C57BL/6J小鼠脂肪细胞抵抗胰岛素抑制脂解的分析
作者：文秀英
单位：同济医科大学附属梨园医院(武汉，430077)
关键词：C57BL/6J小鼠；A/J小鼠；脂肪细胞；脂解作用；胰岛素抵抗
中国慢性病预防与控制990606 摘要 为了从细胞水平探讨C57BL/6J和A/J小鼠对胰岛素(Ins)的敏感性，该实验分离了这两种小鼠的脂肪细胞，观察Ins抑制脂肪细胞在异丙肾上腺素介导下的脂解作用，以甘油的释放量作为脂解的指标。结果表明：C57BL/6J的脂肪细胞在Ins 400和800 pmol时甘油的释放量多于A/J(P<0.01)，即Ins抗脂解能力显著低于A/J小鼠，提示C57BL/6J小鼠脂肪细胞抵抗Ins抑制脂解。这与C57BL/6J为什么易于发生2型糖尿病可能存在病理生理方面的联系。
中图分类号 R587.101
, http://www.100md.com
文献标识码 A
Insulin-Resistant Lipolysis in Adipocytes Isolated from C57BL/6J Mice
Wen Xiuying
Liyuan Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430077
Abstract It has been demonstrated that C57BL/6J mice is prone to develop non-insulin-dependent diabetes mellitus (NIDDM),but A/J mice isn't.NIDDM is related to insulin resistance.However,it is unknown whether C57BL/6J mice exist insulin resistance before developing NIDDM.In order to investigate insulin sensitivity from cellular level,we assessed the effect of insulin inhibiting the isoproterenol-induced lipolysis in adipocytes isolated from C57BL/6J and A/J mice.Glycerol released from adipocyte medium was used as the index of lipolysis,Glycerol concentration was significantly higher in adipocytes from C57BL/6J than that from A/J at 400 and 800 pmol insulin in medium(P<0.01).That meant the ability of insulin inhibiting lipolysis was lower in adipocyte of C57BL/6J than in that of A/J.Resistance to the antilipolytic action of insulin in adipocyte from C57BL/6J may be associated with the susceptibility to develop NIDDM of C57BL/6J mice in pathophysiology.
, 百拇医药
Key words C57BL/6J mouse A/J mouse Adipocyte Lipolysis Insulin resistance
近交系小鼠在基因特征方面能提供不同的个体，其与某一疾病的关系将帮助人类基因的分析〔1～2〕。国外对近交系小鼠如C57BL/6J和A/J进行了许多研究，表明C57BL/6J断奶时喂以高脂高单糖饮食将发展成2型糖尿病(NIDDM)、A/J不发生〔3〕。而NIDDM与胰岛素(Ins)敏感性降低有关〔4〕，C57BL/6J在诱发NIDDM之前对Ins的敏感性如何还没有报道。因此我们分离C57BL/6J和A/J的脂肪细胞，探讨Ins抑制脂肪细胞在异丙肾上腺素介导下的脂解作用，以评价两种小鼠脂肪细胞对Ins的敏感性。
1 材料和方法
1.1 动物 C57BL/6J小鼠和A/J小鼠、各12只，雄性，10～11周龄，购于美国Jackson Laboratory。
, 百拇医药
1.2 分离小鼠脂肪细胞、计算细胞比积、细胞数和细胞大小 用Rodbell的方法〔5〕分离脂肪细胞，简介：取下小鼠双侧附睾的脂肪垫，将两只小鼠的脂肪垫放在一起供一次实验用，剪碎脂肪垫，置入盛有5 ml Kreb-Ringer-Hepes缓冲液的聚乙烯瓶中，缓冲液中含有1 mg/ml胶原酶(typeⅠ，worthington,NJ,USA)、3.5% BSA、3 mmol 葡萄糖，pH7.4，在37℃水浴箱中消化45 min,然后将细胞通过250 μm尼龙滤膜，用含3% BSA的Krebs-Ringer--Bicarbonate(KRB)缓冲液洗涤3次，配制含10%～15%细胞比积的细胞悬液用于细胞计数和脂解。50 μl细胞用三氧化锇固定后，用Coulter Counter(Hialeah,FL,USA)测细胞数。根据细胞数、细胞比积及校正系数(0.915 μg lipid/nl cell volume)计算细胞容积大小〔4〕。
1.3 脂肪分解的测试 50 μl细胞加到盛有450 μl KRB缓冲液的口径1.5 cm的塑料管中(每一标本均分为双份)，加入2.5 mmol葡萄糖、3% BSA、10-7异丙肾上腺素和不同浓度的Ins,pH7.4，置于37℃、95% O2+5% CO2的水浴振摇箱、以40 cpm的速度轻摇、孵1 h，将细胞反应液移至软塑料管，静置5 min待脂肪细胞上浮后，用针头于塑料管底部插一小孔，移去下清液，用Wieland的酶法〔6〕测试甘油释放量，此值代表脂肪分解的指标，测甘油的试剂盒购于Sigma公司。
, 百拇医药
1.4 数据处理 用Sigmastat软件在计算机作统计分析，统计方法用unpaired t-Test,所有数据均用
±s表示。
2 结果
2.1 实验动物的一般情况(见表1) 两种小鼠的年龄、体重、脂肪垫重量、脂肪细胞大小均无显著性差异。
表1 小鼠的一般资料(±s)
n
年龄
(day)
体重
, 百拇医药
(g)
脂肪垫重量
(g)
脂肪细胞大小
(μg lipid/cell)
C57BL/6J
12
69±3.0
23.7±0.37
0.36±0.02
0.22±0.016
A/J
, 百拇医药
12
74±4.3
23.5±0.39
0.32±0.01
0.25±0.015
2.2 Ins对脂肪细胞在异丙肾上腺素介导下进行脂解的抑制作用(见图1) 以甘油的释放量表示脂解的程度，C57BL/6J的脂肪细胞在Ins 400和800pmol时甘油释放量多于A/J(P<0.01)，即Ins抗脂解能力显著低于A/J小鼠；或以百分率表示脂解抑制的程度，亦说明Ins对C57BL/6J脂肪细胞脂解的抑制作用显著低于A/J。
, http://www.100md.com
图1 胰岛素对C57BL/6J和A/J小鼠脂肪细胞在异丙肾上腺素(10-7)介导下脂解的抑制作用
注：A—以培养基中甘油量表示脂解速率；B—胰岛素抑制脂解的百分率。结果以±s表示。**为P<0.01(C57BL/6J vs A/J)
3 讨论
Ins的主要作用之一是通过抑制脂解速率而调节脂肪动员，体外试验已证明Ins能抑制脂肪细胞在异丙肾上腺素介导下的脂解作用〔7〕，如果抑制脂解的作用降低，为Ins抵抗的现象之一〔8〕。我们的实验结果表明：C57BL/6J小鼠脂肪细胞对Ins抑制脂解的反应没有A/J小鼠敏感，即：C57BL/6J脂肪细胞存在一定程度的抵抗Ins抑制脂解的现象。这只是一个方面的实验，如果要了解C57BL/6J整体是否存在Ins抵抗，还需研究脂肪细胞在Ins刺激下的葡萄糖转运和氧化、Ins敏感性实验、测试血中Ins、葡萄糖和自由脂肪酸等指标进行综合评价〔3，9〕。本文第一次报道C57BL/6J和A/J小鼠脂肪细胞对Ins抑制脂解的敏感性存在差异，亦是国内第一次介绍小鼠脂肪细胞脂解的实验方法。
, 百拇医药
NIDDM存在Ins抵抗是病因还是结果尚无清楚的解释。本文提示C57BL/6J在诱发NIDDM之前，其脂肪细胞抵抗Ins抑制脂解，这与C57BL/6J易于诱发NIDDM可能存在病理生理方面的联系；而A/J小鼠脂肪细胞对Ins敏感，不易诱发NIDDM。临床上NIDDM多发于中老年，C57BL/6J在增龄或老化后是否会自发NIDDM或Ins抵抗综合征值得进一步探讨。这对研究不同种系小鼠基因表型与NIDDM的关系将提供一些依据。
(本文受美国Stanford University的Gerald M.Reaven教授指导，在此致谢!)
参考文献
1 Hedrich HJ.Genetic monitoring.In the mouse in biomedical research.Vol.1.Foster HL,Small JD,Fox JG,Eds.New York,Academic,1981,P159～176
, http://www.100md.com
2 Searie AG,Peter J,Lyon MF,et al.Chromosome maps of man and mouse.Genomics,1987,1∶3
3 Surwit RS,Kuhn CM,Cochran C,et al.Diet-induce type 2 diabetes in C57BL/6J mice.Diabetes,1988,37∶1163
4 Kashiwagi A,Verso MA,Andrews J,et al.In vitro insulin resistance of human adipocytes isolated from subjects with NIDDM.J Clin Investigation,1983,72∶1246
5 Rodbell M.Metabolism of isolated fat cells.I.Effects of hormones on glucose metabolism and lipolysis.J Biol Chem,1964,239∶375
, 百拇医药
6 Wieland O.Glycerol:UV method.Methods Enzymatic Anal,1964,3∶1404
7 Fain JN,Kovacev VP,Scow RO.Antilipolytic effects of insulin in isolated fat cells of the rat.Endocrinology,1966,78∶773
8 Hennes MM,O'shaughnessy IM,Kelly TM,et al.Insulin-resistant lipolysis in abdominally obese hypertension individuals.Role of the renin-angiotensin system.Hypertension,1996,28∶120
9 Moller DE,Flier JS.Insulin resistance-mechanism,syndromes,and implications.New Eng J Med,1991,325∶938
(收稿：1998-07-10 修回：1998-10-10), http://www.100md.com
单位：同济医科大学附属梨园医院(武汉，430077)
关键词：C57BL/6J小鼠；A/J小鼠；脂肪细胞；脂解作用；胰岛素抵抗
中国慢性病预防与控制990606 摘要 为了从细胞水平探讨C57BL/6J和A/J小鼠对胰岛素(Ins)的敏感性，该实验分离了这两种小鼠的脂肪细胞，观察Ins抑制脂肪细胞在异丙肾上腺素介导下的脂解作用，以甘油的释放量作为脂解的指标。结果表明：C57BL/6J的脂肪细胞在Ins 400和800 pmol时甘油的释放量多于A/J(P<0.01)，即Ins抗脂解能力显著低于A/J小鼠，提示C57BL/6J小鼠脂肪细胞抵抗Ins抑制脂解。这与C57BL/6J为什么易于发生2型糖尿病可能存在病理生理方面的联系。
中图分类号 R587.101
, http://www.100md.com
文献标识码 A
Insulin-Resistant Lipolysis in Adipocytes Isolated from C57BL/6J Mice
Wen Xiuying
Liyuan Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430077
Abstract It has been demonstrated that C57BL/6J mice is prone to develop non-insulin-dependent diabetes mellitus (NIDDM),but A/J mice isn't.NIDDM is related to insulin resistance.However,it is unknown whether C57BL/6J mice exist insulin resistance before developing NIDDM.In order to investigate insulin sensitivity from cellular level,we assessed the effect of insulin inhibiting the isoproterenol-induced lipolysis in adipocytes isolated from C57BL/6J and A/J mice.Glycerol released from adipocyte medium was used as the index of lipolysis,Glycerol concentration was significantly higher in adipocytes from C57BL/6J than that from A/J at 400 and 800 pmol insulin in medium(P<0.01).That meant the ability of insulin inhibiting lipolysis was lower in adipocyte of C57BL/6J than in that of A/J.Resistance to the antilipolytic action of insulin in adipocyte from C57BL/6J may be associated with the susceptibility to develop NIDDM of C57BL/6J mice in pathophysiology.
, 百拇医药
Key words C57BL/6J mouse A/J mouse Adipocyte Lipolysis Insulin resistance
近交系小鼠在基因特征方面能提供不同的个体，其与某一疾病的关系将帮助人类基因的分析〔1～2〕。国外对近交系小鼠如C57BL/6J和A/J进行了许多研究，表明C57BL/6J断奶时喂以高脂高单糖饮食将发展成2型糖尿病(NIDDM)、A/J不发生〔3〕。而NIDDM与胰岛素(Ins)敏感性降低有关〔4〕，C57BL/6J在诱发NIDDM之前对Ins的敏感性如何还没有报道。因此我们分离C57BL/6J和A/J的脂肪细胞，探讨Ins抑制脂肪细胞在异丙肾上腺素介导下的脂解作用，以评价两种小鼠脂肪细胞对Ins的敏感性。
1 材料和方法
1.1 动物 C57BL/6J小鼠和A/J小鼠、各12只，雄性，10～11周龄，购于美国Jackson Laboratory。
, 百拇医药
1.2 分离小鼠脂肪细胞、计算细胞比积、细胞数和细胞大小 用Rodbell的方法〔5〕分离脂肪细胞，简介：取下小鼠双侧附睾的脂肪垫，将两只小鼠的脂肪垫放在一起供一次实验用，剪碎脂肪垫，置入盛有5 ml Kreb-Ringer-Hepes缓冲液的聚乙烯瓶中，缓冲液中含有1 mg/ml胶原酶(typeⅠ，worthington,NJ,USA)、3.5% BSA、3 mmol 葡萄糖，pH7.4，在37℃水浴箱中消化45 min,然后将细胞通过250 μm尼龙滤膜，用含3% BSA的Krebs-Ringer--Bicarbonate(KRB)缓冲液洗涤3次，配制含10%～15%细胞比积的细胞悬液用于细胞计数和脂解。50 μl细胞用三氧化锇固定后，用Coulter Counter(Hialeah,FL,USA)测细胞数。根据细胞数、细胞比积及校正系数(0.915 μg lipid/nl cell volume)计算细胞容积大小〔4〕。
1.3 脂肪分解的测试 50 μl细胞加到盛有450 μl KRB缓冲液的口径1.5 cm的塑料管中(每一标本均分为双份)，加入2.5 mmol葡萄糖、3% BSA、10-7异丙肾上腺素和不同浓度的Ins,pH7.4，置于37℃、95% O2+5% CO2的水浴振摇箱、以40 cpm的速度轻摇、孵1 h，将细胞反应液移至软塑料管，静置5 min待脂肪细胞上浮后，用针头于塑料管底部插一小孔，移去下清液，用Wieland的酶法〔6〕测试甘油释放量，此值代表脂肪分解的指标，测甘油的试剂盒购于Sigma公司。
, 百拇医药
1.4 数据处理 用Sigmastat软件在计算机作统计分析，统计方法用unpaired t-Test,所有数据均用
±s表示。2 结果
2.1 实验动物的一般情况(见表1) 两种小鼠的年龄、体重、脂肪垫重量、脂肪细胞大小均无显著性差异。
表1 小鼠的一般资料(
±s)n
年龄
(day)
体重
, 百拇医药
(g)
脂肪垫重量
(g)
脂肪细胞大小
(μg lipid/cell)
C57BL/6J
12
69±3.0
23.7±0.37
0.36±0.02
0.22±0.016
A/J
, 百拇医药
12
74±4.3
23.5±0.39
0.32±0.01
0.25±0.015
2.2 Ins对脂肪细胞在异丙肾上腺素介导下进行脂解的抑制作用(见图1) 以甘油的释放量表示脂解的程度，C57BL/6J的脂肪细胞在Ins 400和800pmol时甘油释放量多于A/J(P<0.01)，即Ins抗脂解能力显著低于A/J小鼠；或以百分率表示脂解抑制的程度，亦说明Ins对C57BL/6J脂肪细胞脂解的抑制作用显著低于A/J。
, http://www.100md.com
图1 胰岛素对C57BL/6J和A/J小鼠脂肪细胞在异丙肾上腺素(10-7)介导下脂解的抑制作用
注：A—以培养基中甘油量表示脂解速率；B—胰岛素抑制脂解的百分率。结果以
±s表示。**为P<0.01(C57BL/6J vs A/J)3 讨论
Ins的主要作用之一是通过抑制脂解速率而调节脂肪动员，体外试验已证明Ins能抑制脂肪细胞在异丙肾上腺素介导下的脂解作用〔7〕，如果抑制脂解的作用降低，为Ins抵抗的现象之一〔8〕。我们的实验结果表明：C57BL/6J小鼠脂肪细胞对Ins抑制脂解的反应没有A/J小鼠敏感，即：C57BL/6J脂肪细胞存在一定程度的抵抗Ins抑制脂解的现象。这只是一个方面的实验，如果要了解C57BL/6J整体是否存在Ins抵抗，还需研究脂肪细胞在Ins刺激下的葡萄糖转运和氧化、Ins敏感性实验、测试血中Ins、葡萄糖和自由脂肪酸等指标进行综合评价〔3，9〕。本文第一次报道C57BL/6J和A/J小鼠脂肪细胞对Ins抑制脂解的敏感性存在差异，亦是国内第一次介绍小鼠脂肪细胞脂解的实验方法。
, 百拇医药
NIDDM存在Ins抵抗是病因还是结果尚无清楚的解释。本文提示C57BL/6J在诱发NIDDM之前，其脂肪细胞抵抗Ins抑制脂解，这与C57BL/6J易于诱发NIDDM可能存在病理生理方面的联系；而A/J小鼠脂肪细胞对Ins敏感，不易诱发NIDDM。临床上NIDDM多发于中老年，C57BL/6J在增龄或老化后是否会自发NIDDM或Ins抵抗综合征值得进一步探讨。这对研究不同种系小鼠基因表型与NIDDM的关系将提供一些依据。
(本文受美国Stanford University的Gerald M.Reaven教授指导，在此致谢!)
参考文献
1 Hedrich HJ.Genetic monitoring.In the mouse in biomedical research.Vol.1.Foster HL,Small JD,Fox JG,Eds.New York,Academic,1981,P159～176
, http://www.100md.com
2 Searie AG,Peter J,Lyon MF,et al.Chromosome maps of man and mouse.Genomics,1987,1∶3
3 Surwit RS,Kuhn CM,Cochran C,et al.Diet-induce type 2 diabetes in C57BL/6J mice.Diabetes,1988,37∶1163
4 Kashiwagi A,Verso MA,Andrews J,et al.In vitro insulin resistance of human adipocytes isolated from subjects with NIDDM.J Clin Investigation,1983,72∶1246
5 Rodbell M.Metabolism of isolated fat cells.I.Effects of hormones on glucose metabolism and lipolysis.J Biol Chem,1964,239∶375
, 百拇医药
6 Wieland O.Glycerol:UV method.Methods Enzymatic Anal,1964,3∶1404
7 Fain JN,Kovacev VP,Scow RO.Antilipolytic effects of insulin in isolated fat cells of the rat.Endocrinology,1966,78∶773
8 Hennes MM,O'shaughnessy IM,Kelly TM,et al.Insulin-resistant lipolysis in abdominally obese hypertension individuals.Role of the renin-angiotensin system.Hypertension,1996,28∶120
9 Moller DE,Flier JS.Insulin resistance-mechanism,syndromes,and implications.New Eng J Med,1991,325∶938
(收稿：1998-07-10 修回：1998-10-10), http://www.100md.com