sMiMi-CK cDNA的克隆、表达及活性检测
作者：李 芳 李守岩 王孝铭 关振中
单位：李 芳：哈尔滨医科大学病生教研室(150086)；李守岩：黑龙江省前哨农场医院；关振中：哈医大附属第二医院心内科
关键词：sMiMi-CK；RT-PCR；克隆；表达
中国急救医学990504 [摘 要] 目的 本实验拟通过RT-PCR技术，克隆及表达大鼠心肌线粒体sMiMi-CK基因。方法 从大鼠心肌线粒体总RNA中扩增出sMiMi-CK DNA片段(1.33kb)，将该片段克隆到载体pUC19上，对其进行酶切和测序，然后将其克隆到PBV220上，经温度诱导，使其在大肠杆菌中得以表达，并用NADH法测其活性。结果 sMiMi-CK基因序列与国外报导的序列完全一致，表达的sMiMi-CK 分子量为45.8KD，占菌体总蛋白的10.7%，其活性为2.74×105IU/L菌液。结论 sMiMi-CK 基因的克隆及表达，为今后从基因水平上研究心肌缺血性损伤的机制及治疗提供了依据。
, 百拇医药
Clone，expression and activity of rat myocardial mitochondrial sarcomeric creaine kinase Li Fang,Li Shouyan,Wang Xiaoming,et al.Departmet of pathophysilogy，Harbin Medical University,Harbin 150086
[Abstract] Objective A DNA fregment which code rat myocardial mitochondrial sarcomeric creatine kinase (sMiMi-CK) has been amplified by RT-PCR from rat myocardial genomic RNA.It was colned and expressed.Methods sMiMi-CK gene was cloned to plasmid pUC19 and subjected to sequenced analysis.An expression clone of sMiMi-CK was constructed PBV 220,and protein activity can be measured by automatic bitchem. Results The DNA sequenceis the same as reported abroad.The recombinated sMiMi-CK was stenthesized in an Escherichia coli expression system and its molecular weight was about 45.8KD,the expressed sMiMi-CK was about 10.7 per cent of total bacteria protein.Its activity was 2.74×105 IU/L in colibacillus.Conclusion sMiMi-CK colne and expression provide some useful data for the study of cardiac ischemia injury mechanism and treatmeat in the gene levels.
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[Key words] sMiMi-CK RT-PCR Clone Expression
细胞生长代谢的每一个环节都离不开能量，能量是有生命的细胞活动必不可少的物质基础。心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基( sMiMi-CK )在心肌细胞能量代谢方面起着重要的作用[1]，它对于细胞 ATP 的利用、贮存及转运具有重大的意义。细胞内线粒体的氧化磷酸化是ATP 的主要来源，而sMiMi-CK 可以调节氧化磷反应即当线粒体内氧化磷酸化产生大量ATP 时，在sMiMi-CK 的催化下，ATP将高能磷酸键转移给肌酸生成磷酸肌酸(PCr)，而PCr 是能量的储存形式。当细胞内ATP缺乏时，由sMiMi-CK 催化将PCr 的能量转给ADP、产生ATP，以供机体需求[2]。可见，sMiMi-CK在线粒体呼吸调节中起着重要作用，故我们以sMiMi-CK为重点进行研究，以期从分析生物学角度，研究sMiMi-CK 基因的特点以及为临床能量代谢障碍性疾病的防治提供理论和实践基础。
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1 资料与方法
1.1 资料 受体菌DH5a 和质粒pUC19 及表达载体PBV220均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家生物技术重点试验室提供。限制性内切酶EcoR I、 HidⅢ、SmaⅠ、AVaⅡ、ClaⅠ、T4DNA 连接酶、异硫氰酸胍等分别购自Promega，美国BRL公司，基因颗粒试剂盒购自 B.M 公司。
1.2 方法
1.2.1 大鼠心肌线粒体总 RNA 的提取：2%戊巴比妥钠按(2 mg/kg)麻醉大鼠，在无RNA条件下，取出心脏，组织匀浆，按异硫氰酸胍法提取总 RNA。
1.2.2 sMiMi-CK cDNA 的合成：反转录反应在20μl反应体系中进行，取sMiMi-CK核酸 5 μl(0.1 μg/μl)，加引物Ⅰ(20 pmol/μl) 2 μl置70℃，变性5min，然后迅速冰浴 10min，向上述体系中加入适量的RNasin dNTP，反转录酶及缓冲液，DTT，混匀，37℃水浴1小时。
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1.2.3 寡核苷酸的化学合成：寡核苷酸在 Applied Biosystems 的380 ADNA 合成仪上合成，参照已发表[3]的大鼠心肌 sMiMi-CK 核苷酸序列设计一对引物：P1＝5′TCAAGACACTCAACCAAGAA-3′
P2＝5′CATACCAGCAGACACATCAC-3′
1.2.4 PCR 法扩增 sMiMi-CK ：以合成的 cDNA 为模板，P1、P2 为引物，进行PCR扩增，PCR产物用基因颗粒试剂盒进行纯化。
1.2.5 基因操作：质粒提取，酶切反应和DNA体外重组，DNA序列分析，大肠杆菌感受态细胞的制备及转化等方法参照文献[4]。
1.2.6 重组 sMiMi-CK 基因蛋白质的表达及检测：将含有外源基因表达载体的大肠杆菌于37℃活化过夜后，1∶100稀释到LB培养液中，继续在37℃摇床培养至OD＝0.2～0.6，迅速转到42℃摇床培养4～6小时，收集菌体，进行SDS-PAGE和凝胶密度扫描分析，分离胶为15%，浓缩胶为4%。
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1.2.7 sMiMi-CK 活性测定：收集的菌体用7M盐酸胍50 mM Tris-HCl(pH 8.0)裂解，然后 17 000 rp/min 离心15 min，弃沉淀，在生化自动分析仪上测活性。
2 结果
2.1 sMiMi-CK 基因的制备 ①cDNA 的制备：从大鼠心肌线粒体中提取了总 RNA，在反转录酶的作用下，以mRNA 为模板，合成 cDNA。②PCR结果：图1示 PCR 扩增结果，从图中可见扩增的 DNA 在1.33 kb 左右处有一条明显的带，与已报道一致，用 Klenow 酶处理纯化的 PCR 产物末端与经SmaⅠ酶切的线性化pUC19质粒DNA 连接，转化大肠杆菌DH5a，在含氨苄青霉素、X-gal 和 IPTG的琼脂平板上培养37℃过夜。
Fig 1 sMiMi-CK mRNA 的反转录RT-PCR
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A：λDNA EcoR Ⅰ/Hid Ⅲ Marker
B：sMiMi-CK mRNA RT-PCR
2.2 sMiMi-CK 基因的克隆及分析 选择白色菌落转化子，提取质粒，得到重组质粒，用 EcoRⅠ酶切约为4.0kb作用，见图2。以EcoR Ⅰ、Hid Ⅲ双酶切该重组质粒，得到1.33 kb的片段，与扩增的DNA片段大小一致，图3。用AVa Ⅱ、Cla Ⅰ进行酶切，鉴定酶切位点，见图4。并以重组质粒为模板作PCR检测，结果初步表明该质粒为 sMiMi-CK 基因重组 pUC19。
Fig 2 重组质粒 pUC19 的单酶切鉴定
M：λDNA EcoR Ⅰ+Hid Ⅲ
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A：pUC19 sMiMi-CK /EcoR Ⅰ
B：pUC19 sMiMi-CK /Hid Ⅲ
Fig 3 重组质粒 pUC19 的双酶切鉴定
A：λDNA EcoR Ⅰ/Hid Ⅲ Marker
B：pUC19 sMiMi-CK EcoR Ⅰ/Hid Ⅲ
Fig 4 重组质粒 PBV220 的双酶切鉴定
A:λDNA EcoR Ⅰ+/HidⅢ
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B:PBV220 sMiMi-CK EcoR Ⅰ/Sal Ⅱ
2.3 sMiMi-CK 基因的核苷酸序列分析 亚克隆上述基因，通过双脱氧链末端终止法用引物M13在DNA全自动系统(AB Ⅰ 373A)型DNA测序仪测得重组sMiMi-CK基因序列，序列分析结果与MarK等[4]分析结果一致，证明所克隆的DNA片段确实为 sMiMi-CK 基因。2.4 重组sMiMi-CK基因的表达克隆 将上述鉴定的sMiMi-CK基因与表达载体 PBV 220进行平端连接，得到重组质粒，电泳为5.0 kb 左右，见图5。用BaH Ⅰ鉴定DNA片段在重组质粒中为正向，见图6。
Fig 5 重组质粒 PBV220 的酶切鉴定
A:λDNA HidⅢ Marker
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B：PBV220 sMiMi-CK /BaHⅠ
Fig 6 sMiMi-CK 基因表达产物的SDS-PAGE分子量
A：蛋白质分子量标准 B：空白质粒PBV220
C：重组质粒菌体温度诱导前 D.E：重组质粒温度诱导4小时
2.5 重组 sMiMi-CK 基因的表达及检测 将含有 sMiMi-CK 基因的表达载体 PBV220 ，经温度诱导后培养，收集菌体，进行 SDS-PAGE 电泳，结果见图7，未诱导的菌体中没有 sMiMi-CK 的表达，而诱导的菌体中有明显的 sMiMi-CK 的蛋白带，分子量约为45.8 kb 左右 ，凝胶密度扫描显示，蛋白表达量占总菌体蛋白量的10.7%。2.6 表达蛋白质的活性测定 用含7M盐酸胍 50mM Tris-HCl(pH 8.0)裂解细胞，在生化自动分析仪上测活性，测得活性为2.74×105 IU/L菌液。
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3 讨论
自八十年代末开始，国外对sMiMi-CK基因克隆的报导增多[5]，但都为建cDNA文库而得到该基因，直接采用反转录PCR方法获得sMiMi-CK基因，在国内外尚未见报导。本实验以大鼠心肌线粒体RNA为模板，反转录成cDNA后，经PCR扩增sMiMi-CK得到了该基因，并用T4 DNA聚合酶处理其末端后，平端连到了pUC 19克隆质粒上，经过酶切、测序鉴定，证明确实获得了重组基因，简易地完成了sMiMi-CK基因的体外克隆。可见，RT-PCR法是极其简便、容易的快速克隆方法，可以广为利用。
利用大肠杆菌(E.Coli)来合成某些生物分子，具有低成本、高效率、周期短等特点，已经越来越成为人们研究的热门领域。PBV220 作为表达载体，含有 PRPL 启动子，同时含有 Ci 调控基因、多酶切位点和两个强的转录终止序列，带起始密码子ATG的外源基因可以插入启动子下游的多酶切位点，表达非融合蛋白，产品可供临床使用[6]。
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近十年来国外学者对 sMiMi-CK 基因蛋白质及活性的研究只限于通过纯化 sMiMi-CK 而得到其蛋白质[7]，我们则通过体外 DNA 重组技术，真正得到了 sMiMi-CK 基因蛋白质，这为临床缺血性心脏病及能量代谢障碍性疾病的基因治疗提供了条件和奠定了理论基础。
黑龙江省自然科学基金资助项目(D09613)
参考文献
1 Jorg S ,Beat ZW, et al .Native mitochondrial creatine kinase forms octamaeric strucure .J Biological Chemistry ,1998 ,263 :32 ,16942-16953
2 Muller M,Moser R,Chenevel D,et al .Cardiolipin is the membrane receptor for mitochondrial creatine phosphokinase .J Biological Chemistry,1985,260：3839-3843
, 百拇医药
3 Mark R,Robere C,Arnold W,et al.Structural characterization and tissue expression of the mRNA encoding isoenzymes form two rat mitochondrial creatine kinase.Biochimica Biophysica Acta,1991,1289：352-361
4 J.萨姆布鲁克，E.F费里奇，T.曼尼阿蒂斯，著.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第二版.北京：科学出版社，1992.19
5 Haas R,Korenfeld C,Zhanf Z, et al.Isolation and charactization of the gene and cDNA encoding human mitochonarial creatine kinase .J Biol Chem，1989，264:2890
6 张智清，等.病毒学报，1990，6：No2
7 Saiki R,Scharf S,Faloona F，et al.Enzymatic amplification of globin genomic segunles and retriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science,1985,230:1350
(收稿：1998-07-25，修回：1999-01-20), http://www.100md.com
单位：李 芳：哈尔滨医科大学病生教研室(150086)；李守岩：黑龙江省前哨农场医院；关振中：哈医大附属第二医院心内科
关键词：sMiMi-CK；RT-PCR；克隆；表达
中国急救医学990504 [摘 要] 目的 本实验拟通过RT-PCR技术，克隆及表达大鼠心肌线粒体sMiMi-CK基因。方法 从大鼠心肌线粒体总RNA中扩增出sMiMi-CK DNA片段(1.33kb)，将该片段克隆到载体pUC19上，对其进行酶切和测序，然后将其克隆到PBV220上，经温度诱导，使其在大肠杆菌中得以表达，并用NADH法测其活性。结果 sMiMi-CK基因序列与国外报导的序列完全一致，表达的sMiMi-CK 分子量为45.8KD，占菌体总蛋白的10.7%，其活性为2.74×105IU/L菌液。结论 sMiMi-CK 基因的克隆及表达，为今后从基因水平上研究心肌缺血性损伤的机制及治疗提供了依据。
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Clone，expression and activity of rat myocardial mitochondrial sarcomeric creaine kinase Li Fang,Li Shouyan,Wang Xiaoming,et al.Departmet of pathophysilogy，Harbin Medical University,Harbin 150086
[Abstract] Objective A DNA fregment which code rat myocardial mitochondrial sarcomeric creatine kinase (sMiMi-CK) has been amplified by RT-PCR from rat myocardial genomic RNA.It was colned and expressed.Methods sMiMi-CK gene was cloned to plasmid pUC19 and subjected to sequenced analysis.An expression clone of sMiMi-CK was constructed PBV 220,and protein activity can be measured by automatic bitchem. Results The DNA sequenceis the same as reported abroad.The recombinated sMiMi-CK was stenthesized in an Escherichia coli expression system and its molecular weight was about 45.8KD,the expressed sMiMi-CK was about 10.7 per cent of total bacteria protein.Its activity was 2.74×105 IU/L in colibacillus.Conclusion sMiMi-CK colne and expression provide some useful data for the study of cardiac ischemia injury mechanism and treatmeat in the gene levels.
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[Key words] sMiMi-CK RT-PCR Clone Expression
细胞生长代谢的每一个环节都离不开能量，能量是有生命的细胞活动必不可少的物质基础。心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基( sMiMi-CK )在心肌细胞能量代谢方面起着重要的作用[1]，它对于细胞 ATP 的利用、贮存及转运具有重大的意义。细胞内线粒体的氧化磷酸化是ATP 的主要来源，而sMiMi-CK 可以调节氧化磷反应即当线粒体内氧化磷酸化产生大量ATP 时，在sMiMi-CK 的催化下，ATP将高能磷酸键转移给肌酸生成磷酸肌酸(PCr)，而PCr 是能量的储存形式。当细胞内ATP缺乏时，由sMiMi-CK 催化将PCr 的能量转给ADP、产生ATP，以供机体需求[2]。可见，sMiMi-CK在线粒体呼吸调节中起着重要作用，故我们以sMiMi-CK为重点进行研究，以期从分析生物学角度，研究sMiMi-CK 基因的特点以及为临床能量代谢障碍性疾病的防治提供理论和实践基础。
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1 资料与方法
1.1 资料 受体菌DH5a 和质粒pUC19 及表达载体PBV220均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家生物技术重点试验室提供。限制性内切酶EcoR I、 HidⅢ、SmaⅠ、AVaⅡ、ClaⅠ、T4DNA 连接酶、异硫氰酸胍等分别购自Promega，美国BRL公司，基因颗粒试剂盒购自 B.M 公司。
1.2 方法
1.2.1 大鼠心肌线粒体总 RNA 的提取：2%戊巴比妥钠按(2 mg/kg)麻醉大鼠，在无RNA条件下，取出心脏，组织匀浆，按异硫氰酸胍法提取总 RNA。
1.2.2 sMiMi-CK cDNA 的合成：反转录反应在20μl反应体系中进行，取sMiMi-CK核酸 5 μl(0.1 μg/μl)，加引物Ⅰ(20 pmol/μl) 2 μl置70℃，变性5min，然后迅速冰浴 10min，向上述体系中加入适量的RNasin dNTP，反转录酶及缓冲液，DTT，混匀，37℃水浴1小时。
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1.2.3 寡核苷酸的化学合成：寡核苷酸在 Applied Biosystems 的380 ADNA 合成仪上合成，参照已发表[3]的大鼠心肌 sMiMi-CK 核苷酸序列设计一对引物：P1＝5′TCAAGACACTCAACCAAGAA-3′
P2＝5′CATACCAGCAGACACATCAC-3′
1.2.4 PCR 法扩增 sMiMi-CK ：以合成的 cDNA 为模板，P1、P2 为引物，进行PCR扩增，PCR产物用基因颗粒试剂盒进行纯化。
1.2.5 基因操作：质粒提取，酶切反应和DNA体外重组，DNA序列分析，大肠杆菌感受态细胞的制备及转化等方法参照文献[4]。
1.2.6 重组 sMiMi-CK 基因蛋白质的表达及检测：将含有外源基因表达载体的大肠杆菌于37℃活化过夜后，1∶100稀释到LB培养液中，继续在37℃摇床培养至OD＝0.2～0.6，迅速转到42℃摇床培养4～6小时，收集菌体，进行SDS-PAGE和凝胶密度扫描分析，分离胶为15%，浓缩胶为4%。
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1.2.7 sMiMi-CK 活性测定：收集的菌体用7M盐酸胍50 mM Tris-HCl(pH 8.0)裂解，然后 17 000 rp/min 离心15 min，弃沉淀，在生化自动分析仪上测活性。
2 结果
2.1 sMiMi-CK 基因的制备 ①cDNA 的制备：从大鼠心肌线粒体中提取了总 RNA，在反转录酶的作用下，以mRNA 为模板，合成 cDNA。②PCR结果：图1示 PCR 扩增结果，从图中可见扩增的 DNA 在1.33 kb 左右处有一条明显的带，与已报道一致，用 Klenow 酶处理纯化的 PCR 产物末端与经SmaⅠ酶切的线性化pUC19质粒DNA 连接，转化大肠杆菌DH5a，在含氨苄青霉素、X-gal 和 IPTG的琼脂平板上培养37℃过夜。
Fig 1 sMiMi-CK mRNA 的反转录RT-PCR
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A：λDNA EcoR Ⅰ/Hid Ⅲ Marker
B：sMiMi-CK mRNA RT-PCR
2.2 sMiMi-CK 基因的克隆及分析 选择白色菌落转化子，提取质粒，得到重组质粒，用 EcoRⅠ酶切约为4.0kb作用，见图2。以EcoR Ⅰ、Hid Ⅲ双酶切该重组质粒，得到1.33 kb的片段，与扩增的DNA片段大小一致，图3。用AVa Ⅱ、Cla Ⅰ进行酶切，鉴定酶切位点，见图4。并以重组质粒为模板作PCR检测，结果初步表明该质粒为 sMiMi-CK 基因重组 pUC19。
Fig 2 重组质粒 pUC19 的单酶切鉴定
M：λDNA EcoR Ⅰ+Hid Ⅲ
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A：pUC19 sMiMi-CK /EcoR Ⅰ
B：pUC19 sMiMi-CK /Hid Ⅲ
Fig 3 重组质粒 pUC19 的双酶切鉴定
A：λDNA EcoR Ⅰ/Hid Ⅲ Marker
B：pUC19 sMiMi-CK EcoR Ⅰ/Hid Ⅲ
Fig 4 重组质粒 PBV220 的双酶切鉴定
A:λDNA EcoR Ⅰ+/HidⅢ
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B:PBV220 sMiMi-CK EcoR Ⅰ/Sal Ⅱ
2.3 sMiMi-CK 基因的核苷酸序列分析 亚克隆上述基因，通过双脱氧链末端终止法用引物M13在DNA全自动系统(AB Ⅰ 373A)型DNA测序仪测得重组sMiMi-CK基因序列，序列分析结果与MarK等[4]分析结果一致，证明所克隆的DNA片段确实为 sMiMi-CK 基因。2.4 重组sMiMi-CK基因的表达克隆 将上述鉴定的sMiMi-CK基因与表达载体 PBV 220进行平端连接，得到重组质粒，电泳为5.0 kb 左右，见图5。用BaH Ⅰ鉴定DNA片段在重组质粒中为正向，见图6。
Fig 5 重组质粒 PBV220 的酶切鉴定
A:λDNA HidⅢ Marker
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B：PBV220 sMiMi-CK /BaHⅠ
Fig 6 sMiMi-CK 基因表达产物的SDS-PAGE分子量
A：蛋白质分子量标准 B：空白质粒PBV220
C：重组质粒菌体温度诱导前 D.E：重组质粒温度诱导4小时
2.5 重组 sMiMi-CK 基因的表达及检测 将含有 sMiMi-CK 基因的表达载体 PBV220 ，经温度诱导后培养，收集菌体，进行 SDS-PAGE 电泳，结果见图7，未诱导的菌体中没有 sMiMi-CK 的表达，而诱导的菌体中有明显的 sMiMi-CK 的蛋白带，分子量约为45.8 kb 左右 ，凝胶密度扫描显示，蛋白表达量占总菌体蛋白量的10.7%。2.6 表达蛋白质的活性测定 用含7M盐酸胍 50mM Tris-HCl(pH 8.0)裂解细胞，在生化自动分析仪上测活性，测得活性为2.74×105 IU/L菌液。
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3 讨论
自八十年代末开始，国外对sMiMi-CK基因克隆的报导增多[5]，但都为建cDNA文库而得到该基因，直接采用反转录PCR方法获得sMiMi-CK基因，在国内外尚未见报导。本实验以大鼠心肌线粒体RNA为模板，反转录成cDNA后，经PCR扩增sMiMi-CK得到了该基因，并用T4 DNA聚合酶处理其末端后，平端连到了pUC 19克隆质粒上，经过酶切、测序鉴定，证明确实获得了重组基因，简易地完成了sMiMi-CK基因的体外克隆。可见，RT-PCR法是极其简便、容易的快速克隆方法，可以广为利用。
利用大肠杆菌(E.Coli)来合成某些生物分子，具有低成本、高效率、周期短等特点，已经越来越成为人们研究的热门领域。PBV220 作为表达载体，含有 PRPL 启动子，同时含有 Ci 调控基因、多酶切位点和两个强的转录终止序列，带起始密码子ATG的外源基因可以插入启动子下游的多酶切位点，表达非融合蛋白，产品可供临床使用[6]。
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近十年来国外学者对 sMiMi-CK 基因蛋白质及活性的研究只限于通过纯化 sMiMi-CK 而得到其蛋白质[7]，我们则通过体外 DNA 重组技术，真正得到了 sMiMi-CK 基因蛋白质，这为临床缺血性心脏病及能量代谢障碍性疾病的基因治疗提供了条件和奠定了理论基础。
黑龙江省自然科学基金资助项目(D09613)
参考文献
1 Jorg S ,Beat ZW, et al .Native mitochondrial creatine kinase forms octamaeric strucure .J Biological Chemistry ,1998 ,263 :32 ,16942-16953
2 Muller M,Moser R,Chenevel D,et al .Cardiolipin is the membrane receptor for mitochondrial creatine phosphokinase .J Biological Chemistry,1985,260：3839-3843
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3 Mark R,Robere C,Arnold W,et al.Structural characterization and tissue expression of the mRNA encoding isoenzymes form two rat mitochondrial creatine kinase.Biochimica Biophysica Acta,1991,1289：352-361
4 J.萨姆布鲁克，E.F费里奇，T.曼尼阿蒂斯，著.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第二版.北京：科学出版社，1992.19
5 Haas R,Korenfeld C,Zhanf Z, et al.Isolation and charactization of the gene and cDNA encoding human mitochonarial creatine kinase .J Biol Chem，1989，264:2890
6 张智清，等.病毒学报，1990，6：No2
7 Saiki R,Scharf S,Faloona F，et al.Enzymatic amplification of globin genomic segunles and retriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science,1985,230:1350
(收稿：1998-07-25，修回：1999-01-20), http://www.100md.com