细胞凋亡与肿瘤细胞的抗药性
作者：陈洁，潘启超
单位：中山医科大学肿瘤防治中心(广州，510060)
关键词：细胞凋亡；多药抗药性
癌症990637
中图分类号：R730.53 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(1999)06-0739-03
肿瘤细胞对抗癌药物产生抗药性是肿瘤化疗失败的主要原因之一，因此，解决抗药性仍是有待解决的一大难题。随着对细胞凋亡(Programmed cell death,PCD,apoptosis)研究的深入，人们认识到PCD与肿瘤细胞的抗药性有着内在的密切关系，对PCD的抑制在抗药性的形成过程中起一定的作用〔1，2〕。本文仅就细胞凋亡和肿瘤抗药性之间的关系研究作一综述。
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1对细胞凋亡的耐受可产生对化疗药物的抗性
研究表明不少因素可抑制PCD，如细胞内在的存活因素，CSF类因子、NGF等；突变型p53、bcl-2、c-erB2/neu、bcr/abl、raf等凋亡抑制基因及其产物。这些因素的作用使细胞表现出对PCD的不敏感，也表现出对PCD诱导剂的抗性。McClay等〔3〕研究发现对三苯氧胺(Tamoxifen，TAM)抵抗的黑色素瘤细胞可以抵抗由TAM诱导的PCD，而敏感细胞不具备这一特异性。另外，抗药细胞也能抵抗由多种药物诱导的PCD。Robinson等〔4〕研究发现抗药细胞中抗药基因1(mdr1)产物的过度表达，可延迟细胞对多种化疗药物诱导的凋亡的敏感性。因为mdr1产物的过度表达与细胞内碱性化有关；而在某些细胞中，酸化是凋亡过程必要的一个因素，所以mdr1产物可维持细胞存活的内在离子环境。Palissort等〔5〕也发现HL-60/VCR可抵抗由非多药抗药性(MDR)系列药物诱发的PCD，可能的机制是bcl-2的过度表达和药物不能介导胞内pH的改变，而使细胞维持碱性化。可见，PCD和细胞的抗药性的确存在不同程度的内在联系。
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2PCD与抗药性的内在联系
2.1凋亡相关基因与mdr基因
2.1.1 p53基因与mdr1基因：mdr1基因是人类肿瘤的多药抗药基因，由它编码的P-gp糖蛋白的外排药物功能是导致肿瘤细胞产生多药抗药性的重要原因。p53基因可调节mdr1基因的表达。Chin等〔6，7〕将ras、突变型p53和人mdr1启动子CAT构建物共转染NIH3T3细胞，发现能激活mdr1启动子；其中ras的作用是非特异性的，而突变型p53的作用是特异性的。Strauss等〔8〕研究发现mdr1下游启动子含有野生型p53(wtp53)特异性结合位点，wtp53可特异性抑制mdr1下游启动子的激活，wtp53的突变即可解除这种抑制。Lin等〔9〕则证明了p53蛋白中第281位残基，即结合区(binding domain)的突变可特异性激活mdr1基因，并增强肿瘤的形成能力。可见，p53基因突变与mdr1过度表达和抗药性有密切关系。但也有相反结果的研究。Li等〔10〕发现wtp53可增加内源性p53贫乏的KBv200细胞mdr1表达，使细胞内ADM积累下降；但用ADM和VCR治疗后，转导细胞的抗药性反而降低，其机制是转导细胞对p53依赖的PCD更加敏感了。所以p53对mdr1的作用是促进还是抑制，还有待更深的研究。mdm2基因是p53基因的拮抗基因，其产物可和p53蛋白结合而使p53蛋白失活〔11〕。已有研究发现p53基因突变率很低的恶性肿瘤中，有高比例的mdm2的表达，它可抑制p53的转录，从而促进肿瘤的发生和发展〔12〕。mdm2基因可能与mdr1基因的活化有关，Kondo等〔13〕证明mdm2基因能诱导mdr1和P-gp在U87MG细胞中表达，能使细胞抵抗由VP16或DOX引起的PCD。
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2.1.2 其他癌基因与mdr基因：Chin等已证明了ras基因可非特异性地激活mdr1的表达，因为它还可增强鸡β-actin、RSV、SV40启动子的活性。Ras的活化和p53的突变一样，是肿瘤细胞最常见的事件，因此它们对mdr1的影响也就直接影响了肿瘤的MDR表型。
Kim等〔14〕用转染实验证明了N-末端一半缺失的C-raf突变子22W可强烈激活mdr1启动子，这种激活与mdr1启动子的-197～-136含热休克元件(heat shock element,HSE)上游结构的区域有关，而只含HSE下游结构的mdr1缺陷结构则不能被22W激活。PKA抑制剂H-87可阻断这一激活过程。结果说明raf突变子和PKA依赖的途径可控制mdr基因的转录，其机制可能与热休克蛋白的活性有关。
Bhushan等〔15〕发现敏感的KB细胞和小鼠S180细胞等接触MDR相关药物，如VCR后，其c-fosmRNA表达明显增加，同时细胞表现出抗药性。根据mdr1启动子含AP-1序列，并且c-jun过度表达的特征，作者推测c-fos可能和c-jun形成异二聚体，再与mdr1启动子特异性结合，调节mdr1的表达。
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此外，也有报道表明N-myc的扩增与mdr1的下调有关，尚待进一步研究〔16〕。1997年，Delaporte等〔17〕研究发现myc基因与mdr3的表达相关，转染了c-myc的抗性中国仓鼠肺癌DC-3F/9-OH-E细胞可部分逆转其抗药性，这种逆转与P-gp1无关而与P-gp3相关，因为转染了mdr3基因的抗性细胞可逆转相同部分的MDR表型。进一步研究揭示myc的表达可正向调节P-gp3，且这种调节是通过下调P-gp1的活性来实现的。
2.2凋亡相关基因与非mdr依赖的抗药性
2.2.1 bcl-2基因家族：bcl-2是最重要的凋亡抑制基因，很多研究发现它的高表达能明显抑制肿瘤细胞的PCD，导致肿瘤细胞对多种化疗药物耐受，而且这种bcl-2介导的抗药性与mdr1基因的</S>表达无关〔18〕。Lotem等〔19〕报道M1白血病细胞表达高水平的bcl-2可导致细胞对多种因素诱导的PCD不敏感，而显示出对不同药物的高抗性，这种抗性与mdr1基因的活性无关，只与bcl-2调节的PCD有关。雌激素可以通过胞内bcl-2的基因产物P26bcl-2来调节PCD，它可增强P26bcl-2的表达，而使bcl-2/Bax的比例改变，从而降低敏感细胞MCF-7对PCD的敏感性，相应增加了MCF-7对紫杉醇(taxol)的抗性〔20〕。此外，肿瘤对激素治疗产生抗性也可能与bcl-2的表达增高有关〔21〕。
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bcl-Xl是bcl-2家族中另一个PCD抑制基因，它的抑制机理可能是非bcl-2依赖的。Kuhl等〔22〕证明bcl-Xl可导致P388/SPR细胞的非典型MDR表型，即该细胞对阿霉素(DOX)、依托泊甙(VP-16)、topo酶Ⅱ抑制剂、长春新碱(VCR)等多种药物交叉抵抗。这种交叉抗性是由bcl-X导致的，转染人的bcl-Xl基因，可使P388表现出与P388/SPR一样的交叉抗性，证明bcl-Xl确实可导致对多种药物的交叉抗性。
2.2.2 突变型p53基因：p53基因的突变是人类肿瘤中最常发生的一种现象，几乎所有的主要组织中均可发生p53的突变。不同肿瘤类型及不同组织起源的肿瘤p53基因突变类型各不相同，主要是碱基置换，还有碱基缺失、染色体重排、基因插入等，这些变化都可导致正常p53基因产物的失活。p53蛋白是作为细胞周期G1检查点的蛋白起作用的，突变型p53蛋白则丧失这一功能，导致肿瘤细胞不能识别被抗癌药物损伤的DNA，而让其继续进入细胞周期，使肿瘤细胞产生对相应药物的抗性〔23〕。Giannios等〔24〕发现乳腺癌和卵巢癌细胞中bcl-2、HER2/neu和突变型p53或BRCA1高表达，这些遗传特征的改变可带来对化疗的抗性。考察其机制发现这种抗性主要与以上几种基因高表达使细胞对DNA损伤性药物诱导的PCD的敏感性降低有关。通过使用拮抗基因、野生型基因或反义核酸，可以逆转这种抗药性。
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2.2.3 Fas(CD95)基因：Fas/FasL信号传导系统是细胞凋亡信号传导的重要途径之一。Fas活化受损可导致细胞对PCD的不敏感，进而也表现出对相关药物的抗性。1997年，Friesen等〔25〕指出Fas/FasL的活化是药物诱导PCD的关键。对Fas抵抗和对DOX抵抗的白血病和成神经细胞瘤细胞可显示出对PCD的交叉抗性，且抗性细胞的Fas基因下调。在很多肿瘤细胞中，药物诱导PCD时可显示出FasL基因的上调，但是在此种抗性细胞中，这种上调完全被阻断，进而导致Fas/FasL活化不足而产生抗药性。这种抗药性与药物的吸收、排出及mdr1基因无关。结果说明完整的Fas/FasL系统在决定细胞敏感性上扮演了很重要的角色。
2.2.4其他基因：与肿瘤细胞抗药性有关的凋亡相关基因还有c-Ha-ras、C-erbB2等。Sabbatini等〔26〕将c-Ha-ras和C-erbB2基因共转染进P-gp阴性的MCF-7-10A细胞中，发现细胞可获得MDR表型。1997年，DiSimone等〔27〕发现ras转染的MCF-10A细胞较原亲本细胞更加抵抗顺铂(cisplatinum)，同时GSTπ表达增高，而其他抗性机制，如mdr1、MRP、LRP等均未发现有变化，于是推论：ras基因转染可通过增加GSTπ的表达来诱导对顺铂的抗性。
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2.3凋亡相关基因与mdr基因共存的多机制抗药性
肿瘤细胞的抗药机制很复杂，往往几种机制可以共存于一种细胞中，相互作用，共同促进细胞对药物的抵抗。对凋亡的不敏感也能同经典的抗药机制如MDR、MRP、LRP、topo酶Ⅱ等共存。1997年，Huang等〔28〕认为P-gp、MDR或LRP是人急粒白血病(AML)细胞多药抗性的“近端机制”(proximal mechanism)，而bcl-2bcl-Xl为其“远端机制”(distalmechanism)，两种机制可以共同存在于HL-60各种抗性细胞中，且互相促进。Bosanquet等〔29〕也发现bcl-2和P-gp的表达密切正相关，共同决定了细胞对MDR诱导药物或PCD诱导药物的敏感性和抗性。Sonneveld等〔30〕认为临床上多发性骨髓瘤的抗药性机制可能包括P-gp、LRP和抑制PCD的bcl-2的高表达且3种机制合并可增强抗药性。Guo等〔31〕发现胰岛素样生长因子(IGF-I)可以促进MCLM结肠癌细胞的MDR表型，这种获得性抗药性与IGF-I促进细胞内mdr1、c-H-ras和锰超氧化歧化酶(MnSOD)的过度表达有关，从而细胞可以抵抗由细胞毒物质，如DOX、放线菌素D(ActD)、洛伐他丁(lovastatin)等引起的细胞凋亡或死亡而表达对它们的抗性。1997年，Liu等〔32〕发现转染了e-erbB2原癌基因的人乳腺癌细胞MDA-MB-435有高度表达的c-erbB产物p185，而且可通过非mdr1途径抵抗紫杉醇的毒性。进一步研究发现mdr1产物p170的特异性抗体C219可与p185产生交叉反应，提示两者有同缘序列。在此研究的基础上，Yu和Liu等〔33〕又发现p185和p170的同时高度表达可使MDA-MB-435抵抗taxol的毒性，两过程是独立的，但p170与p185协同可使抗性程度加大。
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3通过诱导PCD，逆转抗药性
对PCD不敏感，可导致肿瘤细胞对相关药物产生抗性;反之，抗药细胞也能相应抵抗药物诱导的PCD，所以通过诱导细胞的PCD，可逆转细胞的抗药性。蛋白磷酸化抑制剂okadaic酸(OKA)可以选择性地加强VCR对敏感型和MDR型细胞的毒性，考察其机制时发现OKA可通过抑制蛋白磷酸化破坏有丝分裂纺锤体的功能，使细胞易于发生凋亡〔34〕。Safingol是一种PKA抑制剂，能加强化疗药物诱导的PCD，并抑制P-gp磷酸化而部分逆转MDR〔35〕。三苯氧胺可增强紫杉特尔(docetaxel)G2/M阻断能力，即可以增强细胞对PCD的敏感性，这种增效作用是通过拮抗P-gp的活性而实现的；但在非P-gp细胞中，也存在同样的增效作用，提示增效作用可能与P-gp无关〔36〕。后又有人研究了紫杉醇增效化疗的作用，也发现紫杉醇可有效加强DOX诱导的细胞毒性和PCD，这种作用与紫杉醇抑制PKC-α的质膜转运有关〔37〕。
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Malorni等〔38〕发现肿瘤坏死因子(TNF)可增加人淋巴细胞瘤CEM/VBL10和CEM/VBL100细胞株对药物的敏感性，这种作用与PCD有关。作者表明TNF-α是表达p170的MDR细胞有效的PCD诱导剂，可增强MDR细胞对PCD的敏感性；同时抗性细胞中还伴随着谷胱苷肽(GSH)的减少，从而使细胞的解毒功能降低。Bhalla等〔39〕也证明GM-CSF能通过刺激PCD途径加强阿糖胞苷(AraC)对AML的疗效。
利福霉素(rifampicin)是一种抗结核药，新近研究发现它可增强呲喃阿霉素(pirarubicin)对具有抗蒽环类抗生素特性的P388细胞的毒性。这种增效作用与胞内药物积累有关，同时也与增强利福霉素诱导的PCD和G2/M阻断有关〔40〕。
Ramachandran等〔41〕发现DOX与泵阻断剂如维拉帕米(VRP)共孵育时，可增加DOX在抗性细胞P388/R84内的积累，同时还使抗性细胞易于发生PCD；此时mdr1或P-gp的表达均未见改变，但在凋亡过程中bcl-2发生了下调，此下调依赖于P-gp决定的胞内药物的滞留。结果说明标准MDR逆转剂VRP也可通过诱发PCD抑制基因bcl-2的下调来逆转MDR。总之，细胞凋亡与肿瘤的化学治疗和抗药性有密切联系，诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤化学治疗的新靶点，同时也是逆转抗药性的新途径，所以了解它们之间的相互关系具有特别重要的意义。
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〔参考文献〕
〔1〕Frankfurt OS, Seckinger D, Sugarbaker EV. Pleiotropic drug resistance and survival advantage in leukemic cells with diminished apoptotic response〔J〕. Int J Cancer, 1994,59：217～224.
〔2〕Fang M,Zhang HQ, Xue SB, et al.Apoptosis resistance and its reverasl in harring to mine resistant cell lines〔J〕.Yao Hsueh Hsueh Pao,1994,29：891～898.
〔3〕McClay EF,Jones JA,Winski PJ,et al. Determinants of tamoxifen sensitivity control the nature of the synergistic interaction between tamoxifen and cisplatin〔J〕.Cancer Res,1996,56(17)：3993～3997.
, http://www.100md.com
〔4〕Robinson LJ, Roberts WK, Ling TT, et al. Human MDR1 protein overexpre-ssion delays the apoptotic cascade in Chinese hamster ovary fibroblasts〔J〕.Biochemistry, 1997, 36(37)：11169～11178.
〔5〕Palissot V.Belhoussine R,Carpentier Y,et al.Resistance to apotosis induced by topoisomerase I inhibitors in multidrug- resistant HL-60 leukemic cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun, 1998,245(3)： 918～922.
〔6〕Chin KV, Pastan I, Gottesman MM.Function and regulation of the human multidrug resistance gene〔J〕.Adv Cancer Res,1993,60：157～180.
, http://www.100md.com
〔7〕Chin KV, Kazumitsu U, Ira P, et al.Modulation of activity of the promoter of the human MDR1 gene by Ras and p53〔J〕.Science,1992,255：459～462.
〔8〕Strauss BE,Shivakumar C, Deb SP,et al.The MDR1 downstream promoter contains sequence-specified binding sites for wild-type p53〔J〕.Biochem Biophys Res Commun, 1995,217(3)：828～831.
〔9〕Lin J, Teresky AK,Levine AJ. Two critical hydrophobic amino acid in the N-terminal domain of the p53 protein are required for the gain of function phenotypes of human p53 mutants〔J〕. Oncogene, 1995,10(12)：2387～2390.
, 百拇医药
〔10〕Li ZH, Zhu YJ, Lit XY. Wild- type p53 gene increases MDR1 gene expression but decreases drug resistance in an MDR cell line KBV200〔J〕. Cancer Lett, 1997,119(2)： 177～184.
〔11〕Oliner JD,Pietenpol Ja, Thiagalingam S,et al.Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppre-ssor p53〔J〕.Nature,1993,362：857～860.
〔12〕Bueso- Ramos CE, Yang Y, deLeon E,et al.The human mdm- 2 oncogene is overexpressed in leukemias〔J〕.Blood,1993,82(9)：2617～2623.
, 百拇医药
〔13〕Kondo S, Kondo Y, Hara H,et al.mdm-2 gene mediates the expression of mdr1 gene and P-glycoprotein in human glioblastama cell line〔J〕.Br J Cancer,1996,74(8)：1263～1268.
〔14〕Kim SH, Lee SH, Kwak NH, et al.Effect of the activated Ray protein kinase on the human multidrug resistance 1(mdr1) gene promoter〔J〕. Cancer Lett, 1996, 98(2)： 199～205.
〔15〕Bhushan A, Abramson R, Chiu JF et al.Expression of c-fos in human and murine multidrug-resistance cells〔J〕.Mol Pharmacol,1992,42：69～74.
, http://www.100md.com
〔16〕Nakagawara A, Kaelomatsu K,Sato S,et al.Inverse correlation between expression of multidrug resistance gene and N-myc oncogene in human neuro- blastomas〔J〕. Cancer Res, 1990,50(10)：3043～3047.Delaporte C, Dautry F, Jacquemin- Sablon A. Induction of pgp3 expression and reversion of the multidrug resistance phenotype in 9-OH-ellipticine- resistant Chinese hamster lung fibroblasts transfected with the MYC oncogene〔J〕. Biochem Pharmacol, 1997, 53(1)：59～66.
〔18〕Miyashita T, Reed JC. Bcl-2 onco-protein blocks chemotherapy- induced apoptosis in a human leukemia cell line〔J〕. Blood, 1993, 81：151.
, 百拇医药
〔19〕Lotem J, Sachs L. Regulation by bcl-2,c-myc,and p53 of susceptibility to induction of apoptosis by heat shock and cancer chemotherapy compounds in differentiation-competent and- defective myeloid leukemic cells〔J〕.Cell Growth Differ,1993,4(1)：41～47.
〔20〕Huang Y, Ray S, Reed JC, et al.Estrogen increases intracellula p26 Bcl-2 to P21 Bax ratio and inhibits taxol-induced apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells〔J〕.Breast Caner Res Treat, 1997,42(1)：73.
, 百拇医药
〔21〕Kerr JFR, Winterford CM. Apoptosis〔J〕.Cancer,1994,74：2013.
〔22〕Kuhl JS, Krajewski S, Duran GE, et al.Spontaneous overexpression of the long form of the Bcl-X protein in a highly resistant P388 leukemia〔J〕.Br J Cancer,1997,75(2)：268.
〔23〕Pickard M, Dive C,Kinsella AR. Differences in resistance to 5-Fluoro-uracil as a function of cell cycle delay and not apoptosis〔J〕.Br J Cancer,1995,72(6)：1389.
, 百拇医药
〔24〕Giannios J,Ioanmidou-Mouzaka I. Molecular aspects of breast and ovarian cancer〔J〕.Eur J Gynaecol Oncol, 1997, 18(5)：387～393.
〔25〕Friesen C, Fulda S, Debatin KM. Deficient activation of the CD95(APO-1/Fas)system in drug-resistant cells〔J〕. Leukemia,1997,11(11)：1833～1841.
〔26〕Sabbatini AR,Basolo F, Valentini P, et al. Induction of multidrug resistance (MDR) by transfection of MCF-10A cell line with c-Ha-ras and c-erbB-2 oncogenes〔J〕. Int J Cancer, 1994, 59(2)： 208～211.
, http://www.100md.com
〔27〕Di Simone D, Galimberti S, Basolo F, et al.c-Ha-ras transfection and expre-ssi on of MDR-related genes in MCF-10A human breast cell line〔J〕.Anticancer Res, 1997, 17(5A)：3587～3592.
〔28〕Huang Y,Ibrado AM, Reed JC, et al. Co- expression of several molecular mechanisms of multidrug resistance and their significane for paclitaxel cytotoxi- city in human AML HL-60 cells〔J〕.Leukemmia,1997,11(2)：253～257.
〔29〕Bosanquet AG, Bell PB,Bulton AR,et al.Correlation of bcl-2 with P-glyco- protein expression in chronic lympho-cytic leukemia and other haematological neoplasms but of neither marker with ex vivo chemosensitivity or patient surviva〔J〕. Leuk Lymphoma, 1996, 24(1～2)：141～147.
, http://www.100md.com
〔30〕Sonneveld P,Lokhorst HM,Vossebeld P.Drug resistance in multiple myeloma〔J〕. Semin Hematol, 1997, 34 (4 Suppl 5)：34～39.
〔31〕Guo YS, Jin GF, Houston CW, et al. Insulin-like growth factor-I promotes multidrug resistance in MCLM colon cancer cells〔J〕.J Cell Physiol,1998,175(2)：141～148.
〔32〕Liu B, Sun D, Xia W, et al.Cross-reactivity of C219 anti-p170 (mdr-1) antibody with p185 (c-erbB2) in breast cancer cells：cautions on evaluating p170 (mdr-1)〔J〕.J Natl Cancer Inst, 1997,89(20)：1524～1529.
, 百拇医药
〔33〕Yu D, Liu B, Jing T, et al. Overexpression of bothu p185c- erbB2 and p170mdr- 1 renders breast cancer cells highly resistant to taxol〔J〕. Oncogene, 1998,26(16)： 2087.
〔34〕Kawamura KI, Grabowski D, Weizer K, et al. Modulation of vinblastine cytotoxicity by dilantin (phenytoin)or the protein phosphatase inhibitor okadaic acid involves the potentiation of anti-mitotic effects and induction of apoptosis〔J〕.Br J Cance,1996,73(2)：183～188.
, 百拇医药
〔35〕Caponigro F, French RC, Kaye SB. Protein kinase C：a worthwhile target for anticancer drugs?〔J〕. Anticancer Drugs, 1997,8(1)：26～33.
〔36〕Ferlini C, Scambia G, Distefano M,et al. Synergistic antiproliferative activity of tamoxifen and docetaxel on three oestrogen receptor-negative cancer cell lines is mediated by the induction of apoptosis〔J〕.Br J Cancer, 1997,75(6)：884～891.
〔37〕Cheng AL, Chuang SE, Fine RL,et al. Inhibition of the membrane translocation and activation of protein kinase C,and potentiation of doxorubi-cin-induced apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by tamoxifen〔J〕.Biochem Pharmacol, 1998,55(4)： 523～531.
, http://www.100md.com
〔38〕Malorni W,Rainaldi G,Tritarelli E.Tumor necrosis factor alpha is a powerful apoptotic inducer in lymphoid leukemic cells expressing the P-170 glycoprotein〔J〕.Int J Cancer,1996,67(2)：238～247.
〔39〕Bhalla K, Tang C,Ibrado AM,et al.Granulocyte-macrophage colony sti-mulating factor interleukin-3 fusion protein (PIXY321) enhances high-close Ara-C-induced programmed cell death or apoptosis in human myeloid leukemia cells〔J〕.Blood,1992, 80(11)：2883.
, 百拇医药
〔40〕Furusawa S,Nakano S,Wu J,et al.Potentiation of pirarubicin activity in multidrug resistant cells by rifampicin〔J〕.Biol Pharm Bull,1997,20(12)：1303～1306.
〔41〕Ramachandran C,You W,Krishan A.Bcl-2 and mdr-1 gene expression duringdoxorubicin-induced apoptosis in murine leukemic P388 and P388/R84 cells〔J〕. Anticancer Res, 1997,17(5A)：3369～3376.
收稿日期：1998-12-23；修回日期：1999-01-05, http://www.100md.com
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关键词：细胞凋亡；多药抗药性
癌症990637
中图分类号：R730.53 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(1999)06-0739-03
肿瘤细胞对抗癌药物产生抗药性是肿瘤化疗失败的主要原因之一，因此，解决抗药性仍是有待解决的一大难题。随着对细胞凋亡(Programmed cell death,PCD,apoptosis)研究的深入，人们认识到PCD与肿瘤细胞的抗药性有着内在的密切关系，对PCD的抑制在抗药性的形成过程中起一定的作用〔1，2〕。本文仅就细胞凋亡和肿瘤抗药性之间的关系研究作一综述。
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1对细胞凋亡的耐受可产生对化疗药物的抗性
研究表明不少因素可抑制PCD，如细胞内在的存活因素，CSF类因子、NGF等；突变型p53、bcl-2、c-erB2/neu、bcr/abl、raf等凋亡抑制基因及其产物。这些因素的作用使细胞表现出对PCD的不敏感，也表现出对PCD诱导剂的抗性。McClay等〔3〕研究发现对三苯氧胺(Tamoxifen，TAM)抵抗的黑色素瘤细胞可以抵抗由TAM诱导的PCD，而敏感细胞不具备这一特异性。另外，抗药细胞也能抵抗由多种药物诱导的PCD。Robinson等〔4〕研究发现抗药细胞中抗药基因1(mdr1)产物的过度表达，可延迟细胞对多种化疗药物诱导的凋亡的敏感性。因为mdr1产物的过度表达与细胞内碱性化有关；而在某些细胞中，酸化是凋亡过程必要的一个因素，所以mdr1产物可维持细胞存活的内在离子环境。Palissort等〔5〕也发现HL-60/VCR可抵抗由非多药抗药性(MDR)系列药物诱发的PCD，可能的机制是bcl-2的过度表达和药物不能介导胞内pH的改变，而使细胞维持碱性化。可见，PCD和细胞的抗药性的确存在不同程度的内在联系。
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2PCD与抗药性的内在联系
2.1凋亡相关基因与mdr基因
2.1.1 p53基因与mdr1基因：mdr1基因是人类肿瘤的多药抗药基因，由它编码的P-gp糖蛋白的外排药物功能是导致肿瘤细胞产生多药抗药性的重要原因。p53基因可调节mdr1基因的表达。Chin等〔6，7〕将ras、突变型p53和人mdr1启动子CAT构建物共转染NIH3T3细胞，发现能激活mdr1启动子；其中ras的作用是非特异性的，而突变型p53的作用是特异性的。Strauss等〔8〕研究发现mdr1下游启动子含有野生型p53(wtp53)特异性结合位点，wtp53可特异性抑制mdr1下游启动子的激活，wtp53的突变即可解除这种抑制。Lin等〔9〕则证明了p53蛋白中第281位残基，即结合区(binding domain)的突变可特异性激活mdr1基因，并增强肿瘤的形成能力。可见，p53基因突变与mdr1过度表达和抗药性有密切关系。但也有相反结果的研究。Li等〔10〕发现wtp53可增加内源性p53贫乏的KBv200细胞mdr1表达，使细胞内ADM积累下降；但用ADM和VCR治疗后，转导细胞的抗药性反而降低，其机制是转导细胞对p53依赖的PCD更加敏感了。所以p53对mdr1的作用是促进还是抑制，还有待更深的研究。mdm2基因是p53基因的拮抗基因，其产物可和p53蛋白结合而使p53蛋白失活〔11〕。已有研究发现p53基因突变率很低的恶性肿瘤中，有高比例的mdm2的表达，它可抑制p53的转录，从而促进肿瘤的发生和发展〔12〕。mdm2基因可能与mdr1基因的活化有关，Kondo等〔13〕证明mdm2基因能诱导mdr1和P-gp在U87MG细胞中表达，能使细胞抵抗由VP16或DOX引起的PCD。
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2.1.2 其他癌基因与mdr基因：Chin等已证明了ras基因可非特异性地激活mdr1的表达，因为它还可增强鸡β-actin、RSV、SV40启动子的活性。Ras的活化和p53的突变一样，是肿瘤细胞最常见的事件，因此它们对mdr1的影响也就直接影响了肿瘤的MDR表型。
Kim等〔14〕用转染实验证明了N-末端一半缺失的C-raf突变子22W可强烈激活mdr1启动子，这种激活与mdr1启动子的-197～-136含热休克元件(heat shock element,HSE)上游结构的区域有关，而只含HSE下游结构的mdr1缺陷结构则不能被22W激活。PKA抑制剂H-87可阻断这一激活过程。结果说明raf突变子和PKA依赖的途径可控制mdr基因的转录，其机制可能与热休克蛋白的活性有关。
Bhushan等〔15〕发现敏感的KB细胞和小鼠S180细胞等接触MDR相关药物，如VCR后，其c-fosmRNA表达明显增加，同时细胞表现出抗药性。根据mdr1启动子含AP-1序列，并且c-jun过度表达的特征，作者推测c-fos可能和c-jun形成异二聚体，再与mdr1启动子特异性结合，调节mdr1的表达。
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此外，也有报道表明N-myc的扩增与mdr1的下调有关，尚待进一步研究〔16〕。1997年，Delaporte等〔17〕研究发现myc基因与mdr3的表达相关，转染了c-myc的抗性中国仓鼠肺癌DC-3F/9-OH-E细胞可部分逆转其抗药性，这种逆转与P-gp1无关而与P-gp3相关，因为转染了mdr3基因的抗性细胞可逆转相同部分的MDR表型。进一步研究揭示myc的表达可正向调节P-gp3，且这种调节是通过下调P-gp1的活性来实现的。
2.2凋亡相关基因与非mdr依赖的抗药性
2.2.1 bcl-2基因家族：bcl-2是最重要的凋亡抑制基因，很多研究发现它的高表达能明显抑制肿瘤细胞的PCD，导致肿瘤细胞对多种化疗药物耐受，而且这种bcl-2介导的抗药性与mdr1基因的</S>表达无关〔18〕。Lotem等〔19〕报道M1白血病细胞表达高水平的bcl-2可导致细胞对多种因素诱导的PCD不敏感，而显示出对不同药物的高抗性，这种抗性与mdr1基因的活性无关，只与bcl-2调节的PCD有关。雌激素可以通过胞内bcl-2的基因产物P26bcl-2来调节PCD，它可增强P26bcl-2的表达，而使bcl-2/Bax的比例改变，从而降低敏感细胞MCF-7对PCD的敏感性，相应增加了MCF-7对紫杉醇(taxol)的抗性〔20〕。此外，肿瘤对激素治疗产生抗性也可能与bcl-2的表达增高有关〔21〕。
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bcl-Xl是bcl-2家族中另一个PCD抑制基因，它的抑制机理可能是非bcl-2依赖的。Kuhl等〔22〕证明bcl-Xl可导致P388/SPR细胞的非典型MDR表型，即该细胞对阿霉素(DOX)、依托泊甙(VP-16)、topo酶Ⅱ抑制剂、长春新碱(VCR)等多种药物交叉抵抗。这种交叉抗性是由bcl-X导致的，转染人的bcl-Xl基因，可使P388表现出与P388/SPR一样的交叉抗性，证明bcl-Xl确实可导致对多种药物的交叉抗性。
2.2.2 突变型p53基因：p53基因的突变是人类肿瘤中最常发生的一种现象，几乎所有的主要组织中均可发生p53的突变。不同肿瘤类型及不同组织起源的肿瘤p53基因突变类型各不相同，主要是碱基置换，还有碱基缺失、染色体重排、基因插入等，这些变化都可导致正常p53基因产物的失活。p53蛋白是作为细胞周期G1检查点的蛋白起作用的，突变型p53蛋白则丧失这一功能，导致肿瘤细胞不能识别被抗癌药物损伤的DNA，而让其继续进入细胞周期，使肿瘤细胞产生对相应药物的抗性〔23〕。Giannios等〔24〕发现乳腺癌和卵巢癌细胞中bcl-2、HER2/neu和突变型p53或BRCA1高表达，这些遗传特征的改变可带来对化疗的抗性。考察其机制发现这种抗性主要与以上几种基因高表达使细胞对DNA损伤性药物诱导的PCD的敏感性降低有关。通过使用拮抗基因、野生型基因或反义核酸，可以逆转这种抗药性。
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2.2.3 Fas(CD95)基因：Fas/FasL信号传导系统是细胞凋亡信号传导的重要途径之一。Fas活化受损可导致细胞对PCD的不敏感，进而也表现出对相关药物的抗性。1997年，Friesen等〔25〕指出Fas/FasL的活化是药物诱导PCD的关键。对Fas抵抗和对DOX抵抗的白血病和成神经细胞瘤细胞可显示出对PCD的交叉抗性，且抗性细胞的Fas基因下调。在很多肿瘤细胞中，药物诱导PCD时可显示出FasL基因的上调，但是在此种抗性细胞中，这种上调完全被阻断，进而导致Fas/FasL活化不足而产生抗药性。这种抗药性与药物的吸收、排出及mdr1基因无关。结果说明完整的Fas/FasL系统在决定细胞敏感性上扮演了很重要的角色。
2.2.4其他基因：与肿瘤细胞抗药性有关的凋亡相关基因还有c-Ha-ras、C-erbB2等。Sabbatini等〔26〕将c-Ha-ras和C-erbB2基因共转染进P-gp阴性的MCF-7-10A细胞中，发现细胞可获得MDR表型。1997年，DiSimone等〔27〕发现ras转染的MCF-10A细胞较原亲本细胞更加抵抗顺铂(cisplatinum)，同时GSTπ表达增高，而其他抗性机制，如mdr1、MRP、LRP等均未发现有变化，于是推论：ras基因转染可通过增加GSTπ的表达来诱导对顺铂的抗性。
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2.3凋亡相关基因与mdr基因共存的多机制抗药性
肿瘤细胞的抗药机制很复杂，往往几种机制可以共存于一种细胞中，相互作用，共同促进细胞对药物的抵抗。对凋亡的不敏感也能同经典的抗药机制如MDR、MRP、LRP、topo酶Ⅱ等共存。1997年，Huang等〔28〕认为P-gp、MDR或LRP是人急粒白血病(AML)细胞多药抗性的“近端机制”(proximal mechanism)，而bcl-2bcl-Xl为其“远端机制”(distalmechanism)，两种机制可以共同存在于HL-60各种抗性细胞中，且互相促进。Bosanquet等〔29〕也发现bcl-2和P-gp的表达密切正相关，共同决定了细胞对MDR诱导药物或PCD诱导药物的敏感性和抗性。Sonneveld等〔30〕认为临床上多发性骨髓瘤的抗药性机制可能包括P-gp、LRP和抑制PCD的bcl-2的高表达且3种机制合并可增强抗药性。Guo等〔31〕发现胰岛素样生长因子(IGF-I)可以促进MCLM结肠癌细胞的MDR表型，这种获得性抗药性与IGF-I促进细胞内mdr1、c-H-ras和锰超氧化歧化酶(MnSOD)的过度表达有关，从而细胞可以抵抗由细胞毒物质，如DOX、放线菌素D(ActD)、洛伐他丁(lovastatin)等引起的细胞凋亡或死亡而表达对它们的抗性。1997年，Liu等〔32〕发现转染了e-erbB2原癌基因的人乳腺癌细胞MDA-MB-435有高度表达的c-erbB产物p185，而且可通过非mdr1途径抵抗紫杉醇的毒性。进一步研究发现mdr1产物p170的特异性抗体C219可与p185产生交叉反应，提示两者有同缘序列。在此研究的基础上，Yu和Liu等〔33〕又发现p185和p170的同时高度表达可使MDA-MB-435抵抗taxol的毒性，两过程是独立的，但p170与p185协同可使抗性程度加大。
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3通过诱导PCD，逆转抗药性
对PCD不敏感，可导致肿瘤细胞对相关药物产生抗性;反之，抗药细胞也能相应抵抗药物诱导的PCD，所以通过诱导细胞的PCD，可逆转细胞的抗药性。蛋白磷酸化抑制剂okadaic酸(OKA)可以选择性地加强VCR对敏感型和MDR型细胞的毒性，考察其机制时发现OKA可通过抑制蛋白磷酸化破坏有丝分裂纺锤体的功能，使细胞易于发生凋亡〔34〕。Safingol是一种PKA抑制剂，能加强化疗药物诱导的PCD，并抑制P-gp磷酸化而部分逆转MDR〔35〕。三苯氧胺可增强紫杉特尔(docetaxel)G2/M阻断能力，即可以增强细胞对PCD的敏感性，这种增效作用是通过拮抗P-gp的活性而实现的；但在非P-gp细胞中，也存在同样的增效作用，提示增效作用可能与P-gp无关〔36〕。后又有人研究了紫杉醇增效化疗的作用，也发现紫杉醇可有效加强DOX诱导的细胞毒性和PCD，这种作用与紫杉醇抑制PKC-α的质膜转运有关〔37〕。
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Malorni等〔38〕发现肿瘤坏死因子(TNF)可增加人淋巴细胞瘤CEM/VBL10和CEM/VBL100细胞株对药物的敏感性，这种作用与PCD有关。作者表明TNF-α是表达p170的MDR细胞有效的PCD诱导剂，可增强MDR细胞对PCD的敏感性；同时抗性细胞中还伴随着谷胱苷肽(GSH)的减少，从而使细胞的解毒功能降低。Bhalla等〔39〕也证明GM-CSF能通过刺激PCD途径加强阿糖胞苷(AraC)对AML的疗效。
利福霉素(rifampicin)是一种抗结核药，新近研究发现它可增强呲喃阿霉素(pirarubicin)对具有抗蒽环类抗生素特性的P388细胞的毒性。这种增效作用与胞内药物积累有关，同时也与增强利福霉素诱导的PCD和G2/M阻断有关〔40〕。
Ramachandran等〔41〕发现DOX与泵阻断剂如维拉帕米(VRP)共孵育时，可增加DOX在抗性细胞P388/R84内的积累，同时还使抗性细胞易于发生PCD；此时mdr1或P-gp的表达均未见改变，但在凋亡过程中bcl-2发生了下调，此下调依赖于P-gp决定的胞内药物的滞留。结果说明标准MDR逆转剂VRP也可通过诱发PCD抑制基因bcl-2的下调来逆转MDR。总之，细胞凋亡与肿瘤的化学治疗和抗药性有密切联系，诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤化学治疗的新靶点，同时也是逆转抗药性的新途径，所以了解它们之间的相互关系具有特别重要的意义。
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〔参考文献〕
〔1〕Frankfurt OS, Seckinger D, Sugarbaker EV. Pleiotropic drug resistance and survival advantage in leukemic cells with diminished apoptotic response〔J〕. Int J Cancer, 1994,59：217～224.
〔2〕Fang M,Zhang HQ, Xue SB, et al.Apoptosis resistance and its reverasl in harring to mine resistant cell lines〔J〕.Yao Hsueh Hsueh Pao,1994,29：891～898.
〔3〕McClay EF,Jones JA,Winski PJ,et al. Determinants of tamoxifen sensitivity control the nature of the synergistic interaction between tamoxifen and cisplatin〔J〕.Cancer Res,1996,56(17)：3993～3997.
, http://www.100md.com
〔4〕Robinson LJ, Roberts WK, Ling TT, et al. Human MDR1 protein overexpre-ssion delays the apoptotic cascade in Chinese hamster ovary fibroblasts〔J〕.Biochemistry, 1997, 36(37)：11169～11178.
〔5〕Palissot V.Belhoussine R,Carpentier Y,et al.Resistance to apotosis induced by topoisomerase I inhibitors in multidrug- resistant HL-60 leukemic cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun, 1998,245(3)： 918～922.
〔6〕Chin KV, Pastan I, Gottesman MM.Function and regulation of the human multidrug resistance gene〔J〕.Adv Cancer Res,1993,60：157～180.
, http://www.100md.com
〔7〕Chin KV, Kazumitsu U, Ira P, et al.Modulation of activity of the promoter of the human MDR1 gene by Ras and p53〔J〕.Science,1992,255：459～462.
〔8〕Strauss BE,Shivakumar C, Deb SP,et al.The MDR1 downstream promoter contains sequence-specified binding sites for wild-type p53〔J〕.Biochem Biophys Res Commun, 1995,217(3)：828～831.
〔9〕Lin J, Teresky AK,Levine AJ. Two critical hydrophobic amino acid in the N-terminal domain of the p53 protein are required for the gain of function phenotypes of human p53 mutants〔J〕. Oncogene, 1995,10(12)：2387～2390.
, 百拇医药
〔10〕Li ZH, Zhu YJ, Lit XY. Wild- type p53 gene increases MDR1 gene expression but decreases drug resistance in an MDR cell line KBV200〔J〕. Cancer Lett, 1997,119(2)： 177～184.
〔11〕Oliner JD,Pietenpol Ja, Thiagalingam S,et al.Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppre-ssor p53〔J〕.Nature,1993,362：857～860.
〔12〕Bueso- Ramos CE, Yang Y, deLeon E,et al.The human mdm- 2 oncogene is overexpressed in leukemias〔J〕.Blood,1993,82(9)：2617～2623.
, 百拇医药
〔13〕Kondo S, Kondo Y, Hara H,et al.mdm-2 gene mediates the expression of mdr1 gene and P-glycoprotein in human glioblastama cell line〔J〕.Br J Cancer,1996,74(8)：1263～1268.
〔14〕Kim SH, Lee SH, Kwak NH, et al.Effect of the activated Ray protein kinase on the human multidrug resistance 1(mdr1) gene promoter〔J〕. Cancer Lett, 1996, 98(2)： 199～205.
〔15〕Bhushan A, Abramson R, Chiu JF et al.Expression of c-fos in human and murine multidrug-resistance cells〔J〕.Mol Pharmacol,1992,42：69～74.
, http://www.100md.com
〔16〕Nakagawara A, Kaelomatsu K,Sato S,et al.Inverse correlation between expression of multidrug resistance gene and N-myc oncogene in human neuro- blastomas〔J〕. Cancer Res, 1990,50(10)：3043～3047.Delaporte C, Dautry F, Jacquemin- Sablon A. Induction of pgp3 expression and reversion of the multidrug resistance phenotype in 9-OH-ellipticine- resistant Chinese hamster lung fibroblasts transfected with the MYC oncogene〔J〕. Biochem Pharmacol, 1997, 53(1)：59～66.
〔18〕Miyashita T, Reed JC. Bcl-2 onco-protein blocks chemotherapy- induced apoptosis in a human leukemia cell line〔J〕. Blood, 1993, 81：151.
, 百拇医药
〔19〕Lotem J, Sachs L. Regulation by bcl-2,c-myc,and p53 of susceptibility to induction of apoptosis by heat shock and cancer chemotherapy compounds in differentiation-competent and- defective myeloid leukemic cells〔J〕.Cell Growth Differ,1993,4(1)：41～47.
〔20〕Huang Y, Ray S, Reed JC, et al.Estrogen increases intracellula p26 Bcl-2 to P21 Bax ratio and inhibits taxol-induced apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells〔J〕.Breast Caner Res Treat, 1997,42(1)：73.
, 百拇医药
〔21〕Kerr JFR, Winterford CM. Apoptosis〔J〕.Cancer,1994,74：2013.
〔22〕Kuhl JS, Krajewski S, Duran GE, et al.Spontaneous overexpression of the long form of the Bcl-X protein in a highly resistant P388 leukemia〔J〕.Br J Cancer,1997,75(2)：268.
〔23〕Pickard M, Dive C,Kinsella AR. Differences in resistance to 5-Fluoro-uracil as a function of cell cycle delay and not apoptosis〔J〕.Br J Cancer,1995,72(6)：1389.
, 百拇医药
〔24〕Giannios J,Ioanmidou-Mouzaka I. Molecular aspects of breast and ovarian cancer〔J〕.Eur J Gynaecol Oncol, 1997, 18(5)：387～393.
〔25〕Friesen C, Fulda S, Debatin KM. Deficient activation of the CD95(APO-1/Fas)system in drug-resistant cells〔J〕. Leukemia,1997,11(11)：1833～1841.
〔26〕Sabbatini AR,Basolo F, Valentini P, et al. Induction of multidrug resistance (MDR) by transfection of MCF-10A cell line with c-Ha-ras and c-erbB-2 oncogenes〔J〕. Int J Cancer, 1994, 59(2)： 208～211.
, http://www.100md.com
〔27〕Di Simone D, Galimberti S, Basolo F, et al.c-Ha-ras transfection and expre-ssi on of MDR-related genes in MCF-10A human breast cell line〔J〕.Anticancer Res, 1997, 17(5A)：3587～3592.
〔28〕Huang Y,Ibrado AM, Reed JC, et al. Co- expression of several molecular mechanisms of multidrug resistance and their significane for paclitaxel cytotoxi- city in human AML HL-60 cells〔J〕.Leukemmia,1997,11(2)：253～257.
〔29〕Bosanquet AG, Bell PB,Bulton AR,et al.Correlation of bcl-2 with P-glyco- protein expression in chronic lympho-cytic leukemia and other haematological neoplasms but of neither marker with ex vivo chemosensitivity or patient surviva〔J〕. Leuk Lymphoma, 1996, 24(1～2)：141～147.
, http://www.100md.com
〔30〕Sonneveld P,Lokhorst HM,Vossebeld P.Drug resistance in multiple myeloma〔J〕. Semin Hematol, 1997, 34 (4 Suppl 5)：34～39.
〔31〕Guo YS, Jin GF, Houston CW, et al. Insulin-like growth factor-I promotes multidrug resistance in MCLM colon cancer cells〔J〕.J Cell Physiol,1998,175(2)：141～148.
〔32〕Liu B, Sun D, Xia W, et al.Cross-reactivity of C219 anti-p170 (mdr-1) antibody with p185 (c-erbB2) in breast cancer cells：cautions on evaluating p170 (mdr-1)〔J〕.J Natl Cancer Inst, 1997,89(20)：1524～1529.
, 百拇医药
〔33〕Yu D, Liu B, Jing T, et al. Overexpression of bothu p185c- erbB2 and p170mdr- 1 renders breast cancer cells highly resistant to taxol〔J〕. Oncogene, 1998,26(16)： 2087.
〔34〕Kawamura KI, Grabowski D, Weizer K, et al. Modulation of vinblastine cytotoxicity by dilantin (phenytoin)or the protein phosphatase inhibitor okadaic acid involves the potentiation of anti-mitotic effects and induction of apoptosis〔J〕.Br J Cance,1996,73(2)：183～188.
, 百拇医药
〔35〕Caponigro F, French RC, Kaye SB. Protein kinase C：a worthwhile target for anticancer drugs?〔J〕. Anticancer Drugs, 1997,8(1)：26～33.
〔36〕Ferlini C, Scambia G, Distefano M,et al. Synergistic antiproliferative activity of tamoxifen and docetaxel on three oestrogen receptor-negative cancer cell lines is mediated by the induction of apoptosis〔J〕.Br J Cancer, 1997,75(6)：884～891.
〔37〕Cheng AL, Chuang SE, Fine RL,et al. Inhibition of the membrane translocation and activation of protein kinase C,and potentiation of doxorubi-cin-induced apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by tamoxifen〔J〕.Biochem Pharmacol, 1998,55(4)： 523～531.
, http://www.100md.com
〔38〕Malorni W,Rainaldi G,Tritarelli E.Tumor necrosis factor alpha is a powerful apoptotic inducer in lymphoid leukemic cells expressing the P-170 glycoprotein〔J〕.Int J Cancer,1996,67(2)：238～247.
〔39〕Bhalla K, Tang C,Ibrado AM,et al.Granulocyte-macrophage colony sti-mulating factor interleukin-3 fusion protein (PIXY321) enhances high-close Ara-C-induced programmed cell death or apoptosis in human myeloid leukemia cells〔J〕.Blood,1992, 80(11)：2883.
, 百拇医药
〔40〕Furusawa S,Nakano S,Wu J,et al.Potentiation of pirarubicin activity in multidrug resistant cells by rifampicin〔J〕.Biol Pharm Bull,1997,20(12)：1303～1306.
〔41〕Ramachandran C,You W,Krishan A.Bcl-2 and mdr-1 gene expression duringdoxorubicin-induced apoptosis in murine leukemic P388 and P388/R84 cells〔J〕. Anticancer Res, 1997,17(5A)：3369～3376.
收稿日期：1998-12-23；修回日期：1999-01-05, http://www.100md.com