α-蒎烯抗真菌机制的研究①
作者：夏忠弟 毛学政 罗映辉
单位：(微生物学教研室 长沙 410078)
关键词：抗真菌剂；α-蒎烯*；白念珠菌；超微结构；同位素标记；药物作用
湖南医科大学学报990604
提要 应用电镜及同位素掺入试验，研究α-蒎烯的抗真菌作用及其机制。结果表明：α-蒎烯对白念珠菌有明显的抑菌和杀菌作用。电镜下，α-蒎烯作用后的白念珠菌，其形态和超微结构发生明显的变化，菌细胞壁及细胞膜破裂，菌体内容物漏出，菌细胞裂解后成块状物；DNA，RNA及胞壁中多糖和胞膜的麦角固醇合成受到明显的抑制。提示α-蒎烯抗真菌的作用机制是通过抑制真菌的DNA，RNA，多糖及麦角固醇的生物合成所致。
中国图书分类号 R519.3
, http://www.100md.com
Study on antifungal mechanism of α-pinene
Xia Zhongdi Mao Xuezheng Luo Yinghui
(Department of Microbiology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
The antifungus mechanism of α-pinene was studied using electronic mic roscopy and incorporation of isotope-labelled precursor. The results demonstrated that α-pinene had significant roles in inhibiting and killing Candida albicans. After treatment with α-pinene the fungal morphology and ultrastructure showed obvious changes: their cell wall and cytoplasmic membrane ruptured; intracellar components released out and the cell residue fused to form irregular masses. In addition, the synthesis of DNA, RNA, polysacchanide of cell wall and ergosterol of cytoplasmic membrane was inhibited. It is indicated that these changes are related to antifungal mechanism of α-pinene.
, 百拇医药
Key words antifungal agents; α-pinene; Candida albicans; ultrastructure; isotope labelling; drug effects
α-蒎烯系植物性芳香油单体，对许多害虫具有较强的杀灭作用，是目前防治储粮虫害的常用除虫剂防霉剂，且具有广谱抗真菌作用[1]，国内外尚未见有关其抗菌机制的报道。本研究采用电镜下观察白念珠菌超微结构的变化及同位素标记技术，从分子水平探讨α-蒎烯抗真菌的作用机制，旨在为其进一步药用开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌株与试剂 (1)菌株：白念珠菌(ID16V1)由中国医学科学院真菌保存中心提供。(2)α-蒎烯：由湖南省粮油研究所提供。(3)同位素标记：前体[3H]-TdR,[3H]-UR，[3H]-亮氨酸及[14C]-醋酸钠，均由中国科学院上海核技术开发公司提供。
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1.2 方法
1.2.1 MIC和MBC测定[2] 经沙氏液体培养基培养的白念珠菌用生理盐水将其菌落洗下，并调整菌液浓度为OD=0.2，与不同浓度的α-蒎烯作试管内抑菌试验，测其MIC和MBC，试验重复5次。
1.2.2 透射电镜(TEM)标本制备及观察[3] 将白念珠菌经沙氏液体培养基常规培养后，取对数生长期菌落并调整菌液浓度为OD=0.2,将菌液与α-蒎烯(MIC浓度)分别作用于5h及8h后，将标本用2.5%戌二醛固定并制成琼脂块，经锇酸后固定、滴膜、脱水、切片、染色，置TEM(H600A-2型)观察。
1.2.3 扫描电镜(SEM)标本的制备与观察[4] 取α-蒎烯(MIC浓度)与白念珠菌液(浓度为OD=0.2)分别作用于5h及8h，加2.5%戌二醛固定，再经锇酸后固定、滴膜、脱水、喷金，置SEM(JSM-300)观察。
, 百拇医药
1.2.4 同位素前体掺入试验[5，6] 以[3H]-TdR，[3H]-UR，[3H]-亮氨酸和[14C]-NaAC分别作掺入前体进行同位素掺入试验，以1/2MIC，MIC，2MIC的α-蒎烯分别作用于对数生长期的白念珠菌，测定α-蒎烯对白念珠菌的DNA，RNA，多糖及麦角固醇的生物合成的影响，取对数生长期的白念珠菌菌液5.4ml，分别加入3μCi同位素标记前体和0.6ml不同浓度的α-蒎烯液，同时用生理盐水代替α-蒎烯作对照，置28℃振荡培养30min，样品通过Whetman玻璃纤维滤纸过滤，滤纸分别用10ml5%TCA及10mlDW各洗3次，37℃烘干后置5ml闪烁液中于BechmanLS3001液体闪烁计数器中检测，测出CPM值。将试验组与对照组的平均CPM值进行比较，计数掺入抑制率。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 MIC和MBC测定 α-蒎烯对白念珠菌的MIC和MBC均为1∶1280。
2.2 透射电镜观察结果 白念珠菌正常形态呈椭圆形，细胞结构清晰，完整，细胞壁，细胞膜光滑，层次清楚，胞核明显，胞浆内线粒体清晰可见(图1)，经α-蒎烯作用5h后，细胞变形，结构模糊，细胞壁疏松，多处有裂口，胞膜丧失，胞浆内容物漏出，胞核破碎，线粒体膜破损、变形(图2)。作用8h后，细胞壁及细胞膜彻底破坏，碎片融合，胞浆内容物全部漏出呈“空壳”状(图3)。
图1 白念珠菌超微结构
Fig. 1 Ultrastructural of Ca ndida albicans ×30000
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图2 药物作用5h后
Fig. 2 Ultrastructural changes after tre atment with α-pinene for 5h ×20000
图3 药物作用8h后
Fig. 3 After treatment with α-pinene f or 8h ×30000
2.3 扫描电镜观察 正常白念珠菌呈圆形或椭圆形，表面光滑，菌细胞以芽生孢子方式产生子代细胞，并相互连接成串(图4)。经α-蒎烯作用5h后，细胞变形，表面凹陷、萎缩，菌细胞间界线不清，有的出现细胞融合现象(图5)；作用8h后，细胞形态不清，结构破坏，菌细胞彻底破裂、溶解并融合成皱结状块状物(图6)。
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图4 白念珠菌正常形态
Fig. 4 Normal morphology of Candid a albicans ×10000
图5 药物作用5h后
Fig. 5 After treatment with α-pinene for 5h ×10000
图6 药物作用8h后
Fig. 6 After treatment with α-pinene f or 8h ×7500
2.4 同位素前体掺入试验 结果见附表。白念珠菌的 TdR，UR，亮氨酸和醋酸钠的掺入抑制率明显增高。
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附表 α-蒎烯对白念珠菌四种同位素标记前体的掺入抑制率(
±s,n=10) 药物浓度
掺入 抑制率(%)
TdR
UR
亮氨酸
NaAc
1/2MIC
38.45±2.83
40.36±3.88
39.17±3.64
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74.08±4.80
MIC
46.42±3.62
54.16±4.02
50.68±6.02
80 .47±4.63
2MIC
62.06±4.66
78.28±5.78
58.24±3.86
8 9.36±5.82
3 讨 论
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α-蒎烯对白念珠菌有明显的抑菌和杀菌作用[1]。本研究通过透射电镜观察发现经α-蒎烯作用后的白念珠菌，其形态和超微结构明显改变，细胞壁及细胞膜彻底破坏，胞核破碎，线粒体膜破损，变形，胞浆内容物漏出，细胞呈“空壳”状。扫描电镜下观察发现，细胞变形，胞壁、胞膜凹陷、萎缩，菌细胞溶解，最后融合成块状物。同位素前体掺入试验显示，α-蒎烯能明显地抑制TdR,UR，亮氨酸及醋酸钠4种标记前体对白色念珠菌菌体的掺入，其掺入抑制率均高，表明4种标记前体的掺入同时受抑制，尤其以NaAc的掺入受抑更为明显。
真菌细胞壁是菌细胞最外层结构，它在维持真菌形态及胞内高渗状态起着极为重要的作用。细胞膜主要功能是物质转运与营养、呼吸及生物合成作用。这些结构一旦被破坏，其功能作用丧失，将导致细胞死亡。
真菌的结构及化学组成极为复杂，其核酸的主要成份为DNA，RNA含量较少；胞壁中主要成分为几丁质(chitin)，葡萄糖和甘露聚糖；胞膜的化学组成主要为麦角固醇[7，8]，一旦这些成份合成受到抑制，可导致菌细胞死亡。本研究结果显示，α-蒎烯明显地抑制了4种标记前体对白念珠菌菌体的掺入，表明α-蒎烯对白念珠菌的DNA与RNA的合成，对胞壁中多糖成份的合成以及对胞膜中麦角固醇的合成均有明显的抑制作用。
, 百拇医药
笔者认为α-蒎烯可能是通过抑制白念珠菌的DNA和RNA的合成，抑制胞壁中多糖成分及胞膜上麦角固醇的合成，导致菌细胞破裂而起到杀菌作用。
参 考 文 献
1 李开泉，唐陶.山苍子油抗真菌有效成分的研究.中国医学院药学杂志，1986，6(11)：3～4
2 陈拯.酵母样真菌的体外抗菌药物敏感试验.见：李影林主编.临床微生物学及检验.北京：人民卫生出版社，1995：101～106
3 Tokunaga M, Kusamichi M, Koike U. Ultrastructure of outermost Layer of cell wall in Candida albicans obsverved by rapid-freezing technique. J Electron micro sc, 1986,35:237～246
, 百拇医药
4 Klainer AS, Perkins RL. Antibiotic-induced alterations in the surface morpho logy of bacterial cell. A scanning beam electronmicroscope study. J Infect Dis, 1990,122(4):323～326
5 Tanaka H, Kawakita K, Suzuki H, et al. The mode of action of cervinomycin in staphylococcus aureus. J Antibiot, 1989,(3):431～439
6 Benbook DM, Miller RV. Efects of norfloxacin on DNA metabolism in pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother, 1986,29(1):1～6
7 Georgopapadakou NH, Bertasso A. Effecs of sualene epoxidase inhibitors on Can dida albicans. Antimicrob Agents Chemother, 1992,36(8):1779～1781
8 Kuhn PJ, Trinic APJ, Jung MJ, et al. Biochemistry of cell walls and membranes in fugi. Germany, Berlin Heldberg: Spring-Verlag, 1991:61～63, http://www.100md.com
单位：(微生物学教研室 长沙 410078)
关键词：抗真菌剂；α-蒎烯*；白念珠菌；超微结构；同位素标记；药物作用
湖南医科大学学报990604
提要 应用电镜及同位素掺入试验，研究α-蒎烯的抗真菌作用及其机制。结果表明：α-蒎烯对白念珠菌有明显的抑菌和杀菌作用。电镜下，α-蒎烯作用后的白念珠菌，其形态和超微结构发生明显的变化，菌细胞壁及细胞膜破裂，菌体内容物漏出，菌细胞裂解后成块状物；DNA，RNA及胞壁中多糖和胞膜的麦角固醇合成受到明显的抑制。提示α-蒎烯抗真菌的作用机制是通过抑制真菌的DNA，RNA，多糖及麦角固醇的生物合成所致。
中国图书分类号 R519.3
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Study on antifungal mechanism of α-pinene
Xia Zhongdi Mao Xuezheng Luo Yinghui
(Department of Microbiology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
The antifungus mechanism of α-pinene was studied using electronic mic roscopy and incorporation of isotope-labelled precursor. The results demonstrated that α-pinene had significant roles in inhibiting and killing Candida albicans. After treatment with α-pinene the fungal morphology and ultrastructure showed obvious changes: their cell wall and cytoplasmic membrane ruptured; intracellar components released out and the cell residue fused to form irregular masses. In addition, the synthesis of DNA, RNA, polysacchanide of cell wall and ergosterol of cytoplasmic membrane was inhibited. It is indicated that these changes are related to antifungal mechanism of α-pinene.
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Key words antifungal agents; α-pinene; Candida albicans; ultrastructure; isotope labelling; drug effects
α-蒎烯系植物性芳香油单体，对许多害虫具有较强的杀灭作用，是目前防治储粮虫害的常用除虫剂防霉剂，且具有广谱抗真菌作用[1]，国内外尚未见有关其抗菌机制的报道。本研究采用电镜下观察白念珠菌超微结构的变化及同位素标记技术，从分子水平探讨α-蒎烯抗真菌的作用机制，旨在为其进一步药用开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌株与试剂 (1)菌株：白念珠菌(ID16V1)由中国医学科学院真菌保存中心提供。(2)α-蒎烯：由湖南省粮油研究所提供。(3)同位素标记：前体[3H]-TdR,[3H]-UR，[3H]-亮氨酸及[14C]-醋酸钠，均由中国科学院上海核技术开发公司提供。
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1.2 方法
1.2.1 MIC和MBC测定[2] 经沙氏液体培养基培养的白念珠菌用生理盐水将其菌落洗下，并调整菌液浓度为OD=0.2，与不同浓度的α-蒎烯作试管内抑菌试验，测其MIC和MBC，试验重复5次。
1.2.2 透射电镜(TEM)标本制备及观察[3] 将白念珠菌经沙氏液体培养基常规培养后，取对数生长期菌落并调整菌液浓度为OD=0.2,将菌液与α-蒎烯(MIC浓度)分别作用于5h及8h后，将标本用2.5%戌二醛固定并制成琼脂块，经锇酸后固定、滴膜、脱水、切片、染色，置TEM(H600A-2型)观察。
1.2.3 扫描电镜(SEM)标本的制备与观察[4] 取α-蒎烯(MIC浓度)与白念珠菌液(浓度为OD=0.2)分别作用于5h及8h，加2.5%戌二醛固定，再经锇酸后固定、滴膜、脱水、喷金，置SEM(JSM-300)观察。
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1.2.4 同位素前体掺入试验[5，6] 以[3H]-TdR，[3H]-UR，[3H]-亮氨酸和[14C]-NaAC分别作掺入前体进行同位素掺入试验，以1/2MIC，MIC，2MIC的α-蒎烯分别作用于对数生长期的白念珠菌，测定α-蒎烯对白念珠菌的DNA，RNA，多糖及麦角固醇的生物合成的影响，取对数生长期的白念珠菌菌液5.4ml，分别加入3μCi同位素标记前体和0.6ml不同浓度的α-蒎烯液，同时用生理盐水代替α-蒎烯作对照，置28℃振荡培养30min，样品通过Whetman玻璃纤维滤纸过滤，滤纸分别用10ml5%TCA及10mlDW各洗3次，37℃烘干后置5ml闪烁液中于BechmanLS3001液体闪烁计数器中检测，测出CPM值。将试验组与对照组的平均CPM值进行比较，计数掺入抑制率。
2 结 果
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2.1 MIC和MBC测定 α-蒎烯对白念珠菌的MIC和MBC均为1∶1280。
2.2 透射电镜观察结果 白念珠菌正常形态呈椭圆形，细胞结构清晰，完整，细胞壁，细胞膜光滑，层次清楚，胞核明显，胞浆内线粒体清晰可见(图1)，经α-蒎烯作用5h后，细胞变形，结构模糊，细胞壁疏松，多处有裂口，胞膜丧失，胞浆内容物漏出，胞核破碎，线粒体膜破损、变形(图2)。作用8h后，细胞壁及细胞膜彻底破坏，碎片融合，胞浆内容物全部漏出呈“空壳”状(图3)。
图1 白念珠菌超微结构
Fig. 1 Ultrastructural of Ca ndida albicans ×30000
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图2 药物作用5h后
Fig. 2 Ultrastructural changes after tre atment with α-pinene for 5h ×20000
图3 药物作用8h后
Fig. 3 After treatment with α-pinene f or 8h ×30000
2.3 扫描电镜观察 正常白念珠菌呈圆形或椭圆形，表面光滑，菌细胞以芽生孢子方式产生子代细胞，并相互连接成串(图4)。经α-蒎烯作用5h后，细胞变形，表面凹陷、萎缩，菌细胞间界线不清，有的出现细胞融合现象(图5)；作用8h后，细胞形态不清，结构破坏，菌细胞彻底破裂、溶解并融合成皱结状块状物(图6)。
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图4 白念珠菌正常形态
Fig. 4 Normal morphology of Candid a albicans ×10000
图5 药物作用5h后
Fig. 5 After treatment with α-pinene for 5h ×10000
图6 药物作用8h后
Fig. 6 After treatment with α-pinene f or 8h ×7500
2.4 同位素前体掺入试验 结果见附表。白念珠菌的 TdR，UR，亮氨酸和醋酸钠的掺入抑制率明显增高。
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附表 α-蒎烯对白念珠菌四种同位素标记前体的掺入抑制率(
±s,n=10) 药物浓度掺入 抑制率(%)
TdR
UR
亮氨酸
NaAc
1/2MIC
38.45±2.83
40.36±3.88
39.17±3.64
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74.08±4.80
MIC
46.42±3.62
54.16±4.02
50.68±6.02
80 .47±4.63
2MIC
62.06±4.66
78.28±5.78
58.24±3.86
8 9.36±5.82
3 讨 论
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α-蒎烯对白念珠菌有明显的抑菌和杀菌作用[1]。本研究通过透射电镜观察发现经α-蒎烯作用后的白念珠菌，其形态和超微结构明显改变，细胞壁及细胞膜彻底破坏，胞核破碎，线粒体膜破损，变形，胞浆内容物漏出，细胞呈“空壳”状。扫描电镜下观察发现，细胞变形，胞壁、胞膜凹陷、萎缩，菌细胞溶解，最后融合成块状物。同位素前体掺入试验显示，α-蒎烯能明显地抑制TdR,UR，亮氨酸及醋酸钠4种标记前体对白色念珠菌菌体的掺入，其掺入抑制率均高，表明4种标记前体的掺入同时受抑制，尤其以NaAc的掺入受抑更为明显。
真菌细胞壁是菌细胞最外层结构，它在维持真菌形态及胞内高渗状态起着极为重要的作用。细胞膜主要功能是物质转运与营养、呼吸及生物合成作用。这些结构一旦被破坏，其功能作用丧失，将导致细胞死亡。
真菌的结构及化学组成极为复杂，其核酸的主要成份为DNA，RNA含量较少；胞壁中主要成分为几丁质(chitin)，葡萄糖和甘露聚糖；胞膜的化学组成主要为麦角固醇[7，8]，一旦这些成份合成受到抑制，可导致菌细胞死亡。本研究结果显示，α-蒎烯明显地抑制了4种标记前体对白念珠菌菌体的掺入，表明α-蒎烯对白念珠菌的DNA与RNA的合成，对胞壁中多糖成份的合成以及对胞膜中麦角固醇的合成均有明显的抑制作用。
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笔者认为α-蒎烯可能是通过抑制白念珠菌的DNA和RNA的合成，抑制胞壁中多糖成分及胞膜上麦角固醇的合成，导致菌细胞破裂而起到杀菌作用。
参 考 文 献
1 李开泉，唐陶.山苍子油抗真菌有效成分的研究.中国医学院药学杂志，1986，6(11)：3～4
2 陈拯.酵母样真菌的体外抗菌药物敏感试验.见：李影林主编.临床微生物学及检验.北京：人民卫生出版社，1995：101～106
3 Tokunaga M, Kusamichi M, Koike U. Ultrastructure of outermost Layer of cell wall in Candida albicans obsverved by rapid-freezing technique. J Electron micro sc, 1986,35:237～246
, 百拇医药
4 Klainer AS, Perkins RL. Antibiotic-induced alterations in the surface morpho logy of bacterial cell. A scanning beam electronmicroscope study. J Infect Dis, 1990,122(4):323～326
5 Tanaka H, Kawakita K, Suzuki H, et al. The mode of action of cervinomycin in staphylococcus aureus. J Antibiot, 1989,(3):431～439
6 Benbook DM, Miller RV. Efects of norfloxacin on DNA metabolism in pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother, 1986,29(1):1～6
7 Georgopapadakou NH, Bertasso A. Effecs of sualene epoxidase inhibitors on Can dida albicans. Antimicrob Agents Chemother, 1992,36(8):1779～1781
8 Kuhn PJ, Trinic APJ, Jung MJ, et al. Biochemistry of cell walls and membranes in fugi. Germany, Berlin Heldberg: Spring-Verlag, 1991:61～63, http://www.100md.com