两种方法检测红斑狼疮抗DNA抗体评价及意义**
作者：孙凌云 金 欧 冯学兵 陆友年 朱世钧 钱 颐
单位：孙凌云 金 欧 冯学兵 陆友年 朱世钧 南京市鼓楼医院 邮政编码：210008；钱 颐 南京市雨花医院
关键词：红斑狼疮 抗DNA抗体 狼疮肾炎
江苏医药990611 摘要 采用放射免疫法和胶体金快速斑点渗滤技术法(简称金斑法)检测系统性红斑狼疮(SLE)血清抗DNA抗体，并分析了抗DNA抗体和其他疾病活动指标间的相关性。结果41例SLE血清用放免法和金斑法检测阳性率分别为73.2%和68.3%，特异性分别为76.7%和83.1%，两者阳性符合率为66.7%，两法检测结果间无显著性差异(P>0.05)。抗DNA抗体和SLE病情活动积分(SLAM)间相关不明显，而与24小时尿蛋白定量显著相关(r＝0.408，P<0.05)。治疗1个月后DNA抗体水平和SLAM积分均显著下降(P<0.01，P<0.001)， 24小时尿蛋白下降不明显(P>0.05)，上述结果表明抗DNA抗体和狼疮肾损害有关。
, http://www.100md.com
1982年，美国风湿病学会(ARA)将抗双链DNA(ds-DNA)抗体阳性作为系统性红斑狼疮(SLE)的诊断标准之一，认为它是SLE的标志性抗体。自从1957年Robbins等报告抗DNA抗体以来，许多学者致力于抗体的检测方法、性质和致病性等方面的研究，普遍认为抗DNA抗体与SLE肾脏损害有关；但也有人持不同意见，国内最近的随访研究也发现抗DNA抗体与狼疮肾发生相关[1]。
目前，检测抗DNA抗体的方法较多，有放射免疫法、短膜虫法、ELISA法、胶体金快速斑点渗滤技术法(简称金斑法)等。不同的方法其敏感性和特异性都有差别，有时给临床诊断带来困难。我们比较了放免法和(金斑法)检测抗DNA抗体的结果，探讨了抗DNA抗体与狼疮活动指标间的关系。
资料和方法
一、临床资料
41例SLE患者均符合1982年ARA诊断标准，男2例，女39例，年龄在13～45岁，病程1.5～12年，全为住院患者。狼疮病情活动程度用SLE活动积分(SLAM)判断[2]。用糖皮质激素(30～45mg/日)、环磷酰胺(CTX)(0.4～0.6g/周)，治疗1个月后再行SLAM评分。
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二、方法
用放免法和金斑法两种方法检测血清抗DNA抗体。放免法试剂盒购自北方生物技术研究所。步骤：待检血清20μl+125I-DNA100μl混匀后，37℃水浴1小时，混匀后测各管放射性T(cpm)，离心20分钟(3000rpm)吸出上清，测各管沉淀放射性B(cpm)，空白管沉淀放射性B0(cpm)，按公式DNA抗体结合率＝(B-B0)/T×100%，正常值≤20%；金斑法试剂盒购自福建三强生物化工有限公司。步骤：在渗滤盒的小孔内加两滴约0.1ml血清，待渗干后去掉红色过滤盖，滴加A试剂3滴待渗干，滴加B试剂2滴待渗。渗滤盒小孔内如出现红色斑点为抗ds-DNA抗体阳性。常规检测24小时尿蛋白定量。
三、资料处理
用χ2检验比较两组率的差异，两样本均数比较用t检验，直线相关分析各指标间的关系，计算相关系数。
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结果
一、两种方法检测SLE抗DNA抗体结果
血清放免法测定抗DNA抗体结合率在23.1%～82.3%，30例阳性；金斑法测定结果28例阳性，两种方法同时阳性者20例。放免法测定阳性而金斑法阴性者7例占23.3%(7/30)，金斑法阳性而放免法阴性者5例占17.9%(5/28)，两种方法的特异性＝1-假阳性率，分别为76.7%和83.1%，见表1。
表1 两种方法测定抗DNA抗体的比较 方法
阳性数
阳性率
符合率
特异性
假阳性率
, 百拇医药
放免法
30
73.2
66.7
76.7
23.3
金斑法
28
68.3
66.7
83.1
17.9
二、治疗前后抗DNA抗体和其它活动指标的变化
, 百拇医药
SLE经1个月治疗后，部分患者进行了前后对比观察，13例SLE患者除1例治疗后抗DNA抗体水平上升外，其余均下降；SLAM积分治疗后均显著下降，24小时尿蛋白无明显下降，见表2。表2 SLE治疗前后抗DNA抗体和其它活动指标的变化
治疗前
治疗后
P值
n
测值
n
测值
SLAM
19
18.58±6.79
, 百拇医药
19
10.74±5.88
<0.001
尿蛋白g/24h
15
1.84±1.63
15
2.12±2.04
>0.05
抗DNA抗体(%)
13
40.26±12.09
, 百拇医药
13
24.45±12.87
<0.01
三、抗DNA抗体与其它指标间的相关性
相关性分析表明抗DNA抗体和24小时尿蛋白有显著正相关(r＝0.408，P<0.05)，抗DNA抗体与SLAM评分不相关(r＝0.01，P>0.05)。讨论
DNA由两条核苷酸链顺时针旋转形成双螺旋结构，DNA变性或变为单链DNA(ssDNA)时，DNA以无规则螺旋形式存在，分子结构有很大的可塑性。以前认为不管是抗ds-DNA或抗ss-DNA抗体的检测，用各种不同的哺乳动物或非哺乳动物的DNA都一样，事实并非如此，DNA分子中碱基或顺序的改变会导致抗原决定簇的改变，抗体识别的表位也不同，DNA抗原的来源不同会影响抗DNA抗体的检测结果。固相试验如ELISA法检测的抗体包括低亲和性和高亲和性的抗体，而液相试验如Farr试验只能测定到高亲和性的抗DNA抗体，这也是ELISA法的敏感性高于放免法的原因[3]。
, 百拇医药
我们比较了放免法和金斑法检测抗DNA抗体的敏感性和特异性。前者的敏感性、特异性分别为73.2%和76.7%，后者的敏感性和特异性分别为68.3%和83.1%，两种方法检测结果间没有显著性差异。国内侯氏[4]等比较了金斑法和马疫锥虫间接免疫荧光法(IHF)检测抗ds-DNA抗体，结果表明29例SLE中前法18例阳性(62.07%)，而后法17例阳性(58.62%)，两者阳性符合率为94.4%，显著高于金斑法和放免法的阳性符合率66.7%(P<0.05)。
许多抗DNA抗体在分子重链恒定区含带正电荷的精氨酸，它不仅能和DNA结合，还能与带负电的抗原结合。抗DNA抗体能和肾小球基底膜上带负电荷的物质结合造成肾脏损害，抗体反应的强弱及在肾小球上的沉积量与肾炎的严重性相关。相关分析显示抗DNA抗体与24小时尿蛋白定量间有显著正相关。SLE治疗1个月后抗DNA抗体显著下降(P<0.01)，仅1例患者抗DNA抗体水平上升，而SLAM评分下降。有报道抗ds-DNA抗体和SLAM间有显著正相关，但和SLE疾病活动性指数间不相关[5]，但本研究未发现抗DNA抗体和SLAM间的相关。抗DNA抗体治疗后虽显著下降，而24小时尿蛋白定量没有明显下降，表明抗体的下降与尿蛋白定量下降不平行，进一步证实了抗DNA抗体在狼疮肾损中的作用。为此，美国国立卫生研究院将抗ds-DNA抗体滴度的升高作为狼疮性肾炎的活动指标之一。
, 百拇医药
**南京市科委资助项目部分
参考文献
[1] 鲍春德，等.风湿病学杂志 1996；2：62.
[2] Liang MH， et al.Arthritis Rheum 1989；32：1107.
[3] 孙凌云编著.分子风湿病学.呼和浩特：内蒙古人民出版社，1997；203.
[4] 侯丽艳，等.风湿病学杂志 1997；4：30.
[5] Holcombe RF， et al.Lupus 1994；3：97.
(1998年8月29日收稿 1999年1月10日修回), http://www.100md.com
单位：孙凌云 金 欧 冯学兵 陆友年 朱世钧 南京市鼓楼医院 邮政编码：210008；钱 颐 南京市雨花医院
关键词：红斑狼疮 抗DNA抗体 狼疮肾炎
江苏医药990611 摘要 采用放射免疫法和胶体金快速斑点渗滤技术法(简称金斑法)检测系统性红斑狼疮(SLE)血清抗DNA抗体，并分析了抗DNA抗体和其他疾病活动指标间的相关性。结果41例SLE血清用放免法和金斑法检测阳性率分别为73.2%和68.3%，特异性分别为76.7%和83.1%，两者阳性符合率为66.7%，两法检测结果间无显著性差异(P>0.05)。抗DNA抗体和SLE病情活动积分(SLAM)间相关不明显，而与24小时尿蛋白定量显著相关(r＝0.408，P<0.05)。治疗1个月后DNA抗体水平和SLAM积分均显著下降(P<0.01，P<0.001)， 24小时尿蛋白下降不明显(P>0.05)，上述结果表明抗DNA抗体和狼疮肾损害有关。
, http://www.100md.com
1982年，美国风湿病学会(ARA)将抗双链DNA(ds-DNA)抗体阳性作为系统性红斑狼疮(SLE)的诊断标准之一，认为它是SLE的标志性抗体。自从1957年Robbins等报告抗DNA抗体以来，许多学者致力于抗体的检测方法、性质和致病性等方面的研究，普遍认为抗DNA抗体与SLE肾脏损害有关；但也有人持不同意见，国内最近的随访研究也发现抗DNA抗体与狼疮肾发生相关[1]。
目前，检测抗DNA抗体的方法较多，有放射免疫法、短膜虫法、ELISA法、胶体金快速斑点渗滤技术法(简称金斑法)等。不同的方法其敏感性和特异性都有差别，有时给临床诊断带来困难。我们比较了放免法和(金斑法)检测抗DNA抗体的结果，探讨了抗DNA抗体与狼疮活动指标间的关系。
资料和方法
一、临床资料
41例SLE患者均符合1982年ARA诊断标准，男2例，女39例，年龄在13～45岁，病程1.5～12年，全为住院患者。狼疮病情活动程度用SLE活动积分(SLAM)判断[2]。用糖皮质激素(30～45mg/日)、环磷酰胺(CTX)(0.4～0.6g/周)，治疗1个月后再行SLAM评分。
, http://www.100md.com
二、方法
用放免法和金斑法两种方法检测血清抗DNA抗体。放免法试剂盒购自北方生物技术研究所。步骤：待检血清20μl+125I-DNA100μl混匀后，37℃水浴1小时，混匀后测各管放射性T(cpm)，离心20分钟(3000rpm)吸出上清，测各管沉淀放射性B(cpm)，空白管沉淀放射性B0(cpm)，按公式DNA抗体结合率＝(B-B0)/T×100%，正常值≤20%；金斑法试剂盒购自福建三强生物化工有限公司。步骤：在渗滤盒的小孔内加两滴约0.1ml血清，待渗干后去掉红色过滤盖，滴加A试剂3滴待渗干，滴加B试剂2滴待渗。渗滤盒小孔内如出现红色斑点为抗ds-DNA抗体阳性。常规检测24小时尿蛋白定量。
三、资料处理
用χ2检验比较两组率的差异，两样本均数比较用t检验，直线相关分析各指标间的关系，计算相关系数。
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结果
一、两种方法检测SLE抗DNA抗体结果
血清放免法测定抗DNA抗体结合率在23.1%～82.3%，30例阳性；金斑法测定结果28例阳性，两种方法同时阳性者20例。放免法测定阳性而金斑法阴性者7例占23.3%(7/30)，金斑法阳性而放免法阴性者5例占17.9%(5/28)，两种方法的特异性＝1-假阳性率，分别为76.7%和83.1%，见表1。
表1 两种方法测定抗DNA抗体的比较 方法
阳性数
阳性率
符合率
特异性
假阳性率
, 百拇医药
放免法
30
73.2
66.7
76.7
23.3
金斑法
28
68.3
66.7
83.1
17.9
二、治疗前后抗DNA抗体和其它活动指标的变化
, 百拇医药
SLE经1个月治疗后，部分患者进行了前后对比观察，13例SLE患者除1例治疗后抗DNA抗体水平上升外，其余均下降；SLAM积分治疗后均显著下降，24小时尿蛋白无明显下降，见表2。表2 SLE治疗前后抗DNA抗体和其它活动指标的变化
治疗前
治疗后
P值
n
测值
n
测值
SLAM
19
18.58±6.79
, 百拇医药
19
10.74±5.88
<0.001
尿蛋白g/24h
15
1.84±1.63
15
2.12±2.04
>0.05
抗DNA抗体(%)
13
40.26±12.09
, 百拇医药
13
24.45±12.87
<0.01
三、抗DNA抗体与其它指标间的相关性
相关性分析表明抗DNA抗体和24小时尿蛋白有显著正相关(r＝0.408，P<0.05)，抗DNA抗体与SLAM评分不相关(r＝0.01，P>0.05)。讨论
DNA由两条核苷酸链顺时针旋转形成双螺旋结构，DNA变性或变为单链DNA(ssDNA)时，DNA以无规则螺旋形式存在，分子结构有很大的可塑性。以前认为不管是抗ds-DNA或抗ss-DNA抗体的检测，用各种不同的哺乳动物或非哺乳动物的DNA都一样，事实并非如此，DNA分子中碱基或顺序的改变会导致抗原决定簇的改变，抗体识别的表位也不同，DNA抗原的来源不同会影响抗DNA抗体的检测结果。固相试验如ELISA法检测的抗体包括低亲和性和高亲和性的抗体，而液相试验如Farr试验只能测定到高亲和性的抗DNA抗体，这也是ELISA法的敏感性高于放免法的原因[3]。
, 百拇医药
我们比较了放免法和金斑法检测抗DNA抗体的敏感性和特异性。前者的敏感性、特异性分别为73.2%和76.7%，后者的敏感性和特异性分别为68.3%和83.1%，两种方法检测结果间没有显著性差异。国内侯氏[4]等比较了金斑法和马疫锥虫间接免疫荧光法(IHF)检测抗ds-DNA抗体，结果表明29例SLE中前法18例阳性(62.07%)，而后法17例阳性(58.62%)，两者阳性符合率为94.4%，显著高于金斑法和放免法的阳性符合率66.7%(P<0.05)。
许多抗DNA抗体在分子重链恒定区含带正电荷的精氨酸，它不仅能和DNA结合，还能与带负电的抗原结合。抗DNA抗体能和肾小球基底膜上带负电荷的物质结合造成肾脏损害，抗体反应的强弱及在肾小球上的沉积量与肾炎的严重性相关。相关分析显示抗DNA抗体与24小时尿蛋白定量间有显著正相关。SLE治疗1个月后抗DNA抗体显著下降(P<0.01)，仅1例患者抗DNA抗体水平上升，而SLAM评分下降。有报道抗ds-DNA抗体和SLAM间有显著正相关，但和SLE疾病活动性指数间不相关[5]，但本研究未发现抗DNA抗体和SLAM间的相关。抗DNA抗体治疗后虽显著下降，而24小时尿蛋白定量没有明显下降，表明抗体的下降与尿蛋白定量下降不平行，进一步证实了抗DNA抗体在狼疮肾损中的作用。为此，美国国立卫生研究院将抗ds-DNA抗体滴度的升高作为狼疮性肾炎的活动指标之一。
, 百拇医药
**南京市科委资助项目部分
参考文献
[1] 鲍春德，等.风湿病学杂志 1996；2：62.
[2] Liang MH， et al.Arthritis Rheum 1989；32：1107.
[3] 孙凌云编著.分子风湿病学.呼和浩特：内蒙古人民出版社，1997；203.
[4] 侯丽艳，等.风湿病学杂志 1997；4：30.
[5] Holcombe RF， et al.Lupus 1994；3：97.
(1998年8月29日收稿 1999年1月10日修回), http://www.100md.com