异丙肾上腺素对大鼠内皮素基因表达的影响
作者：于 波 李述峰 孙 辉
单位：哈尔滨医科大学第二临床医学院，黑龙江 哈尔滨 150086
关键词：异丙肾上腺素；基因表达；内皮素
中国地方病学杂志990606
[摘要] 目的 探讨异丙肾上腺素(ISP)对内皮素基因表达的影响。方法 通过ISP心肌损伤模型，用放免及分子生物学的方法测定血浆内皮素-1(ET-1)放免活性及心肌和主动脉ET-1 mRNA的表达。结果 ISP致血浆中ET-1放免活性明显升高，使心肌及主动脉ET-1 mRNA高表达。结论 表明ISP使血管内皮细胞ET-1 mRNA高表达，内皮素分泌增多可能是其致心肌损伤的一个重要原因。
[中图分类号]Q23;R91;R542.2 [文献标识码] A [文章编号]1000-4955(1999)06-0419-03
, 百拇医药
Effects of ISP on the expression of rat endothelin gene
YU Bo,LI Shu-feng,SUN Hui
(The second Hospital of Harbin Medical University.Harbin 150086,China)
[Abstract] Objective The relationship between isoproterenol and the rat endothelin gene expression had been studied in this article.Methods In ISP myocardial damage model,the plasma radio-immuno activity of ET-1 and ET-1 mRNA expression in myocardium and aorta were determined by means of radio-immuno logy and molecular biology techniques.Results ISP can increase the radio-immuno activity in rat plasma and induce high expression of ET-1 mRNA in myocardium and aorta.Conclusions The results revealled that ISP can induce ET-1 mRNA high expression in endothelial cells.The increased ET-1 secretion may be an important mechanism in ISP induced myocardial damage.
, 百拇医药
[Key words] Isoproterenol;Gene Expression;Endothelin
异丙肾上腺素(ISP)是一种人工合成的儿茶酚胺。人们常用其制作心肌损伤模型，但其致心肌损伤作用的机制还不清楚。血管内皮细胞功能的改变在ISP心肌损伤中的作用未见报道。我们用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测了大鼠心肌及主动脉中内皮素-1 mRNA的表达情况，旨在研究在ISP心肌损伤中ET-1升高的原因，进一步阐明其在心肌损伤中的可能作用。
1 材料与方法
1.1 动物及动物模型 实验采用Wister大鼠(体重180～230g)，雌雄各半。将动物随机分成两组，即异丙肾上腺素(ISP)组和对照组。每个实验组动物数量为12只。ISP组皮下注射ISP10mg/kg,每天一次，连续两天，末次给药后18小时，颈椎脱臼处死动物，经股动脉采血，并立即取出心脏及主动脉进行相关检查。
, 百拇医药
1.2 心肌脂质过氧化物的代谢产物(MDA)含量的测定 用硫代巴比妥酸TBA荧光微量法测定血及心肌中MDA含量，使用的激发光波长为515nm，发射光波长为553nm。
1.3 大鼠血浆中ET-1活性测定 本实验采用125I标记的均相竞争法直接测定血浆ET-1活性。ET-1放免药盒，由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供，测定严格按照其说明操作。
1.4 总RNA提取 取出置于液氮内冻存的左心室和主动脉，按美国Gibico公司提供的药盒说明的步骤提取总RNA。
1.5 逆转录反应 采用美国Promega公司的逆转录药盒，操作按盒内说明进行。
1.6 定量PCR 本实验所用引物均由美国合成。引物序列为ET-1[1]：
, 百拇医药
5′-AACCATGGATTATTTGCTCATG-3′、5′-AGTGTTGACCCAAATGATGTC-3′。
参照文献报道方法[2]做定量PCR：取1/10体积(7μl)逆转录液依次加入200μmol/L dNTP、50μmol/L寡聚核苷酸引物、0.5μCi [α-32P]dCTP(北京福瑞公司)、1×缓冲液和2.5U Taq DNA聚合酶，总反应体积100μl进入PCR循环，ET-1 PCR所需的变性、退火和延伸温度分别为92℃、45℃、72℃；反应时间分别为1、2、3分钟，共进行35个循环，首次循环前先在94℃变性2分钟，最后一轮循环后在72℃延伸10分钟。反应完毕取10μl PCR反应物行1%琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下切取含PCR产物的凝胶条带，用液体闪烁计数仪测定扩增物32P的放射强度。
1.7 数据处理 结果以
±s表示，用t检验作统计学分析处理。
, 百拇医药
2 结果
放免结果显示，ISP组血浆ET-1水平明显高于对照组，差异极显著(P<0.01)，心肌及血浆中MDA含量明显高于对照组，差异显著(P<0.01)(表1)。ISP可使心肌和主动脉ET-1 mRNA表达明显增高(P<0.01)(表2)。
表1 ISP对大鼠血浆ET-1、血浆及心肌中MDA含量的影响 组
n
血浆
心肌
ET-1
(pg/ml)
MDA
(nmol/ml)
, 百拇医药
MDA
(nmol/100mg.pr)
对照
ISP
12
12
2.25±0.32
6.28±0.74*
6.04±0.61
10.82±0.84*
425.86±91.40
564.08±94.16
, 百拇医药
注：*与对照组比较，P<0.01表2 ISP对大鼠心肌和主动脉ET-1 mRNA表达的影响 组
n
ET-1 mRNA(cpm)
心肌
主动脉
对照
ISP
5
5
516±62
822±74
473±48
, 百拇医药
692±60*
注：*与对照组比较，P<0.01
3 讨论
血管内皮细胞不仅是重要的屏障和半透膜，而且是活跃的代谢库和重要的内分泌组织。通过合成和分泌多种生物活性物质调节血管壁通透性、血管紧张度、血小板凝集、血管壁增殖等，在血栓形成、动脉粥样硬化、免疫排斥反应以及在缺血再灌注损伤等病理过程中都有重要作用。内皮素(ET)是由内皮细胞合成和分泌的具有迄今最强的血管收缩作用的缩血管多肽，人们推测它可能在缺血性心肌损伤中起重要作用，急性心肌梗塞患者血中ET浓度明显高于正常人，且与心梗的严重程度呈正相关[3]。用抗ET抗体血清、ET受体拮抗剂后，心梗面积明显缩小[4]。实验结果提示，大剂量ISP可使内皮细胞释放ET-1增加约为对照组的3倍(P<0.01)，且ISP使心肌及主动脉内的ET-1 mRNA表达明显增高，表明ISP使ET-1增加是通过直接刺激ET-1 mRNA的表达来实现的。ET可能参与ISP心肌损伤作用。血管内皮细胞对自由基非常敏感。而且ISP致心肌损伤与自由基有关。有人研究[5]认为ISP的心肌细胞毒性作用主要是由于ISP自动氧化过程中所产生的氧自由基造成的。按此学说，自动氧化产生的自由基将首先损害血管内皮细胞。本实验结果ISP组大鼠血浆及心肌中MDA含量明显高于对照组，证明ISP致心肌损伤确有自由基参与。综上所述，在ISP致心肌损伤模型中，ET-1 mRNA过表达使内皮细胞合成、分泌ET-1增多可能参与心肌损伤的过程，加重心肌损伤。
, 百拇医药
参考文献
[1] 温进坤，张晨辉，姚阿卿，等.内皮素基因的克隆与表达调控研究[J].北京医科大学学报，1994，26(增刊)：24.
[2] Ungerer M,bohm M,Elce JS,et al.Altered expression of β1-adrengeric receptor kinase and β-adrenergic receptor in the failing human heart[J].Circulation,1993,87:454.
[3] Hynes WG,Webb DJ.The endothelin family of peptides:local hormones with diverse roles in health and disease[J].Clin Sci,1993,84(5):485.
[4] Tomoda H,cononary thrombolysis and endothelin-1 release[J].Angiology (Jvasc Dis),1993,44(6):44.
[5] Ohtalt et al.Mechanism of the protective action of taurine against Isoprenaline induced myocardial damage[J].Cardiovasc Res,1988,22(3):407., http://www.100md.com
单位：哈尔滨医科大学第二临床医学院，黑龙江 哈尔滨 150086
关键词：异丙肾上腺素；基因表达；内皮素
中国地方病学杂志990606
[摘要] 目的 探讨异丙肾上腺素(ISP)对内皮素基因表达的影响。方法 通过ISP心肌损伤模型，用放免及分子生物学的方法测定血浆内皮素-1(ET-1)放免活性及心肌和主动脉ET-1 mRNA的表达。结果 ISP致血浆中ET-1放免活性明显升高，使心肌及主动脉ET-1 mRNA高表达。结论 表明ISP使血管内皮细胞ET-1 mRNA高表达，内皮素分泌增多可能是其致心肌损伤的一个重要原因。
[中图分类号]Q23;R91;R542.2 [文献标识码] A [文章编号]1000-4955(1999)06-0419-03
, 百拇医药
Effects of ISP on the expression of rat endothelin gene
YU Bo,LI Shu-feng,SUN Hui
(The second Hospital of Harbin Medical University.Harbin 150086,China)
[Abstract] Objective The relationship between isoproterenol and the rat endothelin gene expression had been studied in this article.Methods In ISP myocardial damage model,the plasma radio-immuno activity of ET-1 and ET-1 mRNA expression in myocardium and aorta were determined by means of radio-immuno logy and molecular biology techniques.Results ISP can increase the radio-immuno activity in rat plasma and induce high expression of ET-1 mRNA in myocardium and aorta.Conclusions The results revealled that ISP can induce ET-1 mRNA high expression in endothelial cells.The increased ET-1 secretion may be an important mechanism in ISP induced myocardial damage.
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[Key words] Isoproterenol;Gene Expression;Endothelin
异丙肾上腺素(ISP)是一种人工合成的儿茶酚胺。人们常用其制作心肌损伤模型，但其致心肌损伤作用的机制还不清楚。血管内皮细胞功能的改变在ISP心肌损伤中的作用未见报道。我们用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测了大鼠心肌及主动脉中内皮素-1 mRNA的表达情况，旨在研究在ISP心肌损伤中ET-1升高的原因，进一步阐明其在心肌损伤中的可能作用。
1 材料与方法
1.1 动物及动物模型 实验采用Wister大鼠(体重180～230g)，雌雄各半。将动物随机分成两组，即异丙肾上腺素(ISP)组和对照组。每个实验组动物数量为12只。ISP组皮下注射ISP10mg/kg,每天一次，连续两天，末次给药后18小时，颈椎脱臼处死动物，经股动脉采血，并立即取出心脏及主动脉进行相关检查。
, 百拇医药
1.2 心肌脂质过氧化物的代谢产物(MDA)含量的测定 用硫代巴比妥酸TBA荧光微量法测定血及心肌中MDA含量，使用的激发光波长为515nm，发射光波长为553nm。
1.3 大鼠血浆中ET-1活性测定 本实验采用125I标记的均相竞争法直接测定血浆ET-1活性。ET-1放免药盒，由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供，测定严格按照其说明操作。
1.4 总RNA提取 取出置于液氮内冻存的左心室和主动脉，按美国Gibico公司提供的药盒说明的步骤提取总RNA。
1.5 逆转录反应 采用美国Promega公司的逆转录药盒，操作按盒内说明进行。
1.6 定量PCR 本实验所用引物均由美国合成。引物序列为ET-1[1]：
, 百拇医药
5′-AACCATGGATTATTTGCTCATG-3′、5′-AGTGTTGACCCAAATGATGTC-3′。
参照文献报道方法[2]做定量PCR：取1/10体积(7μl)逆转录液依次加入200μmol/L dNTP、50μmol/L寡聚核苷酸引物、0.5μCi [α-32P]dCTP(北京福瑞公司)、1×缓冲液和2.5U Taq DNA聚合酶，总反应体积100μl进入PCR循环，ET-1 PCR所需的变性、退火和延伸温度分别为92℃、45℃、72℃；反应时间分别为1、2、3分钟，共进行35个循环，首次循环前先在94℃变性2分钟，最后一轮循环后在72℃延伸10分钟。反应完毕取10μl PCR反应物行1%琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下切取含PCR产物的凝胶条带，用液体闪烁计数仪测定扩增物32P的放射强度。
1.7 数据处理 结果以
±s表示，用t检验作统计学分析处理。, 百拇医药
2 结果
放免结果显示，ISP组血浆ET-1水平明显高于对照组，差异极显著(P<0.01)，心肌及血浆中MDA含量明显高于对照组，差异显著(P<0.01)(表1)。ISP可使心肌和主动脉ET-1 mRNA表达明显增高(P<0.01)(表2)。
表1 ISP对大鼠血浆ET-1、血浆及心肌中MDA含量的影响 组
n
血浆
心肌
ET-1
(pg/ml)
MDA
(nmol/ml)
, 百拇医药
MDA
(nmol/100mg.pr)
对照
ISP
12
12
2.25±0.32
6.28±0.74*
6.04±0.61
10.82±0.84*
425.86±91.40
564.08±94.16
, 百拇医药
注：*与对照组比较，P<0.01表2 ISP对大鼠心肌和主动脉ET-1 mRNA表达的影响 组
n
ET-1 mRNA(cpm)
心肌
主动脉
对照
ISP
5
5
516±62
822±74
473±48
, 百拇医药
692±60*
注：*与对照组比较，P<0.01
3 讨论
血管内皮细胞不仅是重要的屏障和半透膜，而且是活跃的代谢库和重要的内分泌组织。通过合成和分泌多种生物活性物质调节血管壁通透性、血管紧张度、血小板凝集、血管壁增殖等，在血栓形成、动脉粥样硬化、免疫排斥反应以及在缺血再灌注损伤等病理过程中都有重要作用。内皮素(ET)是由内皮细胞合成和分泌的具有迄今最强的血管收缩作用的缩血管多肽，人们推测它可能在缺血性心肌损伤中起重要作用，急性心肌梗塞患者血中ET浓度明显高于正常人，且与心梗的严重程度呈正相关[3]。用抗ET抗体血清、ET受体拮抗剂后，心梗面积明显缩小[4]。实验结果提示，大剂量ISP可使内皮细胞释放ET-1增加约为对照组的3倍(P<0.01)，且ISP使心肌及主动脉内的ET-1 mRNA表达明显增高，表明ISP使ET-1增加是通过直接刺激ET-1 mRNA的表达来实现的。ET可能参与ISP心肌损伤作用。血管内皮细胞对自由基非常敏感。而且ISP致心肌损伤与自由基有关。有人研究[5]认为ISP的心肌细胞毒性作用主要是由于ISP自动氧化过程中所产生的氧自由基造成的。按此学说，自动氧化产生的自由基将首先损害血管内皮细胞。本实验结果ISP组大鼠血浆及心肌中MDA含量明显高于对照组，证明ISP致心肌损伤确有自由基参与。综上所述，在ISP致心肌损伤模型中，ET-1 mRNA过表达使内皮细胞合成、分泌ET-1增多可能参与心肌损伤的过程，加重心肌损伤。
, 百拇医药
参考文献
[1] 温进坤，张晨辉，姚阿卿，等.内皮素基因的克隆与表达调控研究[J].北京医科大学学报，1994，26(增刊)：24.
[2] Ungerer M,bohm M,Elce JS,et al.Altered expression of β1-adrengeric receptor kinase and β-adrenergic receptor in the failing human heart[J].Circulation,1993,87:454.
[3] Hynes WG,Webb DJ.The endothelin family of peptides:local hormones with diverse roles in health and disease[J].Clin Sci,1993,84(5):485.
[4] Tomoda H,cononary thrombolysis and endothelin-1 release[J].Angiology (Jvasc Dis),1993,44(6):44.
[5] Ohtalt et al.Mechanism of the protective action of taurine against Isoprenaline induced myocardial damage[J].Cardiovasc Res,1988,22(3):407., http://www.100md.com