胰岛细胞bcl-2，PCNA表达与完全 弗氏佐剂预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病的关系①
作者：杨竹林 伍汉文 周智广 廖二元 杨 文
单位：杨竹林(第二附属医院肝胆疾病研究室 长沙 410011)；伍汉文 周智广 廖二元 杨 文(代谢内分泌研究所 长沙 410011)
关键词：胰岛；胰岛炎*；β细胞；完全弗氏佐剂*；bcl-2；蛋白；增殖细胞核抗原*；免疫组织化学；NOD鼠
湖南医科大学学报990630 中国图书分类号 R587
Non-obese diabetic(NOD)小鼠是一种遗传性Ⅰ型糖尿病的啮齿动物模型，它从5周龄起自发地出现自身免疫性胰岛炎，14周龄后可自发Ⅰ型糖尿病[1 ]。NOD鼠糖尿病与人类Ⅰ型糖尿病有许多相似之处[1]。由于NOD鼠糖尿病系一器官特异性自身免疫性疾病，改变其免疫病理过程可能预防胰岛炎和糖尿病的发生。国外一些学者对完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant, CFA)预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病的发生进行了较深入研究[2，3]。bcl-2蛋白能抑制细胞凋亡和延长细胞寿命[4]。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)主要在S期细 胞表达，是一个反映细胞增殖活性的重要指标[5]。CFA预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病 发生是否与胰岛细胞bcl-2，PCNA表达有关未见文献报道。为此，笔者研究了NOD鼠胰 岛细胞bcl-2，PCNA表达及其与CFA预防胰岛炎和糖尿病发生的关系，现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 NOD鼠来自澳大利亚WEHI医学研究中心，由山西医科大学提供。所有小鼠在标准饲养环境下喂养，自由饮净化水及全价营养颗粒饮食。本实验采用的NOD雌鼠群落在30周龄时糖尿病自然发病率为70%。
1.1.2 动物实验 10只4周龄雌鼠随机分成实验组(CFA组)和对照组(生理盐水组，NS组)，每组各5只。CFA组后脚板处注射50μlCFA，NS组注射等量NS。所有NOD鼠发生糖尿病时或30周龄时处死，并按常规取下全胰腺，将全胰置10%中性福尔马林固定24～48h，按常规制成石蜡包埋切片，厚4μm。
1.1.3 主要试剂 CFA由美国生命技术公司提供；鼠抗人bcl-2蛋白、PCNA单克隆抗体，生物素标记羊抗鼠IgG和ABC试剂由Dako公司提供；DAB-HCl由瑞士进口分装。
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1.2 方法 (1)糖尿病检测：从10周龄开始，每周测体重一次，并观察是否有糖尿病症状出现。当出现多饮、多尿、消瘦等症状时，即用断尾法取血测血糖，如随机血糖连续2天≥11.1mmol*L-1时即诊断为糖尿病。血糖测定采用OneTouchⅡ血糖仪。无糖尿病症状鼠30周龄时测血糖后均处死。(2)胰岛炎评分：每例鼠胰腺2张切片(第一张切片后约50μm切第2张切片)常规HE染色，在光镜下随机观察并计数10个胰岛的胰岛炎分值，所得值0分示正常胰岛，1分和2分示胰岛周围炎，3分和4分示胰岛内炎。每只鼠胰平均分值等于10个胰岛总分值除以10，所得值0分示正常胰岛，0.1～2分示胰岛周围炎，2.1～4分示胰岛内炎[6，7]。(3)染色方法：bcl-2和PCNA染色为常规ABC免疫组化法，阳性细胞呈淡棕黄色至深棕黄色颗粒状，以0.01molPBS液(pH7.4)替代一抗、二抗或ABC试剂作为每次染色的阴性对照。高倍镜下每例鼠胰切片随机计数5个胰岛内胰岛细胞总数、bcl-2阳性细胞率(bcl-2阳性细胞数/胰岛细胞总数)及PCNA阳性细胞率(PCNA阳性细胞数/胰岛细胞总数)。(4)统计学处理：采用t检验或直接概率法。
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2 结 果
2.1 胰岛炎发生程度和糖尿病发生情况 30周龄时，NS组5只鼠中有3只发生糖尿病(连续2天血糖值分别为：24.2mmol.L-1和22.4mmol.L-1，16.4mmol.L-1和16.9mmol.L-1，11.1mmol.L-1和11.1mmol.L-1)，其余2只血糖值均<11.1mmol.L-1。5只CFA组鼠无1只发生糖尿病，血糖值均<11.1mmol.L-1。30周龄时两组小鼠均发生胰岛炎，CFA组有4只发生胰岛周围炎和1只发生胰岛内炎，NS组有1只发生胰岛周围炎和4只发生胰岛内炎，CFA组发生胰岛内炎率高于NS组，但无统计学差异(P>0.05)，这可能与例数少有关。进一步分析，CFA组50个胰岛中有36个(72%)胰岛炎分值≤2分，而NS组中仅10个(20%)胰岛炎分值≤2分，两者差异具高度显著性(P<0.01)。NS组中3只发生糖尿病鼠的胰岛炎积分明显高于2只未发生糖尿病鼠(3.600±0.583vs2.633±1.080)，差异有高度显著性(P<0.01)。CFA组胰岛炎积分均值明显低于NS组，差异有高度显著性(P<0.01)(附表)。
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2.2 bcl-2蛋白和PCNA在胰岛中的表达 图1～3示，bcl-2蛋白阳性物质定位于胞浆而胞核阴性，PCNA阳性物质定位于胞核而胞浆阴性。附表示，CFA组bcl-2蛋白阳性细胞率均值明显高于NS组，差异有高度显著性(P<0.01)；PCNA阳性细胞率均值明显低于NS组，差异有高度显著性(P<0.01)。
附表 NOD鼠胰岛炎评分及bcl-2和PCNA表达情况(
±s) 组别
例数(n)
胰岛炎积 分(n′=n×10)
bcl-2阳性细胞率(n′=n×5)
PCNA阳性细胞 率(n′=n×5)
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CFA组
5
2.0483±1.0228(50)
0.8232±0.0808(25)
0. 1156±0.0654(25)
NS组
5
3.0200±1.0294(50)①
0.7236±0.1294(25)①
0.1600±0.0669(25)①
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与CFA组比较：①P<0.01
图1 CFA组NOD鼠胰岛细胞bcl-2阳性率1 00%，胰岛炎评分0分，ABC法，×100 图2 NS组NOD鼠胰岛细胞bcl-2阳性率25%，胰岛炎 评分4分，ABC法，×100 图3 CFA组NOD鼠胰岛细胞PCNA阳性率16.4%，胰岛炎评 分3分，ABC法，×100
Fig. 1 The positive rate of bcl-2 oncopro tein being 100% in CFA-treated NOD mice, the scoring of insulitis being 0 score , ABC method, ×100 Fig. 2 The positive rate of bcl-2 oncoprote in being 25% in NS-treated NOD mice, the scoring of insulitis being 4 score, A BC method, ×100 Fig. 3 The positive rate of PCNA being 16.4%, th e scoring of insulitis being 3 score, ABC method, ×100
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3 讨 论
NOD鼠糖尿病与人类Ⅰ型糖尿病有许多相似之处，其发病机制主要表现为自身免疫反应引起的胰岛β细胞进行性破坏，故适用于作为人类Ⅰ型糖尿病病因病理及防治研究的动物模型[1]。国外学者发现：NOD鼠胰岛炎和糖尿病不仅可通过免疫抑制(如环孢霉素A)，而且亦可通过免疫刺激或免疫调节(如BCG和CFA等)来预防[2，3，6，8]。本文发现CFA能明显减轻NOD鼠胰岛炎发生程度和抑制糖尿病的自然发生，NS组胰岛内炎数及胰岛炎积分皆明显高于CFA组，NS组3(3/5)只鼠发生糖尿病，而CFA组无1只发生糖尿病(0/5)。此结果与国外文献报道一致[2，3]。其机制可能在于CFA激活CD4(+)调节T细胞，即TH2细胞，促进TH2细胞分泌IL-4和IL-10，从而起到预防作用[2]。虽CFA不能用于人类，但与CFA有类似作用的BCG开始应用于人类Ⅰ型糖尿病的治疗，故应用其他免疫调节措施预防Ⅰ型糖尿病亦值得深入探讨。
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人类和NOD鼠Ⅰ型糖尿病β细胞的死亡特征在组织形态学上表现为细胞凋亡[9]。bcl-2基因为抑细胞凋亡基因，其编码的bcl-2蛋白能抑制细胞凋亡和延长细胞寿命，已证实正常胰岛细胞呈bcl-2蛋白阳性表达[4]。CFA是否能诱导或维持β细胞bcl-2蛋白生成而间接抑制β细胞凋亡，以及NOD鼠胰岛炎和β细胞凋亡是否由于bcl-2蛋白表达丢失或减少所致均尚不清楚。本文发现CFA组胰岛细胞bcl-2蛋白阳性率明显高于NS组，而NOD鼠胰岛细胞除β细胞外其他细胞无明显变化。提示CFA在诱导或维持β细胞bcl-2蛋白表达和抑制β细胞凋亡方面具有较重要的意义，这可能也是CFA预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病发生的作用机制之一，但需进一步研究。
PCNA是反映细胞增殖活性的重要标记物[5]，CFA在减轻NOD鼠胰岛炎程度和预防糖尿病发生的作用中是否诱导未破坏的胰岛β细胞增生未见文献报道。本文发现CFA组PCNA阳性细胞率明显低于NS组(P<0.01)，说明CFA可能不诱导胰岛β细胞增殖，与胰岛β细胞增殖活性无明显关系。笔者推测：因CFA具保护胰岛β细胞免遭破坏的作用，CFA组胰岛β细胞阳性率明显高于NS组(将另文报道)，NS组胰岛β细胞的破坏高于CFA组，胰岛则以β细胞增生代偿破坏的胰岛β细胞从而维持正常血糖浓度，故β细胞增殖是机体自身通过血糖浓度等刺激因素的一种预防保护作用。
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参 考 文 献
1 Signore A, Pozzilli P, Cale EMA, et al. The natural hist ory of lymphocyte subsets infiltrating the pancreas of NOD mice. Diabetologia, 1 989,92:282～289
2 Wang T, Singh B, Warnock G, et al. Prevention of recurrence of IDDM in is l et-transplanted diabetic NOD mice by adjuvant immunotherapy. Diabetes, 1992,41: 114～117
3 Qin HY, Saedlain MVQJ, Hitchon C, et al. Complete Feund's adjuvant induced T cells prevent the development and adoptive transfer of diabetes in non-obes e diabetic mice. J Immunol, 1993,150:2072～2080
, 百拇医药
4 Lu QL, Poulson R, Wong L, et al. Bcl-2 expression in adult and embry onic non-haematopoietic tissue. J Pathol, 1993,169:431～437
5 Hall PA, Levison DA, Woods AL, et al. Proliferating cell nuclear antigen( PCNA) immunolocalization with evidence of deregulated expression in some neoplas ms. J Pathol, 1990,162:285～289
6 Guylingco R, Quddus J, Richardson B, et al. Single administration or Bacillus Calmette-Guerin(BCG) vaccine in non-obese diabetic(NOD) mice results in s upression of in vitro T-lymphocyte proliferation and regression of insuliti s. Diabetes, 1991,40:152～158
, 百拇医药
7 Tisch R, Yang XD, Singer SM, et al. Immune response to glutamic acid deca rboxylase correlates with insulitis in non-obese diabetic mice. Nature, 1993,366:72～75
8 Calafiore R, Basta G, Falormi A, et al. Preventive effects of azathioprine(AZA) on the onset of diabetes melltius in NOD mice. J Endocrinol Invest, 1993, 150:2072～2079
9 Kaeto H, Fujji J, Seo HG, et al. Apoptotic cell death triggered by nitric oxide in pancreatic beta-cells. Diabets, 1995,44:733～738, 百拇医药
单位：杨竹林(第二附属医院肝胆疾病研究室 长沙 410011)；伍汉文 周智广 廖二元 杨 文(代谢内分泌研究所 长沙 410011)
关键词：胰岛；胰岛炎*；β细胞；完全弗氏佐剂*；bcl-2；蛋白；增殖细胞核抗原*；免疫组织化学；NOD鼠
湖南医科大学学报990630 中国图书分类号 R587
Non-obese diabetic(NOD)小鼠是一种遗传性Ⅰ型糖尿病的啮齿动物模型，它从5周龄起自发地出现自身免疫性胰岛炎，14周龄后可自发Ⅰ型糖尿病[1 ]。NOD鼠糖尿病与人类Ⅰ型糖尿病有许多相似之处[1]。由于NOD鼠糖尿病系一器官特异性自身免疫性疾病，改变其免疫病理过程可能预防胰岛炎和糖尿病的发生。国外一些学者对完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant, CFA)预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病的发生进行了较深入研究[2，3]。bcl-2蛋白能抑制细胞凋亡和延长细胞寿命[4]。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)主要在S期细 胞表达，是一个反映细胞增殖活性的重要指标[5]。CFA预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病 发生是否与胰岛细胞bcl-2，PCNA表达有关未见文献报道。为此，笔者研究了NOD鼠胰 岛细胞bcl-2，PCNA表达及其与CFA预防胰岛炎和糖尿病发生的关系，现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 NOD鼠来自澳大利亚WEHI医学研究中心，由山西医科大学提供。所有小鼠在标准饲养环境下喂养，自由饮净化水及全价营养颗粒饮食。本实验采用的NOD雌鼠群落在30周龄时糖尿病自然发病率为70%。
1.1.2 动物实验 10只4周龄雌鼠随机分成实验组(CFA组)和对照组(生理盐水组，NS组)，每组各5只。CFA组后脚板处注射50μlCFA，NS组注射等量NS。所有NOD鼠发生糖尿病时或30周龄时处死，并按常规取下全胰腺，将全胰置10%中性福尔马林固定24～48h，按常规制成石蜡包埋切片，厚4μm。
1.1.3 主要试剂 CFA由美国生命技术公司提供；鼠抗人bcl-2蛋白、PCNA单克隆抗体，生物素标记羊抗鼠IgG和ABC试剂由Dako公司提供；DAB-HCl由瑞士进口分装。
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1.2 方法 (1)糖尿病检测：从10周龄开始，每周测体重一次，并观察是否有糖尿病症状出现。当出现多饮、多尿、消瘦等症状时，即用断尾法取血测血糖，如随机血糖连续2天≥11.1mmol*L-1时即诊断为糖尿病。血糖测定采用OneTouchⅡ血糖仪。无糖尿病症状鼠30周龄时测血糖后均处死。(2)胰岛炎评分：每例鼠胰腺2张切片(第一张切片后约50μm切第2张切片)常规HE染色，在光镜下随机观察并计数10个胰岛的胰岛炎分值，所得值0分示正常胰岛，1分和2分示胰岛周围炎，3分和4分示胰岛内炎。每只鼠胰平均分值等于10个胰岛总分值除以10，所得值0分示正常胰岛，0.1～2分示胰岛周围炎，2.1～4分示胰岛内炎[6，7]。(3)染色方法：bcl-2和PCNA染色为常规ABC免疫组化法，阳性细胞呈淡棕黄色至深棕黄色颗粒状，以0.01molPBS液(pH7.4)替代一抗、二抗或ABC试剂作为每次染色的阴性对照。高倍镜下每例鼠胰切片随机计数5个胰岛内胰岛细胞总数、bcl-2阳性细胞率(bcl-2阳性细胞数/胰岛细胞总数)及PCNA阳性细胞率(PCNA阳性细胞数/胰岛细胞总数)。(4)统计学处理：采用t检验或直接概率法。
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2 结 果
2.1 胰岛炎发生程度和糖尿病发生情况 30周龄时，NS组5只鼠中有3只发生糖尿病(连续2天血糖值分别为：24.2mmol.L-1和22.4mmol.L-1，16.4mmol.L-1和16.9mmol.L-1，11.1mmol.L-1和11.1mmol.L-1)，其余2只血糖值均<11.1mmol.L-1。5只CFA组鼠无1只发生糖尿病，血糖值均<11.1mmol.L-1。30周龄时两组小鼠均发生胰岛炎，CFA组有4只发生胰岛周围炎和1只发生胰岛内炎，NS组有1只发生胰岛周围炎和4只发生胰岛内炎，CFA组发生胰岛内炎率高于NS组，但无统计学差异(P>0.05)，这可能与例数少有关。进一步分析，CFA组50个胰岛中有36个(72%)胰岛炎分值≤2分，而NS组中仅10个(20%)胰岛炎分值≤2分，两者差异具高度显著性(P<0.01)。NS组中3只发生糖尿病鼠的胰岛炎积分明显高于2只未发生糖尿病鼠(3.600±0.583vs2.633±1.080)，差异有高度显著性(P<0.01)。CFA组胰岛炎积分均值明显低于NS组，差异有高度显著性(P<0.01)(附表)。
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2.2 bcl-2蛋白和PCNA在胰岛中的表达 图1～3示，bcl-2蛋白阳性物质定位于胞浆而胞核阴性，PCNA阳性物质定位于胞核而胞浆阴性。附表示，CFA组bcl-2蛋白阳性细胞率均值明显高于NS组，差异有高度显著性(P<0.01)；PCNA阳性细胞率均值明显低于NS组，差异有高度显著性(P<0.01)。
附表 NOD鼠胰岛炎评分及bcl-2和PCNA表达情况(
±s) 组别例数(n)
胰岛炎积 分(n′=n×10)
bcl-2阳性细胞率(n′=n×5)
PCNA阳性细胞 率(n′=n×5)
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CFA组
5
2.0483±1.0228(50)
0.8232±0.0808(25)
0. 1156±0.0654(25)
NS组
5
3.0200±1.0294(50)①
0.7236±0.1294(25)①
0.1600±0.0669(25)①
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与CFA组比较：①P<0.01
图1 CFA组NOD鼠胰岛细胞bcl-2阳性率1 00%，胰岛炎评分0分，ABC法，×100 图2 NS组NOD鼠胰岛细胞bcl-2阳性率25%，胰岛炎 评分4分，ABC法，×100 图3 CFA组NOD鼠胰岛细胞PCNA阳性率16.4%，胰岛炎评 分3分，ABC法，×100
Fig. 1 The positive rate of bcl-2 oncopro tein being 100% in CFA-treated NOD mice, the scoring of insulitis being 0 score , ABC method, ×100 Fig. 2 The positive rate of bcl-2 oncoprote in being 25% in NS-treated NOD mice, the scoring of insulitis being 4 score, A BC method, ×100 Fig. 3 The positive rate of PCNA being 16.4%, th e scoring of insulitis being 3 score, ABC method, ×100
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3 讨 论
NOD鼠糖尿病与人类Ⅰ型糖尿病有许多相似之处，其发病机制主要表现为自身免疫反应引起的胰岛β细胞进行性破坏，故适用于作为人类Ⅰ型糖尿病病因病理及防治研究的动物模型[1]。国外学者发现：NOD鼠胰岛炎和糖尿病不仅可通过免疫抑制(如环孢霉素A)，而且亦可通过免疫刺激或免疫调节(如BCG和CFA等)来预防[2，3，6，8]。本文发现CFA能明显减轻NOD鼠胰岛炎发生程度和抑制糖尿病的自然发生，NS组胰岛内炎数及胰岛炎积分皆明显高于CFA组，NS组3(3/5)只鼠发生糖尿病，而CFA组无1只发生糖尿病(0/5)。此结果与国外文献报道一致[2，3]。其机制可能在于CFA激活CD4(+)调节T细胞，即TH2细胞，促进TH2细胞分泌IL-4和IL-10，从而起到预防作用[2]。虽CFA不能用于人类，但与CFA有类似作用的BCG开始应用于人类Ⅰ型糖尿病的治疗，故应用其他免疫调节措施预防Ⅰ型糖尿病亦值得深入探讨。
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人类和NOD鼠Ⅰ型糖尿病β细胞的死亡特征在组织形态学上表现为细胞凋亡[9]。bcl-2基因为抑细胞凋亡基因，其编码的bcl-2蛋白能抑制细胞凋亡和延长细胞寿命，已证实正常胰岛细胞呈bcl-2蛋白阳性表达[4]。CFA是否能诱导或维持β细胞bcl-2蛋白生成而间接抑制β细胞凋亡，以及NOD鼠胰岛炎和β细胞凋亡是否由于bcl-2蛋白表达丢失或减少所致均尚不清楚。本文发现CFA组胰岛细胞bcl-2蛋白阳性率明显高于NS组，而NOD鼠胰岛细胞除β细胞外其他细胞无明显变化。提示CFA在诱导或维持β细胞bcl-2蛋白表达和抑制β细胞凋亡方面具有较重要的意义，这可能也是CFA预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病发生的作用机制之一，但需进一步研究。
PCNA是反映细胞增殖活性的重要标记物[5]，CFA在减轻NOD鼠胰岛炎程度和预防糖尿病发生的作用中是否诱导未破坏的胰岛β细胞增生未见文献报道。本文发现CFA组PCNA阳性细胞率明显低于NS组(P<0.01)，说明CFA可能不诱导胰岛β细胞增殖，与胰岛β细胞增殖活性无明显关系。笔者推测：因CFA具保护胰岛β细胞免遭破坏的作用，CFA组胰岛β细胞阳性率明显高于NS组(将另文报道)，NS组胰岛β细胞的破坏高于CFA组，胰岛则以β细胞增生代偿破坏的胰岛β细胞从而维持正常血糖浓度，故β细胞增殖是机体自身通过血糖浓度等刺激因素的一种预防保护作用。
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参 考 文 献
1 Signore A, Pozzilli P, Cale EMA, et al. The natural hist ory of lymphocyte subsets infiltrating the pancreas of NOD mice. Diabetologia, 1 989,92:282～289
2 Wang T, Singh B, Warnock G, et al. Prevention of recurrence of IDDM in is l et-transplanted diabetic NOD mice by adjuvant immunotherapy. Diabetes, 1992,41: 114～117
3 Qin HY, Saedlain MVQJ, Hitchon C, et al. Complete Feund's adjuvant induced T cells prevent the development and adoptive transfer of diabetes in non-obes e diabetic mice. J Immunol, 1993,150:2072～2080
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4 Lu QL, Poulson R, Wong L, et al. Bcl-2 expression in adult and embry onic non-haematopoietic tissue. J Pathol, 1993,169:431～437
5 Hall PA, Levison DA, Woods AL, et al. Proliferating cell nuclear antigen( PCNA) immunolocalization with evidence of deregulated expression in some neoplas ms. J Pathol, 1990,162:285～289
6 Guylingco R, Quddus J, Richardson B, et al. Single administration or Bacillus Calmette-Guerin(BCG) vaccine in non-obese diabetic(NOD) mice results in s upression of in vitro T-lymphocyte proliferation and regression of insuliti s. Diabetes, 1991,40:152～158
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7 Tisch R, Yang XD, Singer SM, et al. Immune response to glutamic acid deca rboxylase correlates with insulitis in non-obese diabetic mice. Nature, 1993,366:72～75
8 Calafiore R, Basta G, Falormi A, et al. Preventive effects of azathioprine(AZA) on the onset of diabetes melltius in NOD mice. J Endocrinol Invest, 1993, 150:2072～2079
9 Kaeto H, Fujji J, Seo HG, et al. Apoptotic cell death triggered by nitric oxide in pancreatic beta-cells. Diabets, 1995,44:733～738, 百拇医药