海藻酸钠纯度对大鼠微囊纤维化和囊内肝细胞功能的影响
作者：于聪慧 冷希圣 魏玉华 刘继超 杜如昱
单位：100044 北京医科大学人民医院外科(于聪慧现在北京军区总医院外科工作，100700)
关键词：肝移植；肝功能衰竭，急性；海藻
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 【摘要】 目的 研究海藻酸钠纯度对微囊纤维化及囊内肝细胞组织形态、功能的影响。方法采用逐步过滤和氯仿和丁醇萃取蛋白的方法纯化海藻酸钠，用纯化和未纯化的海藻酸钠制作两种微囊化肝细胞，分别作同种异体腹腔移植并观察移植后不同时期(2周、1、2、和6个月)微囊和囊内肝细胞的组织结构、功能表达及对急性肝衰大鼠存活率的影响。结果 纯化组的微囊回收率较未纯化组明显增高(P<0.001)。纯化组移植1个月时大部分肝细胞组织形态、酶和白蛋白染色与正常肝细胞差异不显著，未纯化组移植1个月内肝细胞破坏。长期移植(2、6个月)，纯化组微囊仍保持完整光滑，但肝细胞破坏；纯化组的微囊化肝细胞治疗急性肝衰较未纯化组效果明显。结论 纯化海藻酸钠能降低微囊的纤维化程度，改善囊内肝细胞功能。
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The effect of alginate purity on microencapsule overgrowth and function of microencapsulated hepatocyte in peritoneal transplantation
YU Conghui, LENG Xisheng, WEI Yuhau, et al. People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044
【Abstract】 Objective To study the effect of alginate purity on microencapsule overgrowth, histology and function of microencapsulated hepatocyte (MH). Methods Alginate was purified by filtration and chloroform/butanol extraction. Using purified and crude alginate to make two kinds of MHs, we transplanted each kind of MHs into the peritoneal cavities of rats. After 2 weeks, 1, 2 and 6 months, MHs were washed out to study overgrowth of MH, histology, and expression of enzyme and albumin in hepatocytes. Two kinds of MHs (the purified and the crude) were transplanted to FHF rats separately to study their differences in liver function support. Results The amount of retrieved MHs was larger in the purified than in the crude (P<0.001). In the purified group, most hepatocytes had normal morphology, positive enzymatic histochemistry and albumin immuno-histochemistry stain in one month of transplantation but were damaged in the crude group only 2 weeks later. Microencapsules were smooth and no overgrowth was observed during 6 months in the purified but all overgrowth one month later after transplantation in the crude. The purified MHs had excellent liver function support in the FHF comparing with the crude and the control. Conclusion The purified alginate may significantly reduce the overgrowth of MHs and improve the function of hepatocytes.
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【Key words】 Liver transplantation Liver failure, Acutes Seaweed
(Natl Med J China, 1999, 79：460-462)
微囊化肝细胞移植已成功地在实验性大鼠急性肝功能衰竭和先天性肝脏酶缺乏性疾病的治疗中获得成功。但微囊的纤维化，使囊内细胞营养摄取减少，从而影响囊内肝细胞的功能。目前认为海藻酸钠是引起纤维化的主要原因[1，2]。但是海藻酸钠纯度对微囊纤维化及囊内肝细胞功能的影响报道较少。我们就此问题进行了探讨。
材料和方法
一、材料
1.动物：供细胞组：SD大鼠，体重250～300 g，雄性；受细胞组：Wistar大鼠，体重300～350 g，雄性，购自北京医科大学动物中心。普通饲料喂养，随意饮食，室温22～28℃。
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2.试剂：胶原酶Ⅵ、多聚赖氨酸(MW 28 900)、葡萄糖-6-磷酸钾盐、Ⅰ型胶原、海藻酸钠均购自SIGMA公司。兔抗大鼠白蛋白单克隆抗体、羊抗兔抗体均购自DAKO公司。
3.仪器：SHIMADZU CL7000自动生化仪(JAPAN)，微囊发生仪，POLE PARMER温控水浴箱等。
二、方法
1.肝细胞的分离：采用改良Seglen[3]方法分离，平均细胞产率：1.5～2.5×108/鼠；细胞活率为85%～92%(0.4%台盼蓝拒染法)。
2.海藻酸钠的纯化：采用De等[4]方法，通过滤过和氯仿和丁醇萃取杂质蛋白，最后获得纯化海藻酸钠。未纯化组只使用原产品。
3.微囊化肝细胞的制作：采用改良A.M Sun方法[5]，用纯化和未纯化的海藻酸钠制作两组微囊化肝细胞，其中肝细胞浓度为5×106/ml，Ⅰ型胶原浓度1.7 mmol/L，微囊平均直径为400～700 μm。
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4.两种微囊化肝细胞腹腔移植后微囊及囊内肝细胞形态和功能的观察：Wistar大鼠分为两组，每组20只，植入纯化和未纯化海藻酸钠制作的微囊化肝细胞，每只移植量5 ml。分别在移植2周、1、2和6个月时，腹腔麻醉大鼠，剖腹将微囊化肝细胞用生理盐水冲洗，彻底回收冲洗液，离心沉淀，详细记录冲洗出微囊的数量，仔细检查腹腔，将游离微囊化肝细胞和腹腔内的小纤维化结节取出作以下观察：(1)普通组织学检查：4%多聚甲醛固定作石蜡包埋切片，HE染色普通光镜观察。(2)糖原(PAS)、单氨氧化酶(MAO)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)染色；(3)SP法进行免疫组织化学染色，检测胞浆中的白蛋白。根据染色结果判定细胞染色(++++～++)的百分比。(4)透射电镜检查：标本经3%戊二醛固定2小时后，四氧化锇固定，环氧树脂包埋，超薄切片，铀铅双染色作超微结构观察。
5.大鼠急性肝衰竭模型制作及两种不同纯度的微囊化肝细胞对急性肝功能衰竭治疗效果的比较：大鼠急性肝功能衰竭模型制作按本实验室成型方法进行[6]。将急性肝功能衰竭模型大鼠(Wistar)分为A(13只)、B(12只)和C(30只)3组。A、B两组在给予D-氨基半乳糖48小时后，每只大鼠腹腔分别移植纯化和未纯化的微囊化肝细胞5×107个，C组移植相同数量的空囊；详细记录大鼠的存活情况。
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6.统计学处理：实验数据采用均值±标准误，结果用t检验。
结 果
1.移植不同时期腹腔冲洗液中微囊的回收率：移植2周时纯化组与未纯化组微囊冲洗回收率分别为(94±26)%和(64±13)%、移植1个月(87±18)%和(34±11)%、2个月时(80±27)%和0，6个月时为(67±23)%和0。随着移植时间的延长，两组微囊的回收率逐渐减少。但与未纯化组相比，纯化组的微囊回收率明显增高，差异有显著意义(P<0.001)。
2.组织学及组织化学检测结果：(1)普通组织学检查：纯化组移植2周后囊内的肝细胞呈圆形，胞质丰满，胞膜完整，并可见到核分裂现象，1个月时除少部分肝细胞胞浆稀疏外，大部分肝细胞形态仍正常，未纯化组的微囊化肝细胞2周后微囊已有明显的炎性细胞浸润，囊内肝细胞胞浆稀疏，1个月时囊内的肝细胞结构破坏。移植2个月和6个月时，纯化组大部分微囊的外形仍保持完整光滑，但其中的肝细胞已破坏，而未纯化组移植1个月内微囊全部纤维化。(2)组织化学检查：纯化组移植2周后囊内肝细胞的G-6-P酶、MAO、SDH及糖原颗粒均呈阳性与正常肝细胞比差异无显著意义，1个月时肝细胞酶染色及白蛋白免疫组织化学染色与正常肝细胞差异亦无显著意义；未纯化组移植2周酶的活性就有所减弱，1个月后酶和白蛋白染色消失。(3)透射电镜检测：纯化组1个月内微囊化肝细胞的超微结构基本正常，未纯化组2周内细胞器肿胀，部分质膜破坏，1个月时无正常组织结构。
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3.不同纯度海藻酸钠制作的微囊化肝细胞，对大鼠急性肝功能衰竭治疗效果(存活率)：A组为53.8%(7/13)、B组33.3%(4/12)对照组16.6%(5/30)A组与B组比差异有显著意义P<0.01(t检验)纯化组大鼠的存活率明显高于未纯化组。
讨 论
微囊化技术是利用海藻酸钠和多聚赖氨酸共价结合形成的半透膜来阻隔宿主的免疫排斥，然而，移植后微囊纤维化是微囊化细胞长期移植面临的问题。因为粗制的海藻酸钠中含有多种炎性物质[7]易引起组织炎性反应，我们认为海藻酸钠的纯度可能与微囊纤维化也有密切的关系。采用纯化后的海藻酸钠制作的微囊化肝细胞移植后，腹腔冲洗微囊的回收率明显高于未纯化组，同时微囊纤维化程度明显降低，移植1个月囊内肝细胞组织结构、酶组织化学及白蛋白免疫组织化学染色较未纯化组有明显改善。在急性肝衰竭的治疗中，纯化组微囊化肝细胞肝功能支持作用明显优于未纯化组，说明纯化海藻酸钠能明显降低组织的炎性反应及微囊的纤维化，改善囊内肝细胞功能。长期腹腔移植(2、6个月)后虽然微囊并未纤维化，但是囊内的肝细胞却破坏，提示微囊化肝细胞在腹腔内的长期存活除了和海藻酸钠纯度有关系外可能与其他因素(如血液供给、移植部位)有关。
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注释：本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Soon-Shiong P, Otterlie M, Skjak-Brak G, et al. An immunological basis for the
fibrotic reaction to implanted microcapsules. Transplant Proc, 1991, 23:758-759.
2 Clayton HA, Lindon NJM, Colloby PS, et al. The effect of capsule composition on
the biocompatibility of alginate-poly-1-lysine capsules. J Microencapsulation,1991, 8:221-233.
, http://www.100md.com
3 Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cell. Methods Biol, 1976, 13:29-83.
4 De Vos P, De Haan BJ, Wolters GHJ, et al. Improved biocompatibility but limited
graft survival after purification of alginate for microencapsulation of
pancreatic islets. Diabetologia, 1997, 40:262-270.
5 Lim F, Sun AM. Bioartificial liver implanted artificial cells
, http://www.100md.com
microencapsulated living hepatocytes increases survival of liver failure rats.
Science, 1980, 210:908-910.
6 于聪慧，冷希圣，彭吉润，等.微囊化大鼠肝细胞腹腔移植后微囊细胞形态结构功能及其对急
性肝功能衰竭治疗作用的研究.中华实验外科杂志，1998，15：441-443.
7 Skjak-Brak G, Martinsen A. Applications of some algal polysaccharides in
biotechnology. In: MD Guiry, G Blunden (eds) vs eaweed resources in Europe:
uses and potentials. Wiley & Sons. Chichester, 1991, 219-225.
收稿：1998-08-18 修回：1999-01-29, http://www.100md.com
单位：100044 北京医科大学人民医院外科(于聪慧现在北京军区总医院外科工作，100700)
关键词：肝移植；肝功能衰竭，急性；海藻
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 【摘要】 目的 研究海藻酸钠纯度对微囊纤维化及囊内肝细胞组织形态、功能的影响。方法采用逐步过滤和氯仿和丁醇萃取蛋白的方法纯化海藻酸钠，用纯化和未纯化的海藻酸钠制作两种微囊化肝细胞，分别作同种异体腹腔移植并观察移植后不同时期(2周、1、2、和6个月)微囊和囊内肝细胞的组织结构、功能表达及对急性肝衰大鼠存活率的影响。结果 纯化组的微囊回收率较未纯化组明显增高(P<0.001)。纯化组移植1个月时大部分肝细胞组织形态、酶和白蛋白染色与正常肝细胞差异不显著，未纯化组移植1个月内肝细胞破坏。长期移植(2、6个月)，纯化组微囊仍保持完整光滑，但肝细胞破坏；纯化组的微囊化肝细胞治疗急性肝衰较未纯化组效果明显。结论 纯化海藻酸钠能降低微囊的纤维化程度，改善囊内肝细胞功能。
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The effect of alginate purity on microencapsule overgrowth and function of microencapsulated hepatocyte in peritoneal transplantation
YU Conghui, LENG Xisheng, WEI Yuhau, et al. People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044
【Abstract】 Objective To study the effect of alginate purity on microencapsule overgrowth, histology and function of microencapsulated hepatocyte (MH). Methods Alginate was purified by filtration and chloroform/butanol extraction. Using purified and crude alginate to make two kinds of MHs, we transplanted each kind of MHs into the peritoneal cavities of rats. After 2 weeks, 1, 2 and 6 months, MHs were washed out to study overgrowth of MH, histology, and expression of enzyme and albumin in hepatocytes. Two kinds of MHs (the purified and the crude) were transplanted to FHF rats separately to study their differences in liver function support. Results The amount of retrieved MHs was larger in the purified than in the crude (P<0.001). In the purified group, most hepatocytes had normal morphology, positive enzymatic histochemistry and albumin immuno-histochemistry stain in one month of transplantation but were damaged in the crude group only 2 weeks later. Microencapsules were smooth and no overgrowth was observed during 6 months in the purified but all overgrowth one month later after transplantation in the crude. The purified MHs had excellent liver function support in the FHF comparing with the crude and the control. Conclusion The purified alginate may significantly reduce the overgrowth of MHs and improve the function of hepatocytes.
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【Key words】 Liver transplantation Liver failure, Acutes Seaweed
(Natl Med J China, 1999, 79：460-462)
微囊化肝细胞移植已成功地在实验性大鼠急性肝功能衰竭和先天性肝脏酶缺乏性疾病的治疗中获得成功。但微囊的纤维化，使囊内细胞营养摄取减少，从而影响囊内肝细胞的功能。目前认为海藻酸钠是引起纤维化的主要原因[1，2]。但是海藻酸钠纯度对微囊纤维化及囊内肝细胞功能的影响报道较少。我们就此问题进行了探讨。
材料和方法
一、材料
1.动物：供细胞组：SD大鼠，体重250～300 g，雄性；受细胞组：Wistar大鼠，体重300～350 g，雄性，购自北京医科大学动物中心。普通饲料喂养，随意饮食，室温22～28℃。
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2.试剂：胶原酶Ⅵ、多聚赖氨酸(MW 28 900)、葡萄糖-6-磷酸钾盐、Ⅰ型胶原、海藻酸钠均购自SIGMA公司。兔抗大鼠白蛋白单克隆抗体、羊抗兔抗体均购自DAKO公司。
3.仪器：SHIMADZU CL7000自动生化仪(JAPAN)，微囊发生仪，POLE PARMER温控水浴箱等。
二、方法
1.肝细胞的分离：采用改良Seglen[3]方法分离，平均细胞产率：1.5～2.5×108/鼠；细胞活率为85%～92%(0.4%台盼蓝拒染法)。
2.海藻酸钠的纯化：采用De等[4]方法，通过滤过和氯仿和丁醇萃取杂质蛋白，最后获得纯化海藻酸钠。未纯化组只使用原产品。
3.微囊化肝细胞的制作：采用改良A.M Sun方法[5]，用纯化和未纯化的海藻酸钠制作两组微囊化肝细胞，其中肝细胞浓度为5×106/ml，Ⅰ型胶原浓度1.7 mmol/L，微囊平均直径为400～700 μm。
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4.两种微囊化肝细胞腹腔移植后微囊及囊内肝细胞形态和功能的观察：Wistar大鼠分为两组，每组20只，植入纯化和未纯化海藻酸钠制作的微囊化肝细胞，每只移植量5 ml。分别在移植2周、1、2和6个月时，腹腔麻醉大鼠，剖腹将微囊化肝细胞用生理盐水冲洗，彻底回收冲洗液，离心沉淀，详细记录冲洗出微囊的数量，仔细检查腹腔，将游离微囊化肝细胞和腹腔内的小纤维化结节取出作以下观察：(1)普通组织学检查：4%多聚甲醛固定作石蜡包埋切片，HE染色普通光镜观察。(2)糖原(PAS)、单氨氧化酶(MAO)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)染色；(3)SP法进行免疫组织化学染色，检测胞浆中的白蛋白。根据染色结果判定细胞染色(++++～++)的百分比。(4)透射电镜检查：标本经3%戊二醛固定2小时后，四氧化锇固定，环氧树脂包埋，超薄切片，铀铅双染色作超微结构观察。
5.大鼠急性肝衰竭模型制作及两种不同纯度的微囊化肝细胞对急性肝功能衰竭治疗效果的比较：大鼠急性肝功能衰竭模型制作按本实验室成型方法进行[6]。将急性肝功能衰竭模型大鼠(Wistar)分为A(13只)、B(12只)和C(30只)3组。A、B两组在给予D-氨基半乳糖48小时后，每只大鼠腹腔分别移植纯化和未纯化的微囊化肝细胞5×107个，C组移植相同数量的空囊；详细记录大鼠的存活情况。
, 百拇医药
6.统计学处理：实验数据采用均值±标准误，结果用t检验。
结 果
1.移植不同时期腹腔冲洗液中微囊的回收率：移植2周时纯化组与未纯化组微囊冲洗回收率分别为(94±26)%和(64±13)%、移植1个月(87±18)%和(34±11)%、2个月时(80±27)%和0，6个月时为(67±23)%和0。随着移植时间的延长，两组微囊的回收率逐渐减少。但与未纯化组相比，纯化组的微囊回收率明显增高，差异有显著意义(P<0.001)。
2.组织学及组织化学检测结果：(1)普通组织学检查：纯化组移植2周后囊内的肝细胞呈圆形，胞质丰满，胞膜完整，并可见到核分裂现象，1个月时除少部分肝细胞胞浆稀疏外，大部分肝细胞形态仍正常，未纯化组的微囊化肝细胞2周后微囊已有明显的炎性细胞浸润，囊内肝细胞胞浆稀疏，1个月时囊内的肝细胞结构破坏。移植2个月和6个月时，纯化组大部分微囊的外形仍保持完整光滑，但其中的肝细胞已破坏，而未纯化组移植1个月内微囊全部纤维化。(2)组织化学检查：纯化组移植2周后囊内肝细胞的G-6-P酶、MAO、SDH及糖原颗粒均呈阳性与正常肝细胞比差异无显著意义，1个月时肝细胞酶染色及白蛋白免疫组织化学染色与正常肝细胞差异亦无显著意义；未纯化组移植2周酶的活性就有所减弱，1个月后酶和白蛋白染色消失。(3)透射电镜检测：纯化组1个月内微囊化肝细胞的超微结构基本正常，未纯化组2周内细胞器肿胀，部分质膜破坏，1个月时无正常组织结构。
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3.不同纯度海藻酸钠制作的微囊化肝细胞，对大鼠急性肝功能衰竭治疗效果(存活率)：A组为53.8%(7/13)、B组33.3%(4/12)对照组16.6%(5/30)A组与B组比差异有显著意义P<0.01(t检验)纯化组大鼠的存活率明显高于未纯化组。
讨 论
微囊化技术是利用海藻酸钠和多聚赖氨酸共价结合形成的半透膜来阻隔宿主的免疫排斥，然而，移植后微囊纤维化是微囊化细胞长期移植面临的问题。因为粗制的海藻酸钠中含有多种炎性物质[7]易引起组织炎性反应，我们认为海藻酸钠的纯度可能与微囊纤维化也有密切的关系。采用纯化后的海藻酸钠制作的微囊化肝细胞移植后，腹腔冲洗微囊的回收率明显高于未纯化组，同时微囊纤维化程度明显降低，移植1个月囊内肝细胞组织结构、酶组织化学及白蛋白免疫组织化学染色较未纯化组有明显改善。在急性肝衰竭的治疗中，纯化组微囊化肝细胞肝功能支持作用明显优于未纯化组，说明纯化海藻酸钠能明显降低组织的炎性反应及微囊的纤维化，改善囊内肝细胞功能。长期腹腔移植(2、6个月)后虽然微囊并未纤维化，但是囊内的肝细胞却破坏，提示微囊化肝细胞在腹腔内的长期存活除了和海藻酸钠纯度有关系外可能与其他因素(如血液供给、移植部位)有关。
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注释：本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Soon-Shiong P, Otterlie M, Skjak-Brak G, et al. An immunological basis for the
fibrotic reaction to implanted microcapsules. Transplant Proc, 1991, 23:758-759.
2 Clayton HA, Lindon NJM, Colloby PS, et al. The effect of capsule composition on
the biocompatibility of alginate-poly-1-lysine capsules. J Microencapsulation,1991, 8:221-233.
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3 Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cell. Methods Biol, 1976, 13:29-83.
4 De Vos P, De Haan BJ, Wolters GHJ, et al. Improved biocompatibility but limited
graft survival after purification of alginate for microencapsulation of
pancreatic islets. Diabetologia, 1997, 40:262-270.
5 Lim F, Sun AM. Bioartificial liver implanted artificial cells
, http://www.100md.com
microencapsulated living hepatocytes increases survival of liver failure rats.
Science, 1980, 210:908-910.
6 于聪慧，冷希圣，彭吉润，等.微囊化大鼠肝细胞腹腔移植后微囊细胞形态结构功能及其对急
性肝功能衰竭治疗作用的研究.中华实验外科杂志，1998，15：441-443.
7 Skjak-Brak G, Martinsen A. Applications of some algal polysaccharides in
biotechnology. In: MD Guiry, G Blunden (eds) vs eaweed resources in Europe:
uses and potentials. Wiley & Sons. Chichester, 1991, 219-225.
收稿：1998-08-18 修回：1999-01-29, http://www.100md.com