血小板活化因子对肾小球系膜细胞合成前列腺素E2的影响
作者：任国辉 李 悦 叶任高
单位：广州医学院附属二院肾内科(广州，510260)；叶任高 中山医科大学肾脏病研究所
关键词：血小板活化因子；肾小球系膜细胞；前列腺素
摘 要 目的
摘 要 目的：探讨血小板活化因子(PAF)对肾小球系膜细胞(GMC)合成前列腺素E2(PGE2)的影响及其意义。 方法：测定PAF刺激对GMC合成PGE2的影响。 结果：PAF刺激GMC显著增加PGE2的合成并呈剂量依赖性。10-5mol/LPAF在5min内即刺激GMC合成PGE2显著增加。刺激PGE2合成的PAF阈值为10-10mol/L，刺激半量和 最大量PGE2合成的PAF浓度分别约为10-8mol/L和10-7mol/L。溶PAF无刺激GMC合成PGE2作用。PAF受体拮抗剂BN 52021能抑制PAF刺激GMC合成PGE2。PGE2对肾小球功能有保护作用。 结论：PAF介导肾小球肾炎发病中的作用，能由其诱 导PGE2合成增加所中和。
, 百拇医药
E2EFFECTS AND SIGNIFICANCE OF PLAT ELET ACTIVATING FACTOR ON THE PROSTAGLAN DIN E2 IN RAT GLOMERULAR MESANGIAL CELLS
Ren Guohui，Li Yue，Ye Rengao
Department of Nephrology，the Second Aff iliated Hospital，Guangzhou Medical Coll ege， Guangzhou 510260
OBJECTIVE To explore the eff ect and significance of platelet activating factor(PAF) on prostaglandin E2( PGE2) synthesis in rat glomerular mesangial cell (GMC) in culture.
, 百拇医药
METHODOLOGY The PGE2 synthes is in cultured rat GMC was measured with RIA.A range of different concentration s of PAF(10-5～10-10 mmol/L) were used to stimu late the synthesis of PGE2 in cultured G MCs. A PAF receptor antagonist，BN52021，was used to examine the effect of PAF on the PGE2 synthesis in GMC.
RESULTS PAF significantly st imulated PGE2 synthesis in a dose depend ent manner.PAF(10-8mol/L) rapidly inc reased PGE2 synthesis within 5 minutes(10-15fold).Stimulation was observed at 10-10mol/L PAF，and half-maximum and ma ximum at 10-8 and 10-7mol/L， respectively. Lyso-PAF had no significant effect on PGE2 synthe sis.The effect of BN52021 was examined with a constant concentration of 10-7 mol/L PAF.At equimolar concentrations there was noconsistent inhibition of PAN-stimulated PGE2 synthesis. Significant inhibiti on(about 60%) was observed at 10-8mol/L， and maximum inhibition(about 90%) at 10-5mol/L.
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CONCLUSION PGE2 is important in maintaining glomerular function duri ng glomerulonephritis.The PGE2 synthesis induced by PAF may counteract the infl ammatory effect of PAF in the pathogenes is of glomerulonephritis.
Key words PAF GMC PGE2
血小板活化因子(plateleta ctivating factor，PAF)是一种具有高生物活性，作用广泛的脂质炎症介质。近些年来，国外对PAF在肾脏疾病中的作用进行了广泛研究，表明PAF能直接参与肾小球疾病的致病，改变肾脏血流动力学[1]。本研究中，我们观察分析了PAF对肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell，GMC)合成前列腺素E2(PGE2)的影响及其意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 大鼠GMC培养与鉴定 8只150～200g雄性SD大鼠经乙醚麻醉后，无菌取出双肾，分离肾皮质，剪碎，通过无菌不锈钢筛网140目碾压过筛，收集过筛悬液，再分别从80、200目不锈钢筛上倒下，200目筛截留肾小球在网上。用RPMI1640培养液洗涤下来，倒置显微镜下观察，纯度>95%。用0.1%Ⅳ型胶原酶(sigma)消化37℃30min。RPMI1640培养液洗涤二遍后，置于含20%小牛血清的RPMI1640液(含Hepes 15mmol、胰岛素5 mg/L、转铁蛋白5mg/L、青霉素105U/L、链霉素10mg/L，pH7.4)的培养皿中，37℃、5%CO2条件下培养。约一周左右肾小球贴壁，二周后细胞布满瓶底，用0.25%胰蛋白酶消化传代。根据显微镜下细胞形态观察，波状蛋白(Vimentin)、结状蛋白(Desmin)和Ⅳ型胶原(Collagen Ⅳ)单克隆抗体免疫荧光染色检查阳性，角蛋白(Keratin)阴性，确认所用细胞为GMC。第三代GMC用于本实验研究。
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1.2 PAF、溶PAF(lyso-PAF)溶液的配制 称取1mg PAF或溶-PAF(均购自Sigma公司)，用氯仿0.9ml、甲醇0.2ml溶解后，氮气吹干，加0.9%NaCl10ml，取5ml后再加RPMI1640至90ml，即为10-5mol/LPAF或溶-PAF工作母液，经滤过除菌。
1.3 特异性PAF受体拮抗BN52021溶液的配制 BN52021由法国IHB研究所Braquet博士惠赠，按产品使用说明书操作，(首先用二甲亚砜溶解，然后用生理盐水稀释至800mg/L(2×10-3mol/L)的工作溶液，置37℃保存备用。
1.4 前列腺素E2(PGE2)的检测 采用PGE2放射免疫分析试剂药盒(北京解放军301医院生化室产品)，按药盒实验步骤检测。
1.5 统计学处理 数据以均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异显著。
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2 结 果
2.1 PAF对GMC合成PGE2的影响 从表1可知，PAF在10-5mol/L浓度时，5min内即迅速诱导PGE2合成增加，然后趋于稳定。
表1 10-5mol/L PAF 诱导GMC合成PGE2的情况(±s)
时间(min)
5
10
20
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30
PAF
(10-5 mol/L)组
24.12±4.12*
30.72±4.97*
33.24±5.14*
34.04±5.21*
对照组
2.24±0.31
2.34±0.34
2.29±0.30
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2.27±0.29
数值为四次实验的均值，与对照组比较 *P<0.01
10-10、10-9、10-8、10-7、10 -6、10-5(mol/L)PAF在5min内诱导合成的PGE2量，分别为3.71±0.41，4.22±0.68，11.74±3.04，21.04±4 .08，22.79±4.11，24.12±4.12(μg/L)。如附图所示，诱导PGE2合成的PAF阈值为10-10mol/L，诱导半量和最大值PGE2合成的PAF浓度分别约为10-8mol/L和10-7mol/L。
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附图 不同浓度PAF诱导GMC合成PGE2的情况
(数值为四次实验的均值)
2.2 溶PAF对GMC合成PGE 2的影响 观察10-9～10-5mol/L溶 PAF对GMC合成PGE2的影响，结果未发现PGE2合成增加，说明上述PA F刺激作用是特异的，可能经PAF受体所介导。
2.3 PAF拮抗剂BN52021对 PAF诱导GMC合成PGE2的影响 在10-7mol/L PAF诱导GMC合成PGE2的基础上，应用不同浓度的PAF受体特异性 拮抗剂BN52021进行抑制试验。结果显示，BN52021显著抑制PAF诱导GM C合成PGE2，并呈剂量依赖性(见表2)，如表2所示，与未抑制试验比较10-6mol/LBN52021抑制约60%，10-5mol/L BN52021抑制约90%。
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表2 BN52021抑制PAF诱导 GMC合成PGE2情况
PAF+BN52021
PG E2(μg/L)
PAF(10-7mol /L)
21.04
PAF(10-7mol/L)+BN52021(10-7m ol/L)
20.21
PAF(10-7mol/L)+BN52021(10-6m ol/L)
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8.16
PAF(10-7mol/L)+BN52021(10-5m ol/L)
2.22
3 讨 论
近年的研究已表明，PAF是一种强有力的脂质炎症介质，可在免疫或非免疫刺激下，由白细胞、巨噬细胞和血小板产生[2]，也可由肾小球固有细胞所产生[3]。PAF可引起平滑肌收缩和增加血管通透性，有利于免疫复合物沉积[4]，而参与肾小球肾炎的发病机制。
在肾小球肾炎发病过程中，前列腺素(PG)在维持肾小球功能中起重要作用，表现为：①减弱血管收缩剂(如血管紧张素Ⅱ)的作用[5，6]，从而使得后者所引起的肾小球巨分子和免疫复合物在肾小球中的沉积减少；②前列腺素E2能抑制炎症细胞的功能和增生[7，8]。
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在本实验研究中，我们观察了PAF对GMC合成PGE2的作用，并使用溶PAF作比较。结果PAF能刺激GMC合成PGE2，并呈剂量依赖性。溶PAF既是PAF的前体，也是PAF的代谢产物。与PAF不同之处是缺少乙酰基，因而无激活PAF受体的作用，也无PAF功能，故常用于验证PAF的特异性。本实验中，溶PAF无刺激GMC合成PGE2的作用，表明PAF的刺激作用是特异性的，可能经PAF受体所介导。PAF介导肾小球肾炎发病中的作用，能由其诱导PGE2合成所中和与抵销，说明PGE2合成抑制剂(如消炎痛)对肾小球功能的不利作用和PGE2对肾脏的保护作用。对PAF-GMC-PGE2的保护性自身调节作用应予保护，故肾炎时临床上盲目应用消炎痛可能有害。
*本课题为广东省自然科学基金资助项目(编号：980462)
参考文献
, http://www.100md.com
1 Ortiz A，Gomoz-Chiarri M，Lerma JL et al.The role of platelet activating factor in experimental glomerular injury.Lipids，1991，26：1310
2 任国辉，叶任高.实验性肾炎中肾皮质内血小板活化因子的水平和可能来源.中国病理生理杂志，1996，12：198
3 Chen WP，Chen A，Lin CY.In vitro effects of interleukins on human mesangial cell s：implications for glomerulonephritis.J Pathol，1995，175：327
4 Camussi G，Bussolino F，Teta C et al.P latelet activating factor and glomerulon ephritis.In：Hemostasis，Prostaglandins，an d Renal Disease.Remuzzi G，Mecca G，de Gae tano G.editors. New York：Raven Press，199 0.133-134
, 百拇医药
5 Schramek H.Goroneos E，Dunn MJ.Interact ions of the vasoconstrictor peptides，ang iotensin Ⅱ and endothelin-1，with vasodil atory prostaglandins.Semin Nephrol，1995， 15：195
6 Zambraski EJ.The effects of nonsteroid al anti-inflammatory drugs on renal func tion：experimental studies in animals.Sem in Nephrol，1995，205
7 李晓玫，Schrier RW，Nemenoff RA.前列腺素E2对肾小球系膜细胞分裂原活化蛋白激酶的抑制作用.中华医学杂志，1995，75：207
8 Zahner G，Harendza S，Muller E et al.P rostaglandin E2 stimulates expression of matrix metalloproteinase 2 in cultured rat mesangial cells.Kidnet Int，1997，51： 1116
(1999-08-16收稿，1999-09-21修回), 百拇医药
单位：广州医学院附属二院肾内科(广州，510260)；叶任高 中山医科大学肾脏病研究所
关键词：血小板活化因子；肾小球系膜细胞；前列腺素
摘 要 目的
摘 要 目的：探讨血小板活化因子(PAF)对肾小球系膜细胞(GMC)合成前列腺素E2(PGE2)的影响及其意义。 方法：测定PAF刺激对GMC合成PGE2的影响。 结果：PAF刺激GMC显著增加PGE2的合成并呈剂量依赖性。10-5mol/LPAF在5min内即刺激GMC合成PGE2显著增加。刺激PGE2合成的PAF阈值为10-10mol/L，刺激半量和 最大量PGE2合成的PAF浓度分别约为10-8mol/L和10-7mol/L。溶PAF无刺激GMC合成PGE2作用。PAF受体拮抗剂BN 52021能抑制PAF刺激GMC合成PGE2。PGE2对肾小球功能有保护作用。 结论：PAF介导肾小球肾炎发病中的作用，能由其诱 导PGE2合成增加所中和。
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E2EFFECTS AND SIGNIFICANCE OF PLAT ELET ACTIVATING FACTOR ON THE PROSTAGLAN DIN E2 IN RAT GLOMERULAR MESANGIAL CELLS
Ren Guohui，Li Yue，Ye Rengao
Department of Nephrology，the Second Aff iliated Hospital，Guangzhou Medical Coll ege， Guangzhou 510260
OBJECTIVE To explore the eff ect and significance of platelet activating factor(PAF) on prostaglandin E2( PGE2) synthesis in rat glomerular mesangial cell (GMC) in culture.
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METHODOLOGY The PGE2 synthes is in cultured rat GMC was measured with RIA.A range of different concentration s of PAF(10-5～10-10 mmol/L) were used to stimu late the synthesis of PGE2 in cultured G MCs. A PAF receptor antagonist，BN52021，was used to examine the effect of PAF on the PGE2 synthesis in GMC.
RESULTS PAF significantly st imulated PGE2 synthesis in a dose depend ent manner.PAF(10-8mol/L) rapidly inc reased PGE2 synthesis within 5 minutes(10-15fold).Stimulation was observed at 10-10mol/L PAF，and half-maximum and ma ximum at 10-8 and 10-7mol/L， respectively. Lyso-PAF had no significant effect on PGE2 synthe sis.The effect of BN52021 was examined with a constant concentration of 10-7 mol/L PAF.At equimolar concentrations there was noconsistent inhibition of PAN-stimulated PGE2 synthesis. Significant inhibiti on(about 60%) was observed at 10-8mol/L， and maximum inhibition(about 90%) at 10-5mol/L.
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CONCLUSION PGE2 is important in maintaining glomerular function duri ng glomerulonephritis.The PGE2 synthesis induced by PAF may counteract the infl ammatory effect of PAF in the pathogenes is of glomerulonephritis.
Key words PAF GMC PGE2
血小板活化因子(plateleta ctivating factor，PAF)是一种具有高生物活性，作用广泛的脂质炎症介质。近些年来，国外对PAF在肾脏疾病中的作用进行了广泛研究，表明PAF能直接参与肾小球疾病的致病，改变肾脏血流动力学[1]。本研究中，我们观察分析了PAF对肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell，GMC)合成前列腺素E2(PGE2)的影响及其意义。
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1 材料和方法
1.1 大鼠GMC培养与鉴定 8只150～200g雄性SD大鼠经乙醚麻醉后，无菌取出双肾，分离肾皮质，剪碎，通过无菌不锈钢筛网140目碾压过筛，收集过筛悬液，再分别从80、200目不锈钢筛上倒下，200目筛截留肾小球在网上。用RPMI1640培养液洗涤下来，倒置显微镜下观察，纯度>95%。用0.1%Ⅳ型胶原酶(sigma)消化37℃30min。RPMI1640培养液洗涤二遍后，置于含20%小牛血清的RPMI1640液(含Hepes 15mmol、胰岛素5 mg/L、转铁蛋白5mg/L、青霉素105U/L、链霉素10mg/L，pH7.4)的培养皿中，37℃、5%CO2条件下培养。约一周左右肾小球贴壁，二周后细胞布满瓶底，用0.25%胰蛋白酶消化传代。根据显微镜下细胞形态观察，波状蛋白(Vimentin)、结状蛋白(Desmin)和Ⅳ型胶原(Collagen Ⅳ)单克隆抗体免疫荧光染色检查阳性，角蛋白(Keratin)阴性，确认所用细胞为GMC。第三代GMC用于本实验研究。
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1.2 PAF、溶PAF(lyso-PAF)溶液的配制 称取1mg PAF或溶-PAF(均购自Sigma公司)，用氯仿0.9ml、甲醇0.2ml溶解后，氮气吹干，加0.9%NaCl10ml，取5ml后再加RPMI1640至90ml，即为10-5mol/LPAF或溶-PAF工作母液，经滤过除菌。
1.3 特异性PAF受体拮抗BN52021溶液的配制 BN52021由法国IHB研究所Braquet博士惠赠，按产品使用说明书操作，(首先用二甲亚砜溶解，然后用生理盐水稀释至800mg/L(2×10-3mol/L)的工作溶液，置37℃保存备用。
1.4 前列腺素E2(PGE2)的检测 采用PGE2放射免疫分析试剂药盒(北京解放军301医院生化室产品)，按药盒实验步骤检测。
1.5 统计学处理 数据以均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异显著。, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 PAF对GMC合成PGE2的影响 从表1可知，PAF在10-5mol/L浓度时，5min内即迅速诱导PGE2合成增加，然后趋于稳定。
表1 10-5mol/L PAF 诱导GMC合成PGE2的情况(
±s)时间(min)
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30
PAF
(10-5 mol/L)组
24.12±4.12*
30.72±4.97*
33.24±5.14*
34.04±5.21*
对照组
2.24±0.31
2.34±0.34
2.29±0.30
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2.27±0.29
数值为四次实验的均值，与对照组比较 *P<0.01
10-10、10-9、10-8、10-7、10 -6、10-5(mol/L)PAF在5min内诱导合成的PGE2量，分别为3.71±0.41，4.22±0.68，11.74±3.04，21.04±4 .08，22.79±4.11，24.12±4.12(μg/L)。如附图所示，诱导PGE2合成的PAF阈值为10-10mol/L，诱导半量和最大值PGE2合成的PAF浓度分别约为10-8mol/L和10-7mol/L。
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附图 不同浓度PAF诱导GMC合成PGE2的情况
(数值为四次实验的均值)
2.2 溶PAF对GMC合成PGE 2的影响 观察10-9～10-5mol/L溶 PAF对GMC合成PGE2的影响，结果未发现PGE2合成增加，说明上述PA F刺激作用是特异的，可能经PAF受体所介导。
2.3 PAF拮抗剂BN52021对 PAF诱导GMC合成PGE2的影响 在10-7mol/L PAF诱导GMC合成PGE2的基础上，应用不同浓度的PAF受体特异性 拮抗剂BN52021进行抑制试验。结果显示，BN52021显著抑制PAF诱导GM C合成PGE2，并呈剂量依赖性(见表2)，如表2所示，与未抑制试验比较10-6mol/LBN52021抑制约60%，10-5mol/L BN52021抑制约90%。
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表2 BN52021抑制PAF诱导 GMC合成PGE2情况
PAF+BN52021
PG E2(μg/L)
PAF(10-7mol /L)
21.04
PAF(10-7mol/L)+BN52021(10-7m ol/L)
20.21
PAF(10-7mol/L)+BN52021(10-6m ol/L)
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PAF(10-7mol/L)+BN52021(10-5m ol/L)
2.22
3 讨 论
近年的研究已表明，PAF是一种强有力的脂质炎症介质，可在免疫或非免疫刺激下，由白细胞、巨噬细胞和血小板产生[2]，也可由肾小球固有细胞所产生[3]。PAF可引起平滑肌收缩和增加血管通透性，有利于免疫复合物沉积[4]，而参与肾小球肾炎的发病机制。
在肾小球肾炎发病过程中，前列腺素(PG)在维持肾小球功能中起重要作用，表现为：①减弱血管收缩剂(如血管紧张素Ⅱ)的作用[5，6]，从而使得后者所引起的肾小球巨分子和免疫复合物在肾小球中的沉积减少；②前列腺素E2能抑制炎症细胞的功能和增生[7，8]。
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在本实验研究中，我们观察了PAF对GMC合成PGE2的作用，并使用溶PAF作比较。结果PAF能刺激GMC合成PGE2，并呈剂量依赖性。溶PAF既是PAF的前体，也是PAF的代谢产物。与PAF不同之处是缺少乙酰基，因而无激活PAF受体的作用，也无PAF功能，故常用于验证PAF的特异性。本实验中，溶PAF无刺激GMC合成PGE2的作用，表明PAF的刺激作用是特异性的，可能经PAF受体所介导。PAF介导肾小球肾炎发病中的作用，能由其诱导PGE2合成所中和与抵销，说明PGE2合成抑制剂(如消炎痛)对肾小球功能的不利作用和PGE2对肾脏的保护作用。对PAF-GMC-PGE2的保护性自身调节作用应予保护，故肾炎时临床上盲目应用消炎痛可能有害。
*本课题为广东省自然科学基金资助项目(编号：980462)
参考文献
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1 Ortiz A，Gomoz-Chiarri M，Lerma JL et al.The role of platelet activating factor in experimental glomerular injury.Lipids，1991，26：1310
2 任国辉，叶任高.实验性肾炎中肾皮质内血小板活化因子的水平和可能来源.中国病理生理杂志，1996，12：198
3 Chen WP，Chen A，Lin CY.In vitro effects of interleukins on human mesangial cell s：implications for glomerulonephritis.J Pathol，1995，175：327
4 Camussi G，Bussolino F，Teta C et al.P latelet activating factor and glomerulon ephritis.In：Hemostasis，Prostaglandins，an d Renal Disease.Remuzzi G，Mecca G，de Gae tano G.editors. New York：Raven Press，199 0.133-134
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5 Schramek H.Goroneos E，Dunn MJ.Interact ions of the vasoconstrictor peptides，ang iotensin Ⅱ and endothelin-1，with vasodil atory prostaglandins.Semin Nephrol，1995， 15：195
6 Zambraski EJ.The effects of nonsteroid al anti-inflammatory drugs on renal func tion：experimental studies in animals.Sem in Nephrol，1995，205
7 李晓玫，Schrier RW，Nemenoff RA.前列腺素E2对肾小球系膜细胞分裂原活化蛋白激酶的抑制作用.中华医学杂志，1995，75：207
8 Zahner G，Harendza S，Muller E et al.P rostaglandin E2 stimulates expression of matrix metalloproteinase 2 in cultured rat mesangial cells.Kidnet Int，1997，51： 1116
(1999-08-16收稿，1999-09-21修回), 百拇医药