制淋巴细胞功能活性〔1〕。Chiappelli等〔8〕认为这是由于β-EP可能同时影响淋巴细胞活化时磷脂肌醇代谢的几个方面，增强或抑制CD3-γ链的磷酸化，形成不同的效应。另一方面，免疫应答可以影响中枢阿片样肽的产生，王剑平等〔9〕发现大鼠在对绵羊红细胞刺激的抗体反应过程中，下丘脑和垂体的β-EP明显下降。近年来的研究表明，免疫细胞也可产生阿片样肽物质〔3〕。多种动物的胸腺组织中均可测出前阿黑皮素(POMC)来源的神经肽，包括β-EP。但在人类胸腺组织的研究资料较少。
Geenen等以及笔者最近的工作发现，胸腺上皮细胞可产生神经垂体的多肽激素〔6，7〕。本研究主要观察到人胎儿胸腺组织两种阿片样肽β-EP和L-ENK的表达，结果表明，胸腺在胎龄16周时即可产生β-EP和L-ENK，表达量与胎龄20周以后相同。笔者观察结果显示，L-ENK的表达比β-EP高。本研究用免疫组化方法发现胎儿胸腺组织也可出现胸腺小体，其中以角蛋白阳性细胞，即胸腺上皮细胞为主；在胎儿胸腺组织中与β-EP和L-ENK单抗起阳性反应的细胞也大多分布在胸腺小体处，这表明人胚胎期的胸腺上皮细胞也能表达β-EP和L-ENK。
, 百拇医药
胸腺上皮细胞产生的阿片样肽的生物学意义还有待阐明。胸腺来源的阿片样肽可能会影响中枢的神经内分泌活动，但在胸腺局部的作用似应更为重要。Savino等〔2〕用多种阿片样肽作用体外培养的胸腺上皮细胞，发现β-EP和L-ENK能增加胸腺上皮细胞分泌胸腺血清因子(thymulin)的水平，这就提示β-EP和L-ENK等阿片样肽不仅是神经内分泌系统与免疫系统相互作用的重要介导因素，也很可能是胸腺内分泌微环境中的重要因素之一，在T细胞的分化成熟过程中有重要作用。
国家自然科学基金资助课题(编号39170685)
参考文献
1 Wybran J.Enkephalins and endorphins as modifiers of the immune system:Present and future.Fed Proc，1985，44(1)∶92
, 百拇医药
2 Savino W,Gagnerault MC,Bach JF,et al.Neuroendocrine control of thymic hormonal production. II. Stimulatory effects of endogenous opioids on thymulin production by cultured human and murine thymic epithelial cells.Life Sci，1990，46(23)∶1 687
3 Jessop DS,Lightman SL,Chowdrey HS.Effects of a chronic inflammatory stress on levels of pro-opiomelanocortin-derived peptides in the rat spleen and thymus.J Neuroimmunol，1994,49(1,2)∶197
, 百拇医药 4 李柏青,杨贵贞.新生期去胸腺对神经内分泌系统的影响.白求恩医科大学学报,1989,15(5)∶442
5 李柏青,杨贵贞.小鼠胸腺上皮细胞培养上清的生物学活性.中华微生物学和免疫学杂志,1989,9(4)∶222
6 Geenen V,Legros JJ,Franchimont P.et al.Coexistence of oxytocin and neurophysin in the human thymus.Science,1986,232(4 749)∶508
7 李柏青，居 弘，李涤臣,等.神经垂体多肽激素在人胎儿胸腺组织的表达.蚌埠医学院学报，1999，24(4)∶221
8 Chiappelli F,Kavelaars A,Heijnen CJ，Beta-endorphin effects on membrane transduction in human lymphocytes.Ann NY Acad Sci,1992,650∶211
9 王剑平，叶天星，杨嗣坤.免疫应答中垂体及下丘脑β-内啡肽样免疫反应物质含量的动态变化.中国免疫学杂志,1989,6(1)∶29
〔收稿日期 1999-06-29〕, http://www.100md.com
单位：李柏青 居弘 蚌埠医学院微生物学教研室 233003；李涤臣 承泽农 章可仪 病理学教研室
关键词：胸腺；内啡肽类；脑啡肽类；胎儿
蚌埠医学院学报990501摘要 目的：探讨阿片样肽在人胎儿胸腺组织及其上皮细胞的表达。方法：用放射免疫测定药盒测定人胎儿胸腺组织匀浆提取物中β-内啡肽(β-EP)和亮氨酸脑啡肽(L-ENK)，同时用免疫组化方法检测胎儿胸腺组织冷冻切片和石蜡切片中的β-EP和L-ENK的表达。结果：人胎儿胸腺组织提取液中β-EP(12例)和L-ENK(11例)的含量(pg/100 mg湿重组织) 分别为550.89±195.11和1 028.44±632.78。比较胎龄<20周组和≥20周组的胸腺组织提取液中两种阿片样肽的含量差异均无显著性(P>0.05)。免疫组化检测发现，胸腺组织中β-EP和L-ENK阳性反应细胞的分布部位与角蛋白阳性反应细胞相一致，表明胸腺上皮细胞可表达这两种阿片样肽。结论：本研究结果表明，人胎儿胸腺组织在胎龄16～20周时即可表达β-EP和L-ENK，胸腺上皮细胞与产生这两种阿片样肽有关。
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中国图书资料分类法分类号 R 322.53 R 971.9
Expression of opioid peptides in human fetal thymus
Li Baiqing,Ju Hong,Li Dichen，Cheng Zenong,Zhang Keyi
(Departments of Microbiology and Pathology,Bengbu Medical College,Anhui 233003)
Abstract Objective:To investigate expression of opioid peptides in human fetal thymus.Methods:By using radio immunoassay the concentrations of β-endorphin(β-EP) and leucine enkephalin(L-ENK) were evaluated in extracts of human fetal thymus and immunohistochemistry technique was used to detect the expression of two opioid peptides in fetal thymus sections.Results:The concentrations (pg/100 mg wet tissue) of β-EP(n=12) and L-ENK(n=11) in extracts of fetal human thymus were 550.89±195.11 and 1 028.44±632.78 respectively. In both concentrations of β-EP and L-ENK in thymus extracts there were no significant differences between groups of <20 week and ≥20 week fetus. Immunohistochemistry employed in fetal thymus sections revealed that most cells that were monoclonal antibodies positively reactive against to β-EP and L-ENK were consistent in location with the cells that reacted to keratin monoclonal antibody.Conclusions:This study demonstrated that opioid peptides β-EP and L-ENK in human fetal thymus expressed as earlier as in 16 to 20 week fetuses. The resources of two opioid peptides generated in fetal thymus were related to thymic epithelial cells.
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Key words thymus;endorphins;enkephalins;fetal
内源性阿片样肽不仅在中枢和外周有镇痛、调节神经内分泌系统的作用，还有增强淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性的免疫调节作用〔1〕。研究证明，淋巴细胞表面有阿片样肽受体〔1〕。Savino 等〔2〕还发现，β-内啡肽(β-EP)和亮氨酸脑啡肽(L-ENK)能刺激胸腺上皮细胞分泌胸腺血清因子(thymulin)。另有研究报道，免疫细胞也可产生阿片样肽物质〔3〕。
胸腺是神经内分泌免疫调节网络中的关键性器官。笔者以前的工作证明,新生期小鼠去除胸腺后可阻碍神经内分泌系统的功能发育〔4〕,而甲状腺激素T3对胸腺上皮细胞分泌活性产物有促进作用〔5〕。Geenen等〔6〕以及笔者最近〔7〕的研究工作发现，人胎儿胸腺上皮细胞可表达神经垂体多肽激素。本文探讨阿片样肽在人胎儿胸腺组织以及胸腺上皮细胞中的表达。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本采集及处理 本研究所用的12例胎儿胸腺标本均取自健康孕妇的水囊引产胎儿，孕龄16～24周；其中，孕龄<20周的为5例，≥20周龄的为7例。胸腺在胎儿引产后以最快速度(4 h内)取出，分成3份后分别处理：(1)取约0.1 g的胸腺组织块，放入100℃生理盐水中煮沸3 min；用分析天平称得实际重量；放入含有1 mol/L冰醋酸0.5 ml的玻璃匀浆器中碾磨获得组织匀浆，用1 mol/L NaOH 0.5 ml中和；低温离心3 000 r/min，30 min；取上清液置-20℃保存。(2)取部分胸腺组织做冷冻切片5～6张，置-20℃保存。(3)剩余胸腺组织分别用副甲醛和10%福尔马林固定后，作常规石蜡切片。
1.2 阿片样肽的测定 胸腺组织提取液中β-EP和L-EK含量的测定用放射免疫测定药盒在上海第二军医大学神经生物学教研室完成。
1.3 免疫组化测定 胎儿胸腺组织的冷冻切片和常规石蜡切片用ABC法作免疫组化染色，所用的β-EP和L-ENK抗体均购自上海第二军医大学，有效工作浓度β-EP,1∶500;L-ENK,1∶300。另外，角蛋白(keratin)抗体购自DAKO公司。
, http://www.100md.com
1.4 统计学方法 采用t检验。
2 结果
2.1 人胎儿胸腺组织中阿片样肽的含量 12例胎儿胸腺组织提取液的β-EP含量(pg/100 mg湿重组织)(
±s)为550.89±195.11，范围在196.21～811.80；而11例胸腺组织提取液中的L-ENK的含量为1 028.44±632.78，范围在305.38～2 048.94。这两种阿片样肽含量在不同标本间的差异均较大。比较胎龄<20周组和≥20周组的胸腺组织提取液中的这两种阿片样肽的含量，差异均无显著性(P>0.05)(见表1)。表1 不同胎龄胸腺组织中β-EP和L-ENK含量比较(
±s,pg/100 mg湿重组织) 胎龄(周), 百拇医药
n
β-EP
L-ENK
<20
5
510.56±237.80
1 254.94±862.77
≥20
7
579.71±172.55
839.68±333.57△
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1.02
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>0.05
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△示t′值;n=6
2.2 胎儿胸腺上皮细胞表达阿片样肽 用免疫组化方法检测胎儿胸腺组织冷冻切片和石蜡切片，结果显示keratin阳性反应细胞多位于胸腺小体处，而对β-EP和L-ENK单抗呈阳性反应的细胞也多数分布在胸腺小体处。冷冻切片和福尔马林固定的常规切片同时作免疫组化对照，未见有明显差别。
3 讨论
, 百拇医药
在神经内分泌免疫调节网络中，神经内分泌系统产生的激素、神经肽以及神经递质可以调控免疫系统的功能。许多研究资料表明，内源性阿片样肽可能是精神、神经因素影响和调节免疫功能重要的效应物质。β-EP在体外能明显促进淋巴细胞的增殖反应和NK细胞的活性〔1〕，也有研究报道有抑制淋巴细胞功能活性〔1〕。Chiappelli等〔8〕认为这是由于β-EP可能同时影响淋巴细胞活化时磷脂肌醇代谢的几个方面，增强或抑制CD3-γ链的磷酸化，形成不同的效应。另一方面，免疫应答可以影响中枢阿片样肽的产生，王剑平等〔9〕发现大鼠在对绵羊红细胞刺激的抗体反应过程中，下丘脑和垂体的β-EP明显下降。近年来的研究表明，免疫细胞也可产生阿片样肽物质〔3〕。多种动物的胸腺组织中均可测出前阿黑皮素(POMC)来源的神经肽，包括β-EP。但在人类胸腺组织的研究资料较少。
Geenen等以及笔者最近的工作发现，胸腺上皮细胞可产生神经垂体的多肽激素〔6，7〕。本研究主要观察到人胎儿胸腺组织两种阿片样肽β-EP和L-ENK的表达，结果表明，胸腺在胎龄16周时即可产生β-EP和L-ENK，表达量与胎龄20周以后相同。笔者观察结果显示，L-ENK的表达比β-EP高。本研究用免疫组化方法发现胎儿胸腺组织也可出现胸腺小体，其中以角蛋白阳性细胞，即胸腺上皮细胞为主；在胎儿胸腺组织中与β-EP和L-ENK单抗起阳性反应的细胞也大多分布在胸腺小体处，这表明人胚胎期的胸腺上皮细胞也能表达β-EP和L-ENK。
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胸腺上皮细胞产生的阿片样肽的生物学意义还有待阐明。胸腺来源的阿片样肽可能会影响中枢的神经内分泌活动，但在胸腺局部的作用似应更为重要。Savino等〔2〕用多种阿片样肽作用体外培养的胸腺上皮细胞，发现β-EP和L-ENK能增加胸腺上皮细胞分泌胸腺血清因子(thymulin)的水平，这就提示β-EP和L-ENK等阿片样肽不仅是神经内分泌系统与免疫系统相互作用的重要介导因素，也很可能是胸腺内分泌微环境中的重要因素之一，在T细胞的分化成熟过程中有重要作用。
国家自然科学基金资助课题(编号39170685)
参考文献
1 Wybran J.Enkephalins and endorphins as modifiers of the immune system:Present and future.Fed Proc，1985，44(1)∶92
, 百拇医药
2 Savino W,Gagnerault MC,Bach JF,et al.Neuroendocrine control of thymic hormonal production. II. Stimulatory effects of endogenous opioids on thymulin production by cultured human and murine thymic epithelial cells.Life Sci，1990，46(23)∶1 687
3 Jessop DS,Lightman SL,Chowdrey HS.Effects of a chronic inflammatory stress on levels of pro-opiomelanocortin-derived peptides in the rat spleen and thymus.J Neuroimmunol，1994,49(1,2)∶197
, 百拇医药 4 李柏青,杨贵贞.新生期去胸腺对神经内分泌系统的影响.白求恩医科大学学报,1989,15(5)∶442
5 李柏青,杨贵贞.小鼠胸腺上皮细胞培养上清的生物学活性.中华微生物学和免疫学杂志,1989,9(4)∶222
6 Geenen V,Legros JJ,Franchimont P.et al.Coexistence of oxytocin and neurophysin in the human thymus.Science,1986,232(4 749)∶508
7 李柏青，居 弘，李涤臣,等.神经垂体多肽激素在人胎儿胸腺组织的表达.蚌埠医学院学报，1999，24(4)∶221
8 Chiappelli F,Kavelaars A,Heijnen CJ，Beta-endorphin effects on membrane transduction in human lymphocytes.Ann NY Acad Sci,1992,650∶211
9 王剑平，叶天星，杨嗣坤.免疫应答中垂体及下丘脑β-内啡肽样免疫反应物质含量的动态变化.中国免疫学杂志,1989,6(1)∶29
〔收稿日期 1999-06-29〕, http://www.100md.com