当前位置: 首页 > 期刊 > 《临床检验杂志》 > 1999年第5期
编号:10241176
溴化乙啶-端粒重复扩增法检测端粒酶活性

     作者:伍勇 陈正炎 唐银

    单位:湖南医科大学附属湘雅医院检验科

    关键词:端粒酶;溴化乙啶;聚合酶链反应;肿瘤

    临床检验杂志990506 摘要 为了建立一种能够适合于临床需要的检测端粒酶活性的方法,我们以溴化乙啶染色来显示PCR产物的电泳结果,并将对结果有显著影响的实验条件进行优化。确定了本法的最佳实验条件为:37°C的延伸温度,PCR循环数为40次,样品所含蛋白浓度为0.75 g/L。实验结果表明本法特异性好(90%)、灵敏度高(87%)、时间短、费用低、易操作、无放射性危害,便于广泛开展。

    端粒(telomere)是由一段重复DNA序列组成的一种特殊结构,它位于真核细胞染色体末端[1]。端粒酶(telomerase)是一种以自身RNA为模板,在染色体3末端合成端粒DNA的寡核苷酸蛋白复合物[2]。本文介绍的溴化乙啶-端粒重复扩增法(Ethidium bromide-telomeric repeat amplification protocol,EB-TRAP)克服了上述不足,便于各级医院开展,能直接为临床服务。

    1 材料

    1.1 雄性昆明小鼠睾丸(湖南医科大学动物学部)。

    1.2 43例胃粘膜活检标本(湖南医科大学附三医院和湖南省肿瘤医院提供)。

    1.3 主要试剂 洗涤液[10 mmol/L HEPES-KOH(pH 7.5),1.0 mmol/L DTT,1.0 mmol/L MgCl2,10 mmol/L KCl];溶解液[10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5),1.0 mmol/L MgCl2,1.0 mmol/L EGTA,0.1 mmol/L PMSF,5.0 mmol/L BME,0.5% CHAPS,10%甘油(重蒸馏)];10×TRAP buffer[20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3),1.5mmol/L MgCl2,63 mmol/L KCl,0.005% Tween-20,1.0 mmol/L EGTA];TS引物(5'-AATCCGTG AGCAGAGTT-3')和CX引物(5'-(CCCTTA)3CCCTAA-3'][3];0.5 μg/ml溴化乙啶(ethidium bromide,EB)。

    1.4 主要仪器 ZHP-2B型PCR扩增仪;ZF-3型紫外透射反射分析仪;CS-930型双波长薄层扫描仪。

    2 方法

    2.1 初步建立EB-TRAP法

    2.1.1 细胞提取物的制备[3] 选择日龄超过60天的性成熟雄性昆明小鼠,取其双侧睾丸,用冰冷的0.1 mmol/L PBS洗一次,在4°C条件下,3 500 r/min离心10 min,去上清液。沉淀物用冰冷的洗涤液重新悬起,再次清洗,并在上次清洗的同样条件下弃去上清液,将所得沉淀物置于-40°C冰箱中保存。将冰冻的沉淀物放入玻璃匀浆器中,在冰浴中匀浆10 min后,按5 μl/mg睾丸组织加入冰冷的溶解液,继续匀浆10 min,再冰浴30 min。在4°C条件下,以3 500 r/min离心30 min,取上清液(此即细胞提取物)。用酚试剂法测定其所含蛋白质浓度,提取物仍可再贮存于-40°C冰箱中。

    2.1.2 端粒酶延伸TS引物及PCR扩增[4] 于冰箱中取出提取物,以冰冷的1×TRAP buffer稀释至其所含蛋白质浓度为3 g/L,此为待检样品。在10μl待检样品中加入1μg RNaseA,将其置于23°C孵育30 min,此为待检样品的阴性对照。在0.5 ml的塑料离心管中加入10×TRAP buffer 5 μl,四种0.5 mmol/L dNTP各5μl,A260=1.0的TS引物3 μl,0.1g/dl BSA 5μL,待检样品(或阴性对照)2μl,重蒸馏水11μl,石蜡油30 μl。于23°C延伸30 min后,再加入A260=1.0的CX引物3 μl,2 U/μl Taq DNA聚合酶1 μl,以94°C 30 s、50°C 30 s、72°C 1 min 30 s的参数循环27次,再72°C保温5 min后终止反应。

    2.1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳[4] 制作0.9 mm厚度的15 g/dl聚丙烯酰胺凝胶,点样20 μl PCR产物,电泳缓冲液为0.5×TBE,电压恒为120 V,电泳6小时后取下胶膜,于0.5 μg/ml EB液中染色45 min后,于紫外透射仪上观察结果并记录。

    2.2 EB-TRAP法的优化 试验中需要优化7个因素,每因素设2个水平:dNTP浓度(150/50 μmol/L);MgCl2终浓度(1.5/3.0 mmol/L);TS延伸的溶液pH(8.3/7.2);TS延伸时温度(23/37°C);待检样品蛋白质浓度(3.0/0.3g/L);TS(CX)用量(6/3μl);KCl终浓度(50/63 mmol/L);循环次数(35/27次)。根据各试验因素及水平,选择L16(215)正交表设计试验。将试验结果摄影后,于扫描仪上测定各区带吸光度值。在此基础上,再行待检样品稀释度(即样品蛋白质浓度)和循环数的进一步优化。

    2.3 以EB-TRAP法检测43例胃粘膜活检标本的端粒酶活性。

    3 结果

    3.1 以EB-TRAP法检测端粒酶的阳性结果,为电泳后出现一系列的等距离条带,阴性结果无条带。见图1。

    1.优化前的阳性结果;2.优化后的阳性结果

    3.阴性对照;4.pGEM-7Zf(+)/HaeⅢ Markers

    图1 EB-TRAP法检测端粒酶活性

    3.2 将所测得的吸光度值分别作方差分析(F检验和配对t检验),发现端粒酶延伸TS的温度,待检样品蛋白质浓度,PCR的循环数对结果有显著影响(P<0.05或P<0.01)。进一步分析可知该方法最佳反应条件为:延伸温度37°C,循环数40次,样品蛋白浓度0.75 g/L。

    3.3 以EB-TRAP法检测出43例胃粘膜活检标本的端粒酶活性的结果为:23例胃癌标本中,有20例呈阳性,阳性率为87%;7例胃癌前病变标本中,有2例呈阳性,阳性率为28.6%;10例浅表性胃炎和3例胃癌前疾病标本中无一例阳性,假阳性率为10%,经x2检验,显示胃癌标本端粒酶阳性率(87%)明显高于其它胃粘膜病变(P<0.005)。

    4 讨论

    用EB染色PCR产物的电泳结果来检测端粒酶活性的方法,通过设计一对独特的引物TS和CX,保证了检测的高度特异性;通过PCR反应,显著地增加了端粒酶延伸TS产物的量,极大地提高了检测端粒酶活性的灵敏度;采用去污剂溶解和物理破碎相结合来处理标本[5],能使端粒酶更充分地从细胞核中释放出来。

    对试验的部分重要因素进行优化的结果表明:端粒酶延伸TS的温度、提取液蛋白质的浓度(即标本稀释度)、PCR循环数都对结果有显著影响。37°C既最适合TS延伸,又较易控制。循环数越大,扩增产物越多,但一般不能超过40次,否则,较易出现非特异性扩增。细胞提取物中的某些蛋白质能够抑制Taq DNA聚合酶的活性[6],所以,蛋白质浓度过高的标本,可能显示假阴性结果。但过度稀释待检样品,也将因端粒酶含量极低而同样出现假阴性结果。所以,确定标本中端粒酶检测的最适蛋白浓度很有必要。

    小鼠与人类染色体端粒重复序列相同,均为TTAGGG,且性成熟的小鼠睾丸有较高的端粒酶活性[7],故本文将其作为阳性对照。要优化试验条件,其结果必须为量化指标。为解决这一问题,在进行优化试验的过程中,除需要优化的因素外,其它各试验因素在同一次试验的各管之间应尽量保持完全一致。这样,再通过在同一张照片上扫描试验结果而得到的吸光度值就可作为相对定量的指标。

    参考文献

    1 Blackburn E H.Structure and function of telomeres.Nature,1991,350:569

    2 Greider C W,Blackbure E H.A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.Nature,1989,337:331

    3 Kim N W,Piatyszek M A,Prowse K R,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science 1994,266:2011

    4 金冬雁,黎孟枫,等译.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出版社,1992.304

    5 Counter C W,Avilion A A,LeFeuvre C E,et al.Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity.EMBO J,1992,11:1921

    6 Wright W E,Shay J W,Piatyszek M A.Modifications of the telomeric repeat amplification protocol(TRAP)result in increased reliability,lineaity and sensitivity,Nucleic Acids Res,1995,23:3794

    7 Prowse K R,Greider C W.Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and ttlomere length.Proc Natl Acad Sci,USA,1995,92:4818

    8 杨仕明,房殿春,罗光辉,等.胃粘膜活检标本端粒酶活性的检测.中华消化内镜杂志,1997,14:298

    (1998-09-07收稿,1999-05-28修回)
    婵犵數濮烽弫鎼佸磿閹寸姴绶ら柦妯侯棦濞差亝鍋愰悹鍥皺椤︻厼鈹戦悩缁樻锭婵炲眰鍊濋、姘舵焼瀹ュ棛鍘卞┑鐐村灥瀹曨剟寮搁妶鍡愪簻闁冲搫鍟崢鎾煛鐏炲墽鈽夐柍钘夘樀瀹曪繝鎮欏顔介獎闂備礁鎼ˇ顐﹀疾濠婂吘娑㈠礃椤旇壈鎽曞┑鐐村灦鑿ら柡瀣叄閻擃偊宕堕妸锕€鐨戦梺绋款儐閹歌崵绮嬮幒鏂哄亾閿濆簼绨介柛鏃撶畱椤啴濡堕崱妤€娼戦梺绋款儐閹瑰洭寮诲☉銏″亹鐎规洖娲㈤埀顒佸笚娣囧﹪宕f径濠傤潓闂佸疇顫夐崹鍨暦閸洖鐓橀柣鎰靛墰娴滄瑩姊虹拠鏌ヮ€楃紒鐘茬Ч瀹曟洟宕¢悙宥嗙☉閳藉濮€閻橀潧濮︽俊鐐€栫敮鎺椝囬鐐村€堕柨鏃傜摂濞堜粙鏌i幇顒佲枙闁稿孩姊归〃銉╂倷閸欏鏋犲銈冨灪濡啫鐣烽妸鈺婃晣闁绘劙娼ч幖绋库攽閻樺灚鏆╅柛瀣█楠炴捇顢旈崱妤冪瓘闂佽鍨奸悘鎰洪鍕吅闂佺粯锚閸氣偓缂佹顦靛娲箰鎼达絿鐣甸梺鐟板槻椤戝鐣烽悽绋块唶婵犮埄浜濆Λ鍐极閸屾粎椹抽悗锝庝簻婵″ジ姊绘担鍛婃喐闁稿鍋ら獮鎰板箮閽樺鎽曢梺鍝勬储閸ㄥ綊鐛姀銈嗙厸闁搞儮鏅涘瓭婵犵鈧尙鐭欓柡宀嬬秮婵偓闁宠桨鑳舵禒鈺冪磽閸屾氨孝闁挎洦浜悰顔界節閸ャ劍娅㈤梺缁樓圭亸娆撴偪閳ь剚淇婇悙顏勨偓鏍箰妤e啫纾婚柣鏂挎憸椤╃兘鏌熼幍顔碱暭闁抽攱鍨块弻娑㈡晜鐠囨彃绗岄梺鑽ゅ枑閸f潙煤椤忓嫀褔鏌涢妷顔惧帥婵炶偐鍠栧娲礃閸欏鍎撻梺鐟板暱濮橈妇鎹㈠鑸碘拻濞达絽鎳欒ぐ鎺戝珘妞ゆ帒鍊婚惌娆撴煙閻戞﹩娈曢柛濠傜仛閵囧嫰寮崹顔规寖缂佺偓鍎抽妶鎼佸蓟閿熺姴绀冮柕濞垮劗閸嬫挾绮欓幐搴㈢槑濠电姷鏁告慨顓㈠箯閸愵喖绀嬮柛顭戝亞閺夊綊鏌f惔銏╁晱闁哥姵鐗犻幃銉╂偂鎼达絾娈惧┑顔姐仜閸嬫挸鈹戦埄鍐憙妞わ附濞婇弻娑㈠箻閺夋垹浠哥紓浣虹帛缁嬫捇鍩€椤掍胶鈯曞畝锝呮健閹本绻濋崑鑺ユ閹晠宕f径瀣瀾闂備浇妗ㄧ欢锟犲闯閿濆鈧線寮撮姀鈩冩珕闂佽姤锚椤︿粙鍩€椤掍胶鈽夐柍瑙勫灴閺佸秹宕熼锛勬崟濠电姭鎷冮崨顔界彧缂備緡鍠楅悷锔炬崲濠靛鐐婇柕濞у啫绠版繝鐢靛О閸ㄧ厧鈻斿☉銏℃櫇闁靛牆顦Ч鏌ユ煛閸モ晛鏋戦柛娆忕箻閺岋綁鎮㈤悡搴濆枈濠碘槅鍨崑鎾绘⒒娴h姤銆冪紒鈧担铏圭煋闁圭虎鍠楅崑鈺傜節闂堟侗鍎忕紒鈧崘鈹夸簻妞ゆ挾鍠庨悘锝夋煙鐎电ǹ鍘存慨濠勭帛閹峰懐绮电€n亝鐣伴梻浣告憸婵敻骞戦崶褏鏆︽繝闈涳功閻も偓濠电偞鍨兼ご鎼佸疾閿濆洨纾介柛灞剧懅閸斿秴鐣濋敐鍛仴闁糕斂鍨藉顕€宕奸悢鍝勫箺闂備胶鎳撻顓㈠磿閹寸偟鐟规繛鎴欏灪閻撴洟鏌¢崒姘变虎闁哄棴缍侀弻鈥崇暆鐎n剛鐦堥悗瑙勬礃鐢帡锝炲┑瀣垫晣闁绘﹢娼ч獮鈧紓鍌氬€搁崐鐑芥倿閿曞倶鈧啴宕ㄥ銈呮喘閺屽棗顓奸崨顖氬Е婵$偑鍊栫敮鎺楀窗濮橆兗缂氶柟閭﹀枤绾惧吋銇勯弮鍥т汗缂佺姴顭烽弻銊モ攽閸繀妲愰梺杞扮閸熸潙鐣烽幒鎴僵闁告鍋為幉銏ゆ⒒娴h棄鍚瑰┑鐐╁亾缂傚倸鍊归懝楣冨煝瀹ュ鏅查柛銉㈡櫇閻撳姊洪崜鑼帥闁哥姵鎹囬崺鈧い鎺嶇缁楁帗銇勯锝囩疄妞ゃ垺锕㈤幃鈺咁敃閿濆孩缍岄梻鍌氬€风欢姘缚瑜嶇叅闁靛牆鎮垮ú顏勎╅柍杞拌兌閸旓箑顪冮妶鍡楃瑨闁稿妫濆銊╂偋閸垻顔曟繝銏f硾椤戝洤煤鐎电硶鍋撶憴鍕8闁搞劏濮ゆ穱濠囧醇閺囩偟鍊為梺闈浨归崕鐑樺閺囥垺鐓熼柣鏂挎憸閻苯顭胯椤ㄥ牓寮鍢夋棃宕崘顏嗏棨濠电姰鍨奸崺鏍礉閺嶎厼纾婚柨婵嗩槹閻撴洟鏌曟径妯虹仩妞も晩鍓欓埥澶愬箻閻熸壆姣㈢紓浣介哺鐢岣胯箛娑樜╃憸蹇涙偩婵傚憡鈷戠憸鐗堝俯濡垵鈹戦悙鈺佷壕闂備浇顕栭崰妤冨垝閹捐绠板┑鐘插暙缁剁偛顭跨捄铏圭伇婵﹦鍋撶换婵嬫偨闂堟稐绮跺銈嗘处閸樹粙骞堥妸锔哄亝闁告劑鍔嶅Σ顒勬⒑閸濆嫮鈻夐柛妯恒偢瀹曞綊宕掗悙瀵稿帾婵犵數鍋熼崑鎾斥枍閸℃稒鐓曢悗锝冨妼婵″ジ妫佹径鎰叆婵犻潧妫欓崳褰掓煛閸℃瑥鏋戝ǎ鍥э躬椤㈡稑顫濋崡鐐╁徍婵犳鍠栭敃銉ヮ渻娴犲鈧線寮撮姀鈩冩珳闂佺硶鍓濋悷锕傤敇婵犳碍鈷掑ù锝堟鐢盯鏌熺喊鍗炰簽闁瑰箍鍨归埞鎴犫偓锝庡墮缁侊箓鏌f惔顖滅У闁哥姵鐗滅划濠氭晲閸℃瑧鐦堟繝鐢靛Т閸婃悂顢旈锔界厵闁哄鍋勬慨鍌涙叏婵犲啯銇濇鐐村姈閹棃鏁愰崒娑辨綌闂傚倷绀侀幖顐︽偋濠婂牆绀堥柣鏃堫棑閺嗭箓鏌i悢绋款棎闁割偒浜弻娑㈠即閵娿儱瀛e┑鐐存綑鐎氼剟鈥旈崘顔嘉ч柛鈩冾殘閻熸劙姊虹紒妯洪嚋缂佺姵鎸搁锝夊箮缁涘鏅滈梺鍓插亞閸犳捇宕㈤柆宥嗏拺闁荤喓澧楅幆鍫㈢磼婢跺缍戦柣锝囨暬瀹曞崬鈽夊▎鎴濆笚闁荤喐绮嶇划鎾崇暦濠婂喚娼╂い鎺戭槹閸嶇敻姊洪棃娴ュ牓寮插⿰鍫濈;闁稿瞼鍋為悡銉╂煟閺傛寧鎯堢€涙繈鏌i悢鍝ユ嚂缂佺姵鎹囬悰顕€寮介鐐殿啇濡炪倖鎸鹃崑鐔哥椤栨粎纾藉ù锝嗗絻娴滅偓绻濋姀锝嗙【闁愁垱娲濋妵鎰板箳閹寸媭妲梻浣呵圭换妤呭磻閹邦兘鏋旈柕鍫濐槹閳锋垹绱撴担璐細缂佺姵鐗犻弻锝夊煛婵犲倻浠╅梺浼欑悼閸忔﹢寮幘缁樺亹闁肩⒈鍓﹀Σ浼存⒒娴h棄浜归柍宄扮墦瀹曟粌顫濇0婵囨櫓闂佺鎻梽鍕煕閹达附鍋i柛銉岛閸嬫捇鎼归銈勭按闂傚倷绀侀幉锟犲蓟閵婏富娈介柟闂寸閻撴繈鏌熼幑鎰靛殭缂佺媴缍侀弻锝夊箛椤撶喓绋囧銈呭閹告悂鍩為幋锔藉亹閻犲泧鍐х矗闂備礁鎽滈崳銉╁垂閸洜宓侀柛鈩冪☉绾惧吋鎱ㄩ敐搴″箹缂傚秴锕獮鍐煛閸涱厾顔岄梺鍦劋缁诲倹淇婇柨瀣瘈闁汇垽娼цⅴ闂佺ǹ顑嗛幑鍥蓟閻斿皝鏋旈柛顭戝枟閻忔挾绱掓ィ鍐暫缂佺姵鐗犲濠氭偄鐞涒€充壕闁汇垻娅ラ悷鐗堟瘎闂佽崵鍠愮划搴㈡櫠濡ゅ懏鍋傞柨鐔哄Т閽冪喐绻涢幋娆忕仼缂佺姵濞婇弻锟犲磼濮樿鲸鐨戦梺鍝勵儏閹冲酣鍩為幋锔藉€烽柛娆忣槸濞咃綁姊绘担绋跨盎缂佽尙鍋撶粚杈ㄧ節閸パ咁啋濡炪倖妫佹慨銈呪枍閵忋倖鈷戦悹鎭掑妼濞呮劙鏌熼崙銈嗗

   闂傚倷娴囬褍霉閻戣棄鏋佸┑鐘宠壘绾捐鈹戦悩鍙夋悙缂佹劖顨婇弻锟犲炊閳轰焦鐏侀梺宕囨嚀缁夋挳鍩為幋锔藉亹闁告瑥顦伴幃娆忊攽閳藉棗浜濋柨鏇樺灲瀵鈽夐姀鐘栥劑鏌曡箛濠傚⒉闁绘繃鐗犻幃宄扳堪閸愩劎鐩庨梺鐟板殩閹凤拷  闂傚倸鍊搁崐鐑芥嚄閼哥數浠氱紓鍌欒兌缁垶銆冮崨鏉戠厺鐎广儱顦崡鎶芥煏韫囨洖校闁诲寒鍓熷铏圭磼濡搫顫庨梺绋跨昂閸婃繂鐣烽弴鐐垫殕闁告洦鍓涢崢浠嬫⒑闁稑宓嗘繛浣冲嫭娅犳い鏂款潟娴滄粓骞栭幖顓炵仭閻庢熬鎷�  闂傚倸鍊峰ù鍥х暦閸偅鍙忛柡澶嬪殮濞差亜围闁搞儻绲芥禍鐐叏濡厧甯堕柣蹇ラ檮閵囧嫰濮€閿涘嫭鍣板Δ鐘靛仜椤戝寮崘顔肩劦妞ゆ帒鍊婚惌鍡涙煕閺囥劌鐏¢柣鎾跺枑娣囧﹪顢涘┑鎰缂備浇灏畷鐢垫閹炬剚鍚嬮煫鍥ㄦ煥椤忥拷  闂傚倸鍊搁崐鐑芥嚄閸洖绠犻柟鎹愵嚙鐟欙箓鎮楅敐搴″闁搞劍绻堥獮鏍庨鈧俊鑲╃棯閹佸仮闁哄本娲樼换娑㈡倷椤掍胶褰呴梻浣告啞椤ㄥ棙绻涙繝鍥ц摕闁斥晛鍟欢鐐烘倵閿濆簼绨介柛鏃偳归埞鎴﹀煡閸℃浼堥梺鐟板殩閹凤拷