四君子汤治疗实验脾虚证对胃肠粘膜细胞增殖动力学的影响
作者：姚永莉 宋于刚 张万岱
单位：姚永莉 张万岱 第一军医大学南方医院全军消化内科研究所 广东省广州市 510515； 宋于刚 第一军医大学珠江医院消化内科
关键词：脾虚证；胃粘膜；肠粘膜；免疫组织化学
世界华人消化杂志990633 中国图书馆分类号 R256.3
Subject headings spleen asthenia syndrome; gastric mucosa; intestinal mucosa; immunohistochemistry
0 引言
长期以来，氚标记的胸腺嘧啶(3H-TdR)常用于细胞动力学的研究，但由于3H-TdR有放射性，限制了它的应用. 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)与胸腺嘧啶具有结构的相似性，能代替胸腺嘧啶掺入S期细胞新合成的DNA链内. 近年来进一步证实，3H-TdR和BrdU所标记的S期细胞结果完全一致，但BrdU更具有省时、简便、重复性好和无放射性等优点，能够更好地用于检测细胞的增殖动力学. 我们利用该方法检测利血平所致脾虚大鼠模型胃肠粘膜细胞的增殖能力，为揭示脾虚证本质提供客观依据.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 利血平注射液：1mL(1mg)，上海医科大学红旗制药厂生产，批号960313；四君子汤：由人参、白术、茯苓、炙甘草四味中药组成，按2∶2∶2∶1的比例，先经蒸馏水浸泡2h，按常法煎煮两次，每次40min，滤出药液置70℃～80℃水浴浓缩为kg/L，4℃冰箱储存备用. BrdU(Sigma公司)；鼠抗-BrdU、免疫组化染色SPTM试剂盒(Zymed公司). 选用30只健康成年♂Sprague Dawley(SD)大鼠，体重245g～255g，饮食不限.
1.2 方法 适应性饲养3d后，随机分成以下5组，每组6只. 正常对照组：生理盐水0.5mL. kg-1.d-1，ip，同时于每日09：00，16：00喂饲蒸馏水2mL，连续14d. 脾虚模型组：利血平0.5mg.kg-1. d-1， ip,同时喂饲蒸馏水2mL，时间同前. 脾虚中药预防组：利血平0.5mg. kg-1. d-1，ip，同时喂饲四君子汤2mL，时间同前. 脾虚自然恢复组：按脾虚模型组方法制模14d成型后，于每日09：00，16：00喂饲蒸馏水2mL，继续观察6d. 脾虚中药治疗组：按脾虚模型组方法制模14d成型后，喂饲四君子汤2mL，时间同前，继续观察6d. 制模结束后禁食16h断头处死，处死大鼠前1h，10g/L BrdU 30mg/kg，ip. 留取胃窦、十二指肠、空肠及结肠组织各一段，沿肠系膜剖开固定于Carrnoy液，常规酒精脱水、二甲苯透明、沿纵轴方向石蜡包埋、常规5μm连续切片，免疫组化染色. 染色方法的主要步骤按照Magaud et al[1]方法进行. 对照片：注射BrdU的大鼠切片，用PBS代替第一抗体，其余步骤与试验片相同. 计数方法：每张切片在高倍镜(10×40)下随机取5个视野，计算每个视野内的阳性细胞数，取5个视野的均数作为每张切片的阳性细胞数.
, http://www.100md.com
统计学处理各处理组间的数据行方差分析，均数间两两比较用Student-Newman-Keuls法.
2 结果
被标记的呈深棕色或棕黄色的阳性细胞主要位于胃小凹的底部，肠腺的基底部，散在于其他细胞之间. 这些细胞不断增殖、分化、向上迁移， 以补充胃肠上皮脱落的细胞. BrdU标记的处于S期的细胞，体积明显大于其他细胞，胞质丰富，核浓染，呈颗粒状，核浆比例大. 细胞吸收BrdU后，核膜、核内染色质及核仁均有阳性反应. 高倍镜下可见被标记的细胞核内染色体双螺旋结构解开，成平行排列结构，还可见到正处于复制阶段的X型染色体. 各组大鼠胃肠粘膜被BrdU标记呈阳性的S期细胞数量不等，显示出不同的增殖能力(表1).
表1 各组BrdU标记的阳性细胞数 (
±s，n=6) 分组
, http://www.100md.com
胃窦
十二指肠
空肠
结肠
A正常对照组
73.43±3.31
67.93±4.39
56.63±5.25
43.83±3.79
B脾虚模型组
36.60±5.31a
33.87±3.48a
, http://www.100md.com
32.77±3.81a
21.27±2.95a
C中药预防组
71.67±4.96
70.43±6.97
61.43±6.32
46.30±3.85
D自然恢复组
57.57±4.80c
55.67±4.87c
, 百拇医药 47.30±4.25c
39.07±5.13c
E中药治疗组
79.20±6.10
80.67±5.63
67.53±5.54
52.13±4.43
aP<0.05，vs A，C；cP<0.05，vsC，E.
3 讨论
1980年初出现了利用BrdU单抗标记研究细胞动力学的技术，大大拓宽了对遗传物质结构、功能研究的领域[2-5]. DNA链中只要有0.5%的胸腺嘧啶(THD)被BrdU取代，也能用这种技术检测出来[5]. 利用BrdU标记S期细胞的免疫组织化学技术，成败的关键是DNA的变性. 我们选用普通的HCL使DNA变性， 再用胰蛋白酶短暂消化，目的是使细胞膜通透性增加，便于抗体进入细胞与BrdU结合. 本结果清楚显示，胃窦粘膜的BrdU阳性细胞位于胃小凹底部及幽门腺内，十二指肠、空肠及结肠粘膜的BrdU阳性细胞主要位于肠腺内，特别是肠腺的下1/3. DeFazio et al[6]观察到肠腺被标记的BrdU阳性细胞48h后开始向绒毛上皮移动，3d后3/4的绒毛上皮细胞呈BrdU阳性. 我们观察的是注射BrdU后1h的结果，所以BrdU阳性细胞仅限于肠腺，还未开始向绒毛上皮方向移动，我们所见位于绒毛中心和表面上皮细胞内的少数BrdU阳性细胞，可能是被标记的S期淋巴细胞. 因为只有合成DNA的S期细胞，BrdU才能掺入，所以基底层G或M期细胞不被BrdU标记. 本结果表明，BrdU注射后1h即可观察到阳性细胞，此时的阳性细胞核大，核浆比例高，说明正处于DNA合成的S期，与何荣根 et al[7]报道一致.
, 百拇医药
我们观察到脾虚大鼠胃肠道粘膜细胞的增殖能力处于受抑制状态，明显弱于正常组和中药预防组大鼠. 自然恢复组大鼠胃肠 道粘膜细胞的增殖能力虽有一定程度的改善，但明显不如中药治疗组大鼠胃肠道粘膜细胞增殖活跃. 说明四君子汤具有改善粘膜细胞增殖的能力，能有效预防和治疗脾虚证. 提示脾虚时胃肠粘膜细胞增殖能力低下是脾失健运的又一组织形态学的证据.
通讯作者 姚永莉
4 参考文献
1 Magaud JP, Sargent I, Jane P, Martine F, Ruth R and Mason DY. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal antibromodeoxyuridine. J Histochem Cytochem, 1989;37:1517-1527
, 百拇医药
2 葛振华，王若愚，王长青. 用抗溴脱氧尿苷单克隆抗体检测小鼠各种器官内S期细胞分布的研究. 解剖学报，1994；25：51-55
3 Mcdowell EM, Zhang XM and Desnati AM. Localization of healing tracheal wounds using bromodeoxyuridine immunohistochemistry. Stain Technol, 1990;65:25-29
4 谢运洁，董郡，林汉良. 应用抗BrdU单克隆抗体观察诱癌早期大鼠肝增生性病变的动态变化. 中华病理学杂志，1991；20：95-97
5 晏炬. 单克隆抗体技术. 国外医学分子生物学分册，1993；15：72-75
6 De Fazio A, Leary JA, Hedley DW and Martin HN. Immunohistochemical detection of proliferating cells in vivo.J Histochem Cytochem, 1987;35:571-577
7 何荣根，徐宏波，田中昭男，和唐雅博. 正常大鼠深处腺组织细胞增殖能力的观察. 中华口腔医学杂志，1996；31：67-70
收稿日期 1999-01-20 修回日期 1999-04-23, http://www.100md.com
单位：姚永莉 张万岱 第一军医大学南方医院全军消化内科研究所 广东省广州市 510515； 宋于刚 第一军医大学珠江医院消化内科
关键词：脾虚证；胃粘膜；肠粘膜；免疫组织化学
世界华人消化杂志990633 中国图书馆分类号 R256.3
Subject headings spleen asthenia syndrome; gastric mucosa; intestinal mucosa; immunohistochemistry
0 引言
长期以来，氚标记的胸腺嘧啶(3H-TdR)常用于细胞动力学的研究，但由于3H-TdR有放射性，限制了它的应用. 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)与胸腺嘧啶具有结构的相似性，能代替胸腺嘧啶掺入S期细胞新合成的DNA链内. 近年来进一步证实，3H-TdR和BrdU所标记的S期细胞结果完全一致，但BrdU更具有省时、简便、重复性好和无放射性等优点，能够更好地用于检测细胞的增殖动力学. 我们利用该方法检测利血平所致脾虚大鼠模型胃肠粘膜细胞的增殖能力，为揭示脾虚证本质提供客观依据.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 利血平注射液：1mL(1mg)，上海医科大学红旗制药厂生产，批号960313；四君子汤：由人参、白术、茯苓、炙甘草四味中药组成，按2∶2∶2∶1的比例，先经蒸馏水浸泡2h，按常法煎煮两次，每次40min，滤出药液置70℃～80℃水浴浓缩为kg/L，4℃冰箱储存备用. BrdU(Sigma公司)；鼠抗-BrdU、免疫组化染色SPTM试剂盒(Zymed公司). 选用30只健康成年♂Sprague Dawley(SD)大鼠，体重245g～255g，饮食不限.
1.2 方法 适应性饲养3d后，随机分成以下5组，每组6只. 正常对照组：生理盐水0.5mL. kg-1.d-1，ip，同时于每日09：00，16：00喂饲蒸馏水2mL，连续14d. 脾虚模型组：利血平0.5mg.kg-1. d-1， ip,同时喂饲蒸馏水2mL，时间同前. 脾虚中药预防组：利血平0.5mg. kg-1. d-1，ip，同时喂饲四君子汤2mL，时间同前. 脾虚自然恢复组：按脾虚模型组方法制模14d成型后，于每日09：00，16：00喂饲蒸馏水2mL，继续观察6d. 脾虚中药治疗组：按脾虚模型组方法制模14d成型后，喂饲四君子汤2mL，时间同前，继续观察6d. 制模结束后禁食16h断头处死，处死大鼠前1h，10g/L BrdU 30mg/kg，ip. 留取胃窦、十二指肠、空肠及结肠组织各一段，沿肠系膜剖开固定于Carrnoy液，常规酒精脱水、二甲苯透明、沿纵轴方向石蜡包埋、常规5μm连续切片，免疫组化染色. 染色方法的主要步骤按照Magaud et al[1]方法进行. 对照片：注射BrdU的大鼠切片，用PBS代替第一抗体，其余步骤与试验片相同. 计数方法：每张切片在高倍镜(10×40)下随机取5个视野，计算每个视野内的阳性细胞数，取5个视野的均数作为每张切片的阳性细胞数.
, http://www.100md.com
统计学处理各处理组间的数据行方差分析，均数间两两比较用Student-Newman-Keuls法.
2 结果
被标记的呈深棕色或棕黄色的阳性细胞主要位于胃小凹的底部，肠腺的基底部，散在于其他细胞之间. 这些细胞不断增殖、分化、向上迁移， 以补充胃肠上皮脱落的细胞. BrdU标记的处于S期的细胞，体积明显大于其他细胞，胞质丰富，核浓染，呈颗粒状，核浆比例大. 细胞吸收BrdU后，核膜、核内染色质及核仁均有阳性反应. 高倍镜下可见被标记的细胞核内染色体双螺旋结构解开，成平行排列结构，还可见到正处于复制阶段的X型染色体. 各组大鼠胃肠粘膜被BrdU标记呈阳性的S期细胞数量不等，显示出不同的增殖能力(表1).
表1 各组BrdU标记的阳性细胞数 (
±s，n=6) 分组, http://www.100md.com
胃窦
十二指肠
空肠
结肠
A正常对照组
73.43±3.31
67.93±4.39
56.63±5.25
43.83±3.79
B脾虚模型组
36.60±5.31a
33.87±3.48a
, http://www.100md.com
32.77±3.81a
21.27±2.95a
C中药预防组
71.67±4.96
70.43±6.97
61.43±6.32
46.30±3.85
D自然恢复组
57.57±4.80c
55.67±4.87c
, 百拇医药 47.30±4.25c
39.07±5.13c
E中药治疗组
79.20±6.10
80.67±5.63
67.53±5.54
52.13±4.43
aP<0.05，vs A，C；cP<0.05，vsC，E.
3 讨论
1980年初出现了利用BrdU单抗标记研究细胞动力学的技术，大大拓宽了对遗传物质结构、功能研究的领域[2-5]. DNA链中只要有0.5%的胸腺嘧啶(THD)被BrdU取代，也能用这种技术检测出来[5]. 利用BrdU标记S期细胞的免疫组织化学技术，成败的关键是DNA的变性. 我们选用普通的HCL使DNA变性， 再用胰蛋白酶短暂消化，目的是使细胞膜通透性增加，便于抗体进入细胞与BrdU结合. 本结果清楚显示，胃窦粘膜的BrdU阳性细胞位于胃小凹底部及幽门腺内，十二指肠、空肠及结肠粘膜的BrdU阳性细胞主要位于肠腺内，特别是肠腺的下1/3. DeFazio et al[6]观察到肠腺被标记的BrdU阳性细胞48h后开始向绒毛上皮移动，3d后3/4的绒毛上皮细胞呈BrdU阳性. 我们观察的是注射BrdU后1h的结果，所以BrdU阳性细胞仅限于肠腺，还未开始向绒毛上皮方向移动，我们所见位于绒毛中心和表面上皮细胞内的少数BrdU阳性细胞，可能是被标记的S期淋巴细胞. 因为只有合成DNA的S期细胞，BrdU才能掺入，所以基底层G或M期细胞不被BrdU标记. 本结果表明，BrdU注射后1h即可观察到阳性细胞，此时的阳性细胞核大，核浆比例高，说明正处于DNA合成的S期，与何荣根 et al[7]报道一致.
, 百拇医药
我们观察到脾虚大鼠胃肠道粘膜细胞的增殖能力处于受抑制状态，明显弱于正常组和中药预防组大鼠. 自然恢复组大鼠胃肠 道粘膜细胞的增殖能力虽有一定程度的改善，但明显不如中药治疗组大鼠胃肠道粘膜细胞增殖活跃. 说明四君子汤具有改善粘膜细胞增殖的能力，能有效预防和治疗脾虚证. 提示脾虚时胃肠粘膜细胞增殖能力低下是脾失健运的又一组织形态学的证据.
通讯作者 姚永莉
4 参考文献
1 Magaud JP, Sargent I, Jane P, Martine F, Ruth R and Mason DY. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal antibromodeoxyuridine. J Histochem Cytochem, 1989;37:1517-1527
, 百拇医药
2 葛振华，王若愚，王长青. 用抗溴脱氧尿苷单克隆抗体检测小鼠各种器官内S期细胞分布的研究. 解剖学报，1994；25：51-55
3 Mcdowell EM, Zhang XM and Desnati AM. Localization of healing tracheal wounds using bromodeoxyuridine immunohistochemistry. Stain Technol, 1990;65:25-29
4 谢运洁，董郡，林汉良. 应用抗BrdU单克隆抗体观察诱癌早期大鼠肝增生性病变的动态变化. 中华病理学杂志，1991；20：95-97
5 晏炬. 单克隆抗体技术. 国外医学分子生物学分册，1993；15：72-75
6 De Fazio A, Leary JA, Hedley DW and Martin HN. Immunohistochemical detection of proliferating cells in vivo.J Histochem Cytochem, 1987;35:571-577
7 何荣根，徐宏波，田中昭男，和唐雅博. 正常大鼠深处腺组织细胞增殖能力的观察. 中华口腔医学杂志，1996；31：67-70
收稿日期 1999-01-20 修回日期 1999-04-23, http://www.100md.com