包虫病患者血清存放方法及时间对抗体效价的影响
作者：李燕宾 杨书鲲 杨玉荣 张京元
单位：李燕宾 杨玉荣 张京元 宁夏医学院寄生虫学教研室 750004; 杨书鲲 银川市第一人民医院 750001
关键词：
宁夏医学院学报990528 在临床检验和教学科研工作中均会遇到有关血清保存及应用效果的问题。如临检中的阳性对照血清存放时间与检测效果的关系，科研工作渭的阳性病人血清的保存时间以及保存方法对血清检验的效果的影响缺乏统一的标准。本研究比较了包虫病人血清在不同的保存时间和不同的保存方法下血清抗体效价的变化，以期为临检和科研工作所用的阳性血清找出最佳有效期和存放方法。
1 材料与方法
1.1 试验血清
1.1.1 病人血清：100份包虫病人血清均采自宁夏区内各医院外科手术证实的病人术前血。
, 百拇医药
1.1.2 对照血清：15份采自非流行区健康输血者，100份其它病患者血，其中蛔虫病20份，消化道炎症80份。
1.1.3 阳参与阴参血清制备按文献[2]。
1.2 棘球蚴液(EgCF)抗原
无菌抽取6例手术切除的人肝棘球蚴囊液，等量混合，2000r/min离心30min,取上清经蒸馏水透析24h，冻干浓缩7～10倍，加1∶10000柳硫汞，存于-20℃备用。
1.3 试剂与器材
1.3.1 ELISA试验用各试剂：辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗人IgG购于兰州生物制品研究所(批号87001，87001，90001)；HRP标记单抗人IgM购于北京生物制品研究所(批号87004，89004，90004)。
, 百拇医药
1.3.2 载体与底物：载体为Aus Immunlon Microtitrplate 96孔，德国产。底物为邻苯二胺-过氧化氢溶液。
1.4 试验方法
1.4.1 血清保存方法：将一部分病人血清与对照血清分装存放-20℃下，用一次溶解一次；另一部分分装为小试管存放-20℃下，用一次只取出要用的一小管。ELISA法检测不同存放时间下的血清抗体。
1.4.2 棘球蚴病人血清内抗棘球蚴特异性抗体的检测；按微量间接血凝法[1]。血清稀释方法：按1∶2为起点进行倍比稀释，以终点滴度的OD490nm>0.50为阳性，判定结果。
2 结果
2.1 反复冻融血清存放后抗棘球蚴抗体滴度的变化(表1，表2)
, 百拇医药
表1 不同存放时间血清抗棘球蚴IgG滴度的变化 病例
例数
IgG型抗体几何平均滴度
≤1周
≤半年
≤1年
≤2年
≤5年
包虫病人血清
50
1∶503
1∶458
, http://www.100md.com
1∶300
1∶200
1∶100
其它病人血清
50
1∶52
1∶58
1∶74
1∶60
1∶80
表2 不同存放时间血清抗棘球蚴IgM滴度的变化 病例
例数
, 百拇医药 IgG型抗体几何平均滴度
≤1周
≤半年
≤1年
≤2年
≤5年
包虫病人血清
50
1∶200
1∶200
1∶150
1∶100
1∶74
, http://www.100md.com
其它病人血清
50
1∶50
1∶52
1∶60
1∶58
1∶60
2.2 分装血清(未反复冻融)存放后抗棘球蚴抗体滴度的变化(表3，表4) 表3 不同存放时间血清抗棘球蚴IgG滴度的变化 病例
例数
IgG型抗体几何平睇滴度
≤1周
, http://www.100md.com ≤半年
≤1年
≤2年
≤5年
包虫病人血清
50
1∶508
1∶500
1∶506
1∶480
1∶320
其它病人血清
50
, 百拇医药
1∶52
1∶50
1∶42
1∶48
1∶40
表4 不同存放时间血清抗棘球蚴IgM滴度的变化 病例
例数
IgM型抗体几何平均滴度
≤1周
≤半年
≤1年
≤2年
, http://www.100md.com ≤5年
包虫病人血清
50
1∶200
1∶200
1∶200
1∶200
1∶180
其它病人血清
50
1∶50
1∶48
1∶40
, 百拇医药
1∶38
1∶42
表1与表2可示反复将血清冻融存放长于或等于2年以上的血清滴度均值低于存放1周和半年内的血清滴度均值，统计学处理P≤0.01有显著差异，其它病人血清的滴度均值比较虽P≥0.05无显著差异，但都可见有增高的趋势。
表3与表4可示未反复将血清冻融，整装统一放于-20℃用时再取的方法比较，1周内与接近5年的存放抗体滴度均无显著变化，其它病人的对照血清的交叉抗体滴度均值虽然变化也不显著，但有下降趋势。
从表1表3与表2表4的比较中可见IgG滴度均值都高于IgM的滴度均值。
3 讨论
由于所有血清均来自手术证实的棘球蚴病人术前血，根据包虫寄生于人体的生物学特点及前来就诊的均为有临床症状的病人，故病史一般均较长，抗棘球蚴IgG抗体滴度均值都高于IgM的滴度均值。
, http://www.100md.com
反复冻融的血清不论是测IgG还是IgM其敏感性与特异性随时间的增长而降低，分析认为血清中的抗体球蛋白由于反复冻融使球蛋白降解而效价降低[3]。同时由于血清中除了抗体球蛋白外尚有其它蛋白的降解变性形成较多的干扰检测因素[4]，使非特异反应的滴度均值有增高趋势。
未反复冻融的分装血阳性血清抗体在2年之内其特异性及敏感性均未见显著变化，认为这样对阳性血清的保存方法较好，本试验的结果推荐无论是临检工作中还是科研、教学工作中阳参血清及阴参血清均应分装存放并时间不易太长(不超过2年最佳)，以期统一检测标准。
参考文献
1 张京元，李富荣，黄 俭，等.同种和异种抗原诊断泡球蚴病的比较.地方病通报，1989，4(2)：38
2 杨玉荣，张京元，李燕宾，等.棘球蚴病CAb、CAg与CIC检测结果评价.中国寄生虫防治杂志，1993，6(3)：195
3 杨玉荣，魏燕琴，李燕宾，等.泡球蚴血清不同存放时间中CAg、CAb、CIC检测结果比较.中国寄生虫防治杂志，1987，10(3)：238
4 哈小琴，景 涛，曹和询，等.包虫病患者循环抗原检测中血清不同处理方法的比较研究.中国人兽共患病杂志，1994，10(4)：13
1999-04-29收稿，任义芳编辑, 百拇医药
单位：李燕宾 杨玉荣 张京元 宁夏医学院寄生虫学教研室 750004; 杨书鲲 银川市第一人民医院 750001
关键词：
宁夏医学院学报990528 在临床检验和教学科研工作中均会遇到有关血清保存及应用效果的问题。如临检中的阳性对照血清存放时间与检测效果的关系，科研工作渭的阳性病人血清的保存时间以及保存方法对血清检验的效果的影响缺乏统一的标准。本研究比较了包虫病人血清在不同的保存时间和不同的保存方法下血清抗体效价的变化，以期为临检和科研工作所用的阳性血清找出最佳有效期和存放方法。
1 材料与方法
1.1 试验血清
1.1.1 病人血清：100份包虫病人血清均采自宁夏区内各医院外科手术证实的病人术前血。
, 百拇医药
1.1.2 对照血清：15份采自非流行区健康输血者，100份其它病患者血，其中蛔虫病20份，消化道炎症80份。
1.1.3 阳参与阴参血清制备按文献[2]。
1.2 棘球蚴液(EgCF)抗原
无菌抽取6例手术切除的人肝棘球蚴囊液，等量混合，2000r/min离心30min,取上清经蒸馏水透析24h，冻干浓缩7～10倍，加1∶10000柳硫汞，存于-20℃备用。
1.3 试剂与器材
1.3.1 ELISA试验用各试剂：辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗人IgG购于兰州生物制品研究所(批号87001，87001，90001)；HRP标记单抗人IgM购于北京生物制品研究所(批号87004，89004，90004)。
, 百拇医药
1.3.2 载体与底物：载体为Aus Immunlon Microtitrplate 96孔，德国产。底物为邻苯二胺-过氧化氢溶液。
1.4 试验方法
1.4.1 血清保存方法：将一部分病人血清与对照血清分装存放-20℃下，用一次溶解一次；另一部分分装为小试管存放-20℃下，用一次只取出要用的一小管。ELISA法检测不同存放时间下的血清抗体。
1.4.2 棘球蚴病人血清内抗棘球蚴特异性抗体的检测；按微量间接血凝法[1]。血清稀释方法：按1∶2为起点进行倍比稀释，以终点滴度的OD490nm>0.50为阳性，判定结果。
2 结果
2.1 反复冻融血清存放后抗棘球蚴抗体滴度的变化(表1，表2)
, 百拇医药
表1 不同存放时间血清抗棘球蚴IgG滴度的变化 病例
例数
IgG型抗体几何平均滴度
≤1周
≤半年
≤1年
≤2年
≤5年
包虫病人血清
50
1∶503
1∶458
, http://www.100md.com
1∶300
1∶200
1∶100
其它病人血清
50
1∶52
1∶58
1∶74
1∶60
1∶80
表2 不同存放时间血清抗棘球蚴IgM滴度的变化 病例
例数
, 百拇医药 IgG型抗体几何平均滴度
≤1周
≤半年
≤1年
≤2年
≤5年
包虫病人血清
50
1∶200
1∶200
1∶150
1∶100
1∶74
, http://www.100md.com
其它病人血清
50
1∶50
1∶52
1∶60
1∶58
1∶60
2.2 分装血清(未反复冻融)存放后抗棘球蚴抗体滴度的变化(表3，表4) 表3 不同存放时间血清抗棘球蚴IgG滴度的变化 病例
例数
IgG型抗体几何平睇滴度
≤1周
, http://www.100md.com ≤半年
≤1年
≤2年
≤5年
包虫病人血清
50
1∶508
1∶500
1∶506
1∶480
1∶320
其它病人血清
50
, 百拇医药
1∶52
1∶50
1∶42
1∶48
1∶40
表4 不同存放时间血清抗棘球蚴IgM滴度的变化 病例
例数
IgM型抗体几何平均滴度
≤1周
≤半年
≤1年
≤2年
, http://www.100md.com ≤5年
包虫病人血清
50
1∶200
1∶200
1∶200
1∶200
1∶180
其它病人血清
50
1∶50
1∶48
1∶40
, 百拇医药
1∶38
1∶42
表1与表2可示反复将血清冻融存放长于或等于2年以上的血清滴度均值低于存放1周和半年内的血清滴度均值，统计学处理P≤0.01有显著差异，其它病人血清的滴度均值比较虽P≥0.05无显著差异，但都可见有增高的趋势。
表3与表4可示未反复将血清冻融，整装统一放于-20℃用时再取的方法比较，1周内与接近5年的存放抗体滴度均无显著变化，其它病人的对照血清的交叉抗体滴度均值虽然变化也不显著，但有下降趋势。
从表1表3与表2表4的比较中可见IgG滴度均值都高于IgM的滴度均值。
3 讨论
由于所有血清均来自手术证实的棘球蚴病人术前血，根据包虫寄生于人体的生物学特点及前来就诊的均为有临床症状的病人，故病史一般均较长，抗棘球蚴IgG抗体滴度均值都高于IgM的滴度均值。
, http://www.100md.com
反复冻融的血清不论是测IgG还是IgM其敏感性与特异性随时间的增长而降低，分析认为血清中的抗体球蛋白由于反复冻融使球蛋白降解而效价降低[3]。同时由于血清中除了抗体球蛋白外尚有其它蛋白的降解变性形成较多的干扰检测因素[4]，使非特异反应的滴度均值有增高趋势。
未反复冻融的分装血阳性血清抗体在2年之内其特异性及敏感性均未见显著变化，认为这样对阳性血清的保存方法较好，本试验的结果推荐无论是临检工作中还是科研、教学工作中阳参血清及阴参血清均应分装存放并时间不易太长(不超过2年最佳)，以期统一检测标准。
参考文献
1 张京元，李富荣，黄 俭，等.同种和异种抗原诊断泡球蚴病的比较.地方病通报，1989，4(2)：38
2 杨玉荣，张京元，李燕宾，等.棘球蚴病CAb、CAg与CIC检测结果评价.中国寄生虫防治杂志，1993，6(3)：195
3 杨玉荣，魏燕琴，李燕宾，等.泡球蚴血清不同存放时间中CAg、CAb、CIC检测结果比较.中国寄生虫防治杂志，1987，10(3)：238
4 哈小琴，景 涛，曹和询，等.包虫病患者循环抗原检测中血清不同处理方法的比较研究.中国人兽共患病杂志，1994，10(4)：13
1999-04-29收稿，任义芳编辑, 百拇医药