脑溢安对实验性大鼠脑出血继发性脑缺血损伤的保护作用
作者：何 纲 黎杏群 梁清华 李学文 张花先 徐锡萍
单位：(附属湘雅医院中西医结合研究所 长沙 410008)
关键词：中药；脑出血；脑缺血；一氧化氮合酶*；超微结构；放射免疫测定；大鼠
提要 采用胶原酶诱导大鼠脑出血模型
提要 采用胶原酶诱导大鼠脑出血模型，以3H-精氨酸转化测定法检测血肿周围缺血脑组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性，并用电镜观察其病理改变，以探讨脑溢安颗粒(简称脑溢安)治疗脑出血的作用机制。结果显示：脑溢安明显抑制脑组织iNOS活性(P<0.01)，改善脑组织水肿、细胞变性和坏死等神经病理改变。提示脑溢安对脑出血继发性脑缺血损伤具有保护作用，其机制可能与其抑制iNOS活性有关。
, http://www.100md.com 中国图书分号 R743.34
Protection of naoyi-an granule in ischemic brain injury seconda ry
to intracerebral hemorrhage in rats
He Gang, Li Xingqun, Liang Qinghua, et al
(Institute of Combined Traditional Chinese and Western Medicine, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
Aim: To explore the protective effect and its mechanism of the traditional Chinese medicine complex, naoyi-an granule(NYAG), on intracerebral hemorrha ge(ICH) in rats. Methods: Collagenase-induced ICH rats were used. Inducible nit ricoxide synthase(iNOS) activity of ischemic cerebral cortex surrounding the in tracerebral hematoma was assayed by monitoring the conversion of L-3H-ar ginine to L-3H-citrulline. Pathologic changes in the same area were obse rved with transmission electron microscope on the 2nd day, the 4th day and the 7 th day after ICH. Results: The iNOS activities of NYA-treated group decreased remarkably(P<0.01) compared with those of the saline-treated group. Ultrastr uctural observation also indicated that NYAG ameliorated the brain edema, cell degeneration and necrosis. Conclusions: The inhibitory effect of NYAG on iNOS activity may be related to its protection against ischemic brain injury secondary to ICH.
, 百拇医药
Key words Chinese meteria medica; intracerebral hemorrhage; cerebral ischemia; nitric oxide synthase*; ultrastructure; radioimmunoassay; rats
一氧化氮(nitric oxide, NO)是一种具有自由基性质、结构简单的小分子气体。体内左型精氨酸(L-arginine)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase , NOS)催化下，与分子氧反应生成胍氨酸和NO。NOS可分为两种类型：原生型NOS(constitutive NOS,cNOS)和诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)。NO在神经系统中具有两重作用：一方面作为信号传递分子在信息传递中起作用；另一方面参与神经毒性作用[1]。由于NO本身极不稳定，半衰期仅3～5s，故多数有关NO作用的研究均来自于对NOS的研究。近来，许多实验表明NO在缺血性脑损伤中起重要作用。有关NO与脑出血的病理关系及中药干预的研究尚少见报道。本实验通过大鼠脑出血模型，观察脑溢安颗粒(简称脑溢安)对脑出血后不同时间缺血脑组织iNOS活性及超微结构的影响，旨在探讨该方对脑出血继发性脑缺血损伤的保护作用及其可能的作用机制。
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1 材料与方法
1.1 材料与试剂 健康成年Wistar大鼠，雌雄不限，体重(210±18)g。由本校实验动物中心提供。Ⅶ型胶原酶，戊巴比妥钠，为Sigma公司产品。考马斯亮蓝G250，为Fluka公司产品。NOS检测试剂盒由中国医学科学院药理所提供。其它常用试剂为国产分析纯。脑溢安颗粒，由湘雅医院药剂科提供其干浸膏。用蒸馏水配制成浓度为0.654g.ml-1的药液备用。
1.2 方法
1.2.1 脑出血模型 参照Rosenberg等[2]方法。根据大鼠脑立体定位坐标[3]确定右侧内囊位置为：前囟后1.90mm，矢状缝向右3.20mm，深5.60mm。大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠(每公斤体重40mg)麻醉，在立体定位仪(SN-3型，日本产)导引下向右侧内囊注入含0.5U胶原酶(Ⅶ型)的生理盐水1μl。假手术大鼠仅注入1μl生理盐水。均于术后4h观察神经症状。
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1.2.2 动物分组与给药 82只大鼠随机分为假手术组10只，正常对照取假手术组对侧脑组织。模型+生理盐水组(简称盐水组)及模型+脑溢安组(简称脑溢安组)均36只(各组分术后2d，4d和7d三个时间点，均为12只)。给药途径：从术前2h开始至实验完毕止，脑溢安组与盐水组分别给予脑溢安药液或生理盐水灌胃，每天2次，每次2ml(剂量为每公斤体重2.58g，相当70kg成人体重剂量的6倍)。假手术大鼠不作任何治疗。
1.2.3 电镜标本取材、制样及观察 实验完毕后分别从盐水组和脑溢安组各时间点(假手术组于术后2d)随 机取出4只大鼠，戊巴比妥钠深度麻醉后经主动脉灌注磷酸盐缓冲生理盐水(PBS0.01mol.L-1,pH7.4) 50ml冲洗血管，继之以200ml磷酸缓冲液(PB，0.1mol.L-1，pH7.4)配制的含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合固定液灌注固定脑组织。然后，于血肿边缘右上角(相当于尾壳核区)取2mm×1mm×1mm大小的脑皮层组织作为电镜标本。先后经2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定，丙酮梯度脱水，Epon812包埋，LKB8800超薄切片机切片，醋酸铀和醋酸铅双重染色，日立H-600透射电镜观察，并照相记录观察结果。
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1.2.4 脑组织iNOS活性测定 在各时间点断头处死各组剩余动物，迅速取脑，冰盘内切取一块与电镜标本相同部位的脑皮质，质量约100mg。滤纸吸干后置液氮中冻存待测。采用3H-L-精氨酸转化测定法[4]试剂盒测定iNOS活性。检测过程如下：用液体闪烁计数仪(FJ-2107P型，西安二六二厂产)测定样品的放射活性，求出3H-胍氨酸的生成量，结合样品NOS提取液中的蛋白质浓度(考马斯亮蓝G250染色法测定)计算出iNOS的比活性。以每分钟每毫克蛋白质生成的3H-胍氨酸的pmol数表示(pmol.mg-1.min-1)。
1.3 统计学分析 实验数据用
±s表示，均数间比较用t检验。
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2 结 果
2.1 大鼠脑内血肿及神经机能观察结果 大鼠均在术后30min左右清醒。4h后观察其行为改变，模型鼠均出现明显左侧肢体偏瘫、旋转爬行或拖步行走。取脑时肉眼观察见右侧内囊周围形成局限性血肿，符合文献[2]报告，表明模型制作成功。假手术大鼠未出现上述神经缺损症状，颅内未见血肿形成，可排除脑出血。
附表 大鼠脑出血后脑组织iNOS活性变化及脑溢安的抑制作用(±s)
组别
n
iNOS活性(pmol.mg-1.min-1)
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2d
4d
7d
非脑出血
12
29.1±7.3
对照组
生理盐水组
24
60.3±12.1①②
82.8±9.5①②
55 .2±12.3①②
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脑溢安组
24
49.8±7.4①③
56.5±8.3①③
30. 6±7.1③
①与非脑出血对照组比较P<0.01；②盐水组内与第4d比较P<0.01；③与生理盐水组相应时间点比较P<0.01
2.2 大鼠脑出血后脑组织iNOS活性变化及脑溢安的抑制作用 假手术组和正常对照组脑皮质iNOS活性分别为(29.6±6.4)pmol.mg-1.min-1和(28.6±8.2)pmol.mg-1.min-1(n均=6)，两组比较无明显差异(P>0.05)，故合并作为非脑出血对照组，合并后的iNOS活性为(29.1±7.3)pmol.mg-1.min-1(n=12)。与上述合并后的对照组相比，盐水组各时间点的脑皮质iNOS活性均明显 升高(P均<0.01)，第4d达峰值；脑溢安组术后2d和4d的 脑皮质iNOS活性也明显升高(P<0.01)，但至术后7d时已无明显差异(P>0.05)。脑溢安组各时间点的脑皮质iNOS活性均较盐水组相应时间点显著降低(P均<0.01)(附表)。
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附图 大鼠大脑皮质超微结构 1.盐水组2d 神经元细胞核(N)明显水肿，核浓缩，染色质边集(↓)，胞浆内出现裂隙(*)，神经元周围星形胶质细胞足突(△)明显水肿 ×8000 2.盐水组4d 微血管(Mv)周围明显水肿，血管周星形胶质细胞突起(△)高度水肿 ×10000 3.盐水组7d 神经元(N)肿胀变性，核仁不清，核染色质溶解。胞质结构疏松，形成大量空泡(V) ×6000 4.脑溢安组2d 神经元轻度肿胀，胞质结构疏松，出现裂隙(*) ×6000 5.脑溢安组4d 神经元胞核基本正常，核仁清楚，核染色质清晰。微血管(Mv)周轻度水肿，×6000 6.脑溢安组7d 神经元(N)，神经胶质细胞(G)结构趋于正常，血管(Mv)及血管周未见异常 ×4000
Fig. The ultrastructural changes in rat cerebral cortex 1. two days after saline treatment, showing obvious edema neuron(N), karyopyknosis, nu clear chromatin margination(↓), many clefts(*) appeared in the neuronal cytopla sm. Peri-neuronal astrocytic processes(△) moderately swelling ×6000 2. four days after saline treatment, showing severe hydrops around microvessels(Mv), perivascular astrocytic processes(△) markedly swollen ×10000 3. seven days a fter saline treatment, showing hydropic degeneration neuron(N), unclear nucleole, chromatolysis, sparseness and many vacuole(V) in the cytoplasm ×6000 4. two days after MYAG treatment, showing mild edema neuron(N), sparseness and clefts (*) appeared in the cytoplasm ×6000 5. four days after MYAG treatment, showi ng mainly normal structure of neuron(N), clear nucleole and nuclear chromatin. slightly swelling around microvessels(Mv) ×6000 6. seven days after NYAG trea tment, showing mainly normal structure of neuron(N) and gliacyte(G), no abnormal ity appeared in the microvessel and perivascular space ×4000
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2.3 各组大鼠脑组织细胞超微结构改变及脑溢安的影响 正常对照组大鼠神经元细胞核大而圆，核仁明显，核染色质分布均匀，胞质中细胞器丰富。神经胶质细胞核圆，周边未见异常，结构正常。血管及血管内皮细胞结构正常(电镜下见血管腔扩大系因血管冲洗、灌注所致)，血管管周未见渗出液(图略)。假手术对照大鼠大脑皮质中，各类细胞超微结构正常(图略)。盐水组2d：大脑皮质明显水肿。神经元胞体核浓缩，核染色质凝集呈块状分布，染色质边集。胞浆基质疏松变淡，细胞器肿胀、空泡变性或扩张成不规则的腔隙或消失。神经胶质细胞突起肿胀。微血管管周水肿明显(附图之1)。盐水组4d：神经细胞内外严重水肿，核固缩，核仁不清，核染色质溶解。胞质疏松、空泡化。神经毡中的胶质突起水肿破裂。血管周围胶质细胞突起高度肿胀或破裂。微血管内皮细胞肿胀或坏死，血管周围脑组织间隙大量水肿集液(附图之2)。盐水组7d：神经细胞肿胀变性，核膜层次模糊，核仁不清，核染色质溶解。胞质中细胞器疏松，空泡化。神经胶质细胞及微血管管周轻度肿胀(附图之3)。脑溢安组2d：神经元胞体轻度肿胀，核膜完整，核仁清楚，核染色质疏松。胞质中细胞器疏松，可见裂隙。神经胶质细胞突起及微血管管周轻度肿胀(附图之4)。脑溢安组4d：神经元胞体核仁清晰，核染色质分布均匀。胞质中细胞器较丰富。神经毡轻度肿胀。神经胶质细胞突起肿胀不明显。部分血管管周轻度水肿(附图之5)。脑液安组7d：神经细胞、神经胶质细胞及微血管结构趋于正常，细胞内外未见水肿(附图之6)，见附图。
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3 讨 论
近年来的实验性脑出血研究表明，脑出血血肿形成后，血肿周围组织迅速出现深度和广泛的脑缺血。神经机能的损害可能主要由这种继发性脑缺血所致[5]。因此，探讨脑出血的病理生理机制，研究阻断或减少脑出血继发性脑缺血损伤的药物，将为脑出血治疗提供新思路和开辟新途径。
脑溢安颗粒是我所研制的中药三类新药，由羚羊角、钩藤、生地黄、大黄、三七、天竺黄等药物组成。功能为平肝熄风，凉血泻火，行血化痰，主治急性脑出血肝阳化风证和痰热腑实证(相当于病情轻型和中型)。临床疗效显著[6]。药效学研究显示：①脑溢安颗粒使出血性中风大鼠爬行计分下降，旋转时间延长，肢体活动和平衡机能改善；促进脑血肿吸收，减轻脑血肿周围组织水肿和缺血脑组织神经细胞的损害[7]。②脑溢安颗粒能使动脉粥样硬化合并脑出血兔的偏瘫记分下降，促进肢体活动机能改善；减轻脑水肿；降低兔脑组织丙二醛(MDA)含量和增加超氧化物歧化酶(SOD)活力，减轻由继发性缺血的氧自由基引起的脂质过氧化反应脑损害；并能减轻兔脑组织去甲肾上腺素(NE)含量，使脑出血的应激状态改善[8]；但其作用机制尚待阐明。
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本文观察到内囊注射胶原酶诱导大鼠脑出血后2～7d，血肿周围缺血脑组织iNOS活性水平显著高于脑出血前水平，第4d达到峰值。超微结构也显示神经细胞、胶质细胞及微血管管周肿胀。出现神经细胞核浓缩，染色质边集，核溶解，细胞器肿胀、结构不清或空泡变性等细胞缺血或变性甚至坏死的改变。表明脑细胞损伤与iNOS活性增高有关。Iadecola等[9]研究发现，高血压大鼠大脑中动脉阻断(MACO)致 局灶性脑缺血后2～4d,iNOS活性明显增加，第7d时下降至正常。本实验中iNOS活性时相变化与之类似，但峰值出现时间较晚(脑出血后4d)，持续时间也更长(脑出血后7d)。推测其原因可能是2～4d时血肿内血块收缩崩解，颅内压降低，可能形成再灌注损伤，且纤维蛋白酶参与了脑出血后脑水肿形成[10]，进一步导致细胞因子等释放、胶质细胞增生及单核巨噬系统激活，从而持续大量表达iNOS。iNOS由DNA转录调节，该酶一旦合成则不断产生NO[11]。大量的NO对缺血脑细胞具有毒性作用，能明显扩大缺血区范围，加重脑水肿[9，12]。此外，笔者曾采用NADPH-黄递酶(NADPH-diaphorase,NDP)组化技术，首次观察到实验性大鼠脑出血导致大脑皮质内锥形神经元、皮质内和皮质下星形胶质细胞和血管内皮细胞，以及血肿周围的多形核细胞NOS的表达[13]。故推测：像脑缺血[9，12]一样，脑出血后血肿周围缺血区域多种细胞内iNOS合成增加，产生过多的NO，在脑出血后继发性脑缺血损伤中发挥细胞毒作用。
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本实验应用脑溢安治疗7d，发现可明显抑制脑出血大鼠脑组织的iNOS活性。电镜观察也显 示脑水肿明显减轻，脑细胞超微结构损伤逐渐减轻并趋于正常。进一步支持脑组 织iNOS活性增强与神经病理形态变化有着平行关系。本室以往研究[13]表明，脑溢安通过选择性抑制脑出血大鼠脑内神经元及星形胶质细胞内NOS的诱生而发挥神经保护作用。此外，许长庆等[14]研究表明，活血化瘀药物“三七”的有效成分三七总皂甙通过抑制NOS活性，降低NO含量而对脑缺血大鼠有保护作用。从单味药物有效成份角度为本方的作用机制提供了依据。故认为，脑溢安可能是通过抑制iNOS活性、减少NO生成量，从而减轻NO自由基对缺血脑组织细胞结构的损伤而对脑出血继发脑缺血损伤具有保护作用。
脑出血后继发性脑缺血损伤与单纯脑缺血损伤是否具有相同的病理生理机制或介质，如iNOS和NO，尚待更多的研究加以证实。另外，脑出血时iNOS表达的细胞定位和分子机制，以及脑溢安对iNOS活性抑制作用是在转录和/或翻译水平起作用等问题，将是今后的研究方向。
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致谢：感谢学院电镜室曾庆善教授、神经生物学研究室罗学港教授指导电镜观察 和结果分析。
参 考 文 献
1 Dawson TM, Dawson VL, Synder SH. A novel neuronal messenger molecule in brain: The free radical, nitric oxide. Ann Neurol, 1992,32(3):297～3 11
2 Rosenberg GA, Mun-Bryce S, Wesley M, et al. Collagenase induced intracer ebral hemorrhage in rawts. Stroke, 1990,21(5):801～807
3 Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed, Sydney : Academic Press, 1986:Fig25～Fig26
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4 强文安，刘捷，吕芳玲，等.3H-精氨酸转化测定一氧化氮合酶活性.中华医学 杂志，1996，76(8)：567～571
5 Mendelow AD. Mechanisms of ischemic brain damage with intracerebral hemorrhage. Stroke, 1993,24(Suppl 1):115～117
6 梁清华，黎杏群.脑溢安颗粒剂与汤剂治疗急性脑溢血临床疗效比较.湖南医科大学学报，1995，20(3)：215～218
7 曾锦旗，金益强，陈泽奇.脑溢安颗粒剂治疗出血性中风大鼠的实验研究.湖南医科大学学报，1995，20(4)：353～356
8 胡随瑜，金益强，王勇华，等.脑溢安颗粒剂主要药效学研究.中药新药与临床药理，1997，8(3)：150～152
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9 Iadecola C, Xu XH, Zhang FY, et al. Marked induction of calcium-independ ent nitric oxide synthase activity after cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab, 1995,15(1):52～59
10 Lee KR, Kawai N, Kim S, et al. Mechanisms of edema formation aft er intracerebral hemorrhage: effects of thrombin on cerebral blood flow, blood brain barrier permeability, and cell survival in a rat model. J Neurosurg, 1997,86(3):272～278
11 Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J, 1 992,6(12):3051～3064
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12 Iadecola C, Zhang FY, Xu XH. Inhibition of inducible nitric oxide synthase a meliorates cerebral ischemic damage. Am J Physiol, 1995,268(37):R286～R292
13 Peng ZC, Li XQ, Liang QH, et al. Induction of NADPH-diaphorase activity in the forebrain in a moldel of intracerebral hemorrhage and its inhibition by the traditional Chinese medicine complex Nao Yi An. Brain Res Bull, 1997,42(2):119～128
14 许长庆，夏作理，史义菊，等.脑缺血后脑组织NO含量和NOS活性变化及三七总皂甙的影响.中国神经精神病杂志，1997，23(2)：77～79, 百拇医药
单位：(附属湘雅医院中西医结合研究所 长沙 410008)
关键词：中药；脑出血；脑缺血；一氧化氮合酶*；超微结构；放射免疫测定；大鼠
提要 采用胶原酶诱导大鼠脑出血模型
提要 采用胶原酶诱导大鼠脑出血模型，以3H-精氨酸转化测定法检测血肿周围缺血脑组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性，并用电镜观察其病理改变，以探讨脑溢安颗粒(简称脑溢安)治疗脑出血的作用机制。结果显示：脑溢安明显抑制脑组织iNOS活性(P<0.01)，改善脑组织水肿、细胞变性和坏死等神经病理改变。提示脑溢安对脑出血继发性脑缺血损伤具有保护作用，其机制可能与其抑制iNOS活性有关。
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to intracerebral hemorrhage in rats
He Gang, Li Xingqun, Liang Qinghua, et al
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Aim: To explore the protective effect and its mechanism of the traditional Chinese medicine complex, naoyi-an granule(NYAG), on intracerebral hemorrha ge(ICH) in rats. Methods: Collagenase-induced ICH rats were used. Inducible nit ricoxide synthase(iNOS) activity of ischemic cerebral cortex surrounding the in tracerebral hematoma was assayed by monitoring the conversion of L-3H-ar ginine to L-3H-citrulline. Pathologic changes in the same area were obse rved with transmission electron microscope on the 2nd day, the 4th day and the 7 th day after ICH. Results: The iNOS activities of NYA-treated group decreased remarkably(P<0.01) compared with those of the saline-treated group. Ultrastr uctural observation also indicated that NYAG ameliorated the brain edema, cell degeneration and necrosis. Conclusions: The inhibitory effect of NYAG on iNOS activity may be related to its protection against ischemic brain injury secondary to ICH.
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Key words Chinese meteria medica; intracerebral hemorrhage; cerebral ischemia; nitric oxide synthase*; ultrastructure; radioimmunoassay; rats
一氧化氮(nitric oxide, NO)是一种具有自由基性质、结构简单的小分子气体。体内左型精氨酸(L-arginine)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase , NOS)催化下，与分子氧反应生成胍氨酸和NO。NOS可分为两种类型：原生型NOS(constitutive NOS,cNOS)和诱导型NOS(inducible NOS,iNOS)。NO在神经系统中具有两重作用：一方面作为信号传递分子在信息传递中起作用；另一方面参与神经毒性作用[1]。由于NO本身极不稳定，半衰期仅3～5s，故多数有关NO作用的研究均来自于对NOS的研究。近来，许多实验表明NO在缺血性脑损伤中起重要作用。有关NO与脑出血的病理关系及中药干预的研究尚少见报道。本实验通过大鼠脑出血模型，观察脑溢安颗粒(简称脑溢安)对脑出血后不同时间缺血脑组织iNOS活性及超微结构的影响，旨在探讨该方对脑出血继发性脑缺血损伤的保护作用及其可能的作用机制。
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1 材料与方法
1.1 材料与试剂 健康成年Wistar大鼠，雌雄不限，体重(210±18)g。由本校实验动物中心提供。Ⅶ型胶原酶，戊巴比妥钠，为Sigma公司产品。考马斯亮蓝G250，为Fluka公司产品。NOS检测试剂盒由中国医学科学院药理所提供。其它常用试剂为国产分析纯。脑溢安颗粒，由湘雅医院药剂科提供其干浸膏。用蒸馏水配制成浓度为0.654g.ml-1的药液备用。
1.2 方法
1.2.1 脑出血模型 参照Rosenberg等[2]方法。根据大鼠脑立体定位坐标[3]确定右侧内囊位置为：前囟后1.90mm，矢状缝向右3.20mm，深5.60mm。大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠(每公斤体重40mg)麻醉，在立体定位仪(SN-3型，日本产)导引下向右侧内囊注入含0.5U胶原酶(Ⅶ型)的生理盐水1μl。假手术大鼠仅注入1μl生理盐水。均于术后4h观察神经症状。
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1.2.2 动物分组与给药 82只大鼠随机分为假手术组10只，正常对照取假手术组对侧脑组织。模型+生理盐水组(简称盐水组)及模型+脑溢安组(简称脑溢安组)均36只(各组分术后2d，4d和7d三个时间点，均为12只)。给药途径：从术前2h开始至实验完毕止，脑溢安组与盐水组分别给予脑溢安药液或生理盐水灌胃，每天2次，每次2ml(剂量为每公斤体重2.58g，相当70kg成人体重剂量的6倍)。假手术大鼠不作任何治疗。
1.2.3 电镜标本取材、制样及观察 实验完毕后分别从盐水组和脑溢安组各时间点(假手术组于术后2d)随 机取出4只大鼠，戊巴比妥钠深度麻醉后经主动脉灌注磷酸盐缓冲生理盐水(PBS0.01mol.L-1,pH7.4) 50ml冲洗血管，继之以200ml磷酸缓冲液(PB，0.1mol.L-1，pH7.4)配制的含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合固定液灌注固定脑组织。然后，于血肿边缘右上角(相当于尾壳核区)取2mm×1mm×1mm大小的脑皮层组织作为电镜标本。先后经2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定，丙酮梯度脱水，Epon812包埋，LKB8800超薄切片机切片，醋酸铀和醋酸铅双重染色，日立H-600透射电镜观察，并照相记录观察结果。
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1.2.4 脑组织iNOS活性测定 在各时间点断头处死各组剩余动物，迅速取脑，冰盘内切取一块与电镜标本相同部位的脑皮质，质量约100mg。滤纸吸干后置液氮中冻存待测。采用3H-L-精氨酸转化测定法[4]试剂盒测定iNOS活性。检测过程如下：用液体闪烁计数仪(FJ-2107P型，西安二六二厂产)测定样品的放射活性，求出3H-胍氨酸的生成量，结合样品NOS提取液中的蛋白质浓度(考马斯亮蓝G250染色法测定)计算出iNOS的比活性。以每分钟每毫克蛋白质生成的3H-胍氨酸的pmol数表示(pmol.mg-1.min-1)。
1.3 统计学分析 实验数据用
±s表示，均数间比较用t检验。, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 大鼠脑内血肿及神经机能观察结果 大鼠均在术后30min左右清醒。4h后观察其行为改变，模型鼠均出现明显左侧肢体偏瘫、旋转爬行或拖步行走。取脑时肉眼观察见右侧内囊周围形成局限性血肿，符合文献[2]报告，表明模型制作成功。假手术大鼠未出现上述神经缺损症状，颅内未见血肿形成，可排除脑出血。
附表 大鼠脑出血后脑组织iNOS活性变化及脑溢安的抑制作用(
±s)组别
n
iNOS活性(pmol.mg-1.min-1)
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2d
4d
7d
非脑出血
12
29.1±7.3
对照组
生理盐水组
24
60.3±12.1①②
82.8±9.5①②
55 .2±12.3①②
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脑溢安组
24
49.8±7.4①③
56.5±8.3①③
30. 6±7.1③
①与非脑出血对照组比较P<0.01；②盐水组内与第4d比较P<0.01；③与生理盐水组相应时间点比较P<0.01
2.2 大鼠脑出血后脑组织iNOS活性变化及脑溢安的抑制作用 假手术组和正常对照组脑皮质iNOS活性分别为(29.6±6.4)pmol.mg-1.min-1和(28.6±8.2)pmol.mg-1.min-1(n均=6)，两组比较无明显差异(P>0.05)，故合并作为非脑出血对照组，合并后的iNOS活性为(29.1±7.3)pmol.mg-1.min-1(n=12)。与上述合并后的对照组相比，盐水组各时间点的脑皮质iNOS活性均明显 升高(P均<0.01)，第4d达峰值；脑溢安组术后2d和4d的 脑皮质iNOS活性也明显升高(P<0.01)，但至术后7d时已无明显差异(P>0.05)。脑溢安组各时间点的脑皮质iNOS活性均较盐水组相应时间点显著降低(P均<0.01)(附表)。
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附图 大鼠大脑皮质超微结构 1.盐水组2d 神经元细胞核(N)明显水肿，核浓缩，染色质边集(↓)，胞浆内出现裂隙(*)，神经元周围星形胶质细胞足突(△)明显水肿 ×8000 2.盐水组4d 微血管(Mv)周围明显水肿，血管周星形胶质细胞突起(△)高度水肿 ×10000 3.盐水组7d 神经元(N)肿胀变性，核仁不清，核染色质溶解。胞质结构疏松，形成大量空泡(V) ×6000 4.脑溢安组2d 神经元轻度肿胀，胞质结构疏松，出现裂隙(*) ×6000 5.脑溢安组4d 神经元胞核基本正常，核仁清楚，核染色质清晰。微血管(Mv)周轻度水肿，×6000 6.脑溢安组7d 神经元(N)，神经胶质细胞(G)结构趋于正常，血管(Mv)及血管周未见异常 ×4000
Fig. The ultrastructural changes in rat cerebral cortex 1. two days after saline treatment, showing obvious edema neuron(N), karyopyknosis, nu clear chromatin margination(↓), many clefts(*) appeared in the neuronal cytopla sm. Peri-neuronal astrocytic processes(△) moderately swelling ×6000 2. four days after saline treatment, showing severe hydrops around microvessels(Mv), perivascular astrocytic processes(△) markedly swollen ×10000 3. seven days a fter saline treatment, showing hydropic degeneration neuron(N), unclear nucleole, chromatolysis, sparseness and many vacuole(V) in the cytoplasm ×6000 4. two days after MYAG treatment, showing mild edema neuron(N), sparseness and clefts (*) appeared in the cytoplasm ×6000 5. four days after MYAG treatment, showi ng mainly normal structure of neuron(N), clear nucleole and nuclear chromatin. slightly swelling around microvessels(Mv) ×6000 6. seven days after NYAG trea tment, showing mainly normal structure of neuron(N) and gliacyte(G), no abnormal ity appeared in the microvessel and perivascular space ×4000
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2.3 各组大鼠脑组织细胞超微结构改变及脑溢安的影响 正常对照组大鼠神经元细胞核大而圆，核仁明显，核染色质分布均匀，胞质中细胞器丰富。神经胶质细胞核圆，周边未见异常，结构正常。血管及血管内皮细胞结构正常(电镜下见血管腔扩大系因血管冲洗、灌注所致)，血管管周未见渗出液(图略)。假手术对照大鼠大脑皮质中，各类细胞超微结构正常(图略)。盐水组2d：大脑皮质明显水肿。神经元胞体核浓缩，核染色质凝集呈块状分布，染色质边集。胞浆基质疏松变淡，细胞器肿胀、空泡变性或扩张成不规则的腔隙或消失。神经胶质细胞突起肿胀。微血管管周水肿明显(附图之1)。盐水组4d：神经细胞内外严重水肿，核固缩，核仁不清，核染色质溶解。胞质疏松、空泡化。神经毡中的胶质突起水肿破裂。血管周围胶质细胞突起高度肿胀或破裂。微血管内皮细胞肿胀或坏死，血管周围脑组织间隙大量水肿集液(附图之2)。盐水组7d：神经细胞肿胀变性，核膜层次模糊，核仁不清，核染色质溶解。胞质中细胞器疏松，空泡化。神经胶质细胞及微血管管周轻度肿胀(附图之3)。脑溢安组2d：神经元胞体轻度肿胀，核膜完整，核仁清楚，核染色质疏松。胞质中细胞器疏松，可见裂隙。神经胶质细胞突起及微血管管周轻度肿胀(附图之4)。脑溢安组4d：神经元胞体核仁清晰，核染色质分布均匀。胞质中细胞器较丰富。神经毡轻度肿胀。神经胶质细胞突起肿胀不明显。部分血管管周轻度水肿(附图之5)。脑液安组7d：神经细胞、神经胶质细胞及微血管结构趋于正常，细胞内外未见水肿(附图之6)，见附图。
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3 讨 论
近年来的实验性脑出血研究表明，脑出血血肿形成后，血肿周围组织迅速出现深度和广泛的脑缺血。神经机能的损害可能主要由这种继发性脑缺血所致[5]。因此，探讨脑出血的病理生理机制，研究阻断或减少脑出血继发性脑缺血损伤的药物，将为脑出血治疗提供新思路和开辟新途径。
脑溢安颗粒是我所研制的中药三类新药，由羚羊角、钩藤、生地黄、大黄、三七、天竺黄等药物组成。功能为平肝熄风，凉血泻火，行血化痰，主治急性脑出血肝阳化风证和痰热腑实证(相当于病情轻型和中型)。临床疗效显著[6]。药效学研究显示：①脑溢安颗粒使出血性中风大鼠爬行计分下降，旋转时间延长，肢体活动和平衡机能改善；促进脑血肿吸收，减轻脑血肿周围组织水肿和缺血脑组织神经细胞的损害[7]。②脑溢安颗粒能使动脉粥样硬化合并脑出血兔的偏瘫记分下降，促进肢体活动机能改善；减轻脑水肿；降低兔脑组织丙二醛(MDA)含量和增加超氧化物歧化酶(SOD)活力，减轻由继发性缺血的氧自由基引起的脂质过氧化反应脑损害；并能减轻兔脑组织去甲肾上腺素(NE)含量，使脑出血的应激状态改善[8]；但其作用机制尚待阐明。
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本文观察到内囊注射胶原酶诱导大鼠脑出血后2～7d，血肿周围缺血脑组织iNOS活性水平显著高于脑出血前水平，第4d达到峰值。超微结构也显示神经细胞、胶质细胞及微血管管周肿胀。出现神经细胞核浓缩，染色质边集，核溶解，细胞器肿胀、结构不清或空泡变性等细胞缺血或变性甚至坏死的改变。表明脑细胞损伤与iNOS活性增高有关。Iadecola等[9]研究发现，高血压大鼠大脑中动脉阻断(MACO)致 局灶性脑缺血后2～4d,iNOS活性明显增加，第7d时下降至正常。本实验中iNOS活性时相变化与之类似，但峰值出现时间较晚(脑出血后4d)，持续时间也更长(脑出血后7d)。推测其原因可能是2～4d时血肿内血块收缩崩解，颅内压降低，可能形成再灌注损伤，且纤维蛋白酶参与了脑出血后脑水肿形成[10]，进一步导致细胞因子等释放、胶质细胞增生及单核巨噬系统激活，从而持续大量表达iNOS。iNOS由DNA转录调节，该酶一旦合成则不断产生NO[11]。大量的NO对缺血脑细胞具有毒性作用，能明显扩大缺血区范围，加重脑水肿[9，12]。此外，笔者曾采用NADPH-黄递酶(NADPH-diaphorase,NDP)组化技术，首次观察到实验性大鼠脑出血导致大脑皮质内锥形神经元、皮质内和皮质下星形胶质细胞和血管内皮细胞，以及血肿周围的多形核细胞NOS的表达[13]。故推测：像脑缺血[9，12]一样，脑出血后血肿周围缺血区域多种细胞内iNOS合成增加，产生过多的NO，在脑出血后继发性脑缺血损伤中发挥细胞毒作用。
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本实验应用脑溢安治疗7d，发现可明显抑制脑出血大鼠脑组织的iNOS活性。电镜观察也显 示脑水肿明显减轻，脑细胞超微结构损伤逐渐减轻并趋于正常。进一步支持脑组 织iNOS活性增强与神经病理形态变化有着平行关系。本室以往研究[13]表明，脑溢安通过选择性抑制脑出血大鼠脑内神经元及星形胶质细胞内NOS的诱生而发挥神经保护作用。此外，许长庆等[14]研究表明，活血化瘀药物“三七”的有效成分三七总皂甙通过抑制NOS活性，降低NO含量而对脑缺血大鼠有保护作用。从单味药物有效成份角度为本方的作用机制提供了依据。故认为，脑溢安可能是通过抑制iNOS活性、减少NO生成量，从而减轻NO自由基对缺血脑组织细胞结构的损伤而对脑出血继发脑缺血损伤具有保护作用。
脑出血后继发性脑缺血损伤与单纯脑缺血损伤是否具有相同的病理生理机制或介质，如iNOS和NO，尚待更多的研究加以证实。另外，脑出血时iNOS表达的细胞定位和分子机制，以及脑溢安对iNOS活性抑制作用是在转录和/或翻译水平起作用等问题，将是今后的研究方向。
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致谢：感谢学院电镜室曾庆善教授、神经生物学研究室罗学港教授指导电镜观察 和结果分析。
参 考 文 献
1 Dawson TM, Dawson VL, Synder SH. A novel neuronal messenger molecule in brain: The free radical, nitric oxide. Ann Neurol, 1992,32(3):297～3 11
2 Rosenberg GA, Mun-Bryce S, Wesley M, et al. Collagenase induced intracer ebral hemorrhage in rawts. Stroke, 1990,21(5):801～807
3 Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed, Sydney : Academic Press, 1986:Fig25～Fig26
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4 强文安，刘捷，吕芳玲，等.3H-精氨酸转化测定一氧化氮合酶活性.中华医学 杂志，1996，76(8)：567～571
5 Mendelow AD. Mechanisms of ischemic brain damage with intracerebral hemorrhage. Stroke, 1993,24(Suppl 1):115～117
6 梁清华，黎杏群.脑溢安颗粒剂与汤剂治疗急性脑溢血临床疗效比较.湖南医科大学学报，1995，20(3)：215～218
7 曾锦旗，金益强，陈泽奇.脑溢安颗粒剂治疗出血性中风大鼠的实验研究.湖南医科大学学报，1995，20(4)：353～356
8 胡随瑜，金益强，王勇华，等.脑溢安颗粒剂主要药效学研究.中药新药与临床药理，1997，8(3)：150～152
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9 Iadecola C, Xu XH, Zhang FY, et al. Marked induction of calcium-independ ent nitric oxide synthase activity after cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab, 1995,15(1):52～59
10 Lee KR, Kawai N, Kim S, et al. Mechanisms of edema formation aft er intracerebral hemorrhage: effects of thrombin on cerebral blood flow, blood brain barrier permeability, and cell survival in a rat model. J Neurosurg, 1997,86(3):272～278
11 Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J, 1 992,6(12):3051～3064
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12 Iadecola C, Zhang FY, Xu XH. Inhibition of inducible nitric oxide synthase a meliorates cerebral ischemic damage. Am J Physiol, 1995,268(37):R286～R292
13 Peng ZC, Li XQ, Liang QH, et al. Induction of NADPH-diaphorase activity in the forebrain in a moldel of intracerebral hemorrhage and its inhibition by the traditional Chinese medicine complex Nao Yi An. Brain Res Bull, 1997,42(2):119～128
14 许长庆，夏作理，史义菊，等.脑缺血后脑组织NO含量和NOS活性变化及三七总皂甙的影响.中国神经精神病杂志，1997，23(2)：77～79, 百拇医药