人类小涎腺腺样囊性癌NACC细胞系的建立及腺样囊性癌生物学特性的研究*
作者：农晓琳 蒙 敏 李佳荃 周 诺
单位：农晓琳 蒙 敏 周 诺(广西医科大学附属口腔医学院口腔颌面外科 南宁 530021); 李佳荃 广西医科大学第一附属医院外科
关键词：腺样囊性癌；细胞系；生物学特性
广西医科大学学报990601
摘要 目的：建立一个人类腭部涎腺腺样囊性癌细胞系并对其生物学特性作进一步探讨。方法：取人腭部小涎腺腺样囊性癌组织经原代培养并传代成系，命名为NACC细胞系。采用免疫组化法对NACC细胞系及另一涎腺腺样囊性癌细胞系SACC-83行多种细胞中间丝染色。结果：NACC细胞为亚三倍体核型、单层贴壁生长的上皮癌细胞系,异种接种可致瘤。NACC及SACC-83细胞均有抗keratin，GFAP,EMA,smooth muscle actin,vimentin,S-100蛋白不同程度阳性。结论：NACC细胞系生长稳定，为源自干细胞的不同分化程度和发育周期的癌细胞所组成的细胞群体，可能含有肿瘤性闰管细胞、 肌上皮细胞及未分化的多潜能干细胞等细胞成分，保持了腺样囊性癌的大部分特性。行体内、外试验时能较好地反映该类肿瘤的生物学特性。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R739.87
ESTABLISHMENT OF A NOOVEL HUMAN PALATAL SALIVARY GLAND CELL LINE OF ADENOID CYSTIC CARCINOMA AND A STUDY OF ITS BIOLOGICAL BEHAVIOR
Nong Xiaolin,Meng Ming,Li Jiaquan,et al
(The Affiliated Hospital of Stomatology,Guangxi Medical University.Nanning,530021)
Abstract Objective:To establish a salivary gland adenoid cystic carcinoma (ACC) cell line and analyze its biological behavior.Methods:Primary culture method was used to establish a cell line named NACC from tumor blocks of a patient with palate ACC.Biological behavior,cellular contents,chromosome of the cell line were analysed.Immunohistiochemical stains were performed to identify seveal kinds of intermediate filaments on NACC.Results:NACC is a monolayer anchorage dependence cells line with aneuploid triploidy.Nude mice transplantation created tumor mass.Positive stain of keratin,vimentin,smooth muscle actin,GFAP,EMA,Lys were demonstrated on NACC and SACC-83 cells respectively.Conclusion：NACC cell line keep majority characteristic of ACC,could be a good symbol of ACC in vitro.
, http://www.100md.com
Key words adenoid cystic carcinoma；cell line；biological behavior
腺样囊性癌(ACC)是难治、易复发及转移的涎腺恶性肿瘤之一。研究其生物学特性常要求有生活状态下或较新鲜的标本。 作者用癌组织块原代培养的方法建立了一个人类腭部小涎腺腺样囊性癌细胞系，命名为NACC。
1 材料与方法
1.1主要试剂及来源：鼠抗keratin、鼠抗GFAP、鼠抗EMA(军事医学科学院)。鼠抗smooth muscle actin、兔抗Lysozyme(DAKO公司)。兔抗actin、鼠抗vimentin(ZYMED公司)。兔抗S-100蛋白(迈新公司)。
1.2 NACC细胞系的建立：供体组织取自一例女性腭部腺样囊性癌患者(T1N0M0)。无菌取材。常规原代培养，反复传代去除非肿瘤成分而成系，命名为NACC细胞系。
, http://www.100md.com
1.3 NACC细胞形态学观察：取附在玻片上生长的细胞瑞氏-姬姆萨染色并常规制作透射电镜标本,光镜及日立JSM-T300扫描电镜下观察细胞形态。消化、收集细胞，制标本，JEOL JEM-1200EX透射电镜下观察。
1.4 NACC细胞生长特性：第100代细胞以2×105 cell/3 ml接种于25 ml培养瓶。接种后2，4，8，24 h计算各时间贴壁率。消化计数法观察5～6 d，制作细胞生长曲线见图1。以每瓶2× 105 cell/4 m1的浓度接种细胞，每隔24 h瑞氏染色镜下计数1000个细胞中的分裂细胞数。常法制作NACC细胞染色体片，选择100个染色体分散良好的细胞,油镜下行染色体计数。
图1 NACC细胞系生长曲线
将90代细胞制成5×106、5×107 cell/m1的细胞悬液。分别取0.2 ml注射于1月龄，体质量18～20.5 g的BALB/C/nu/nu裸鼠体侧皮下(动物由四川抗生素工业研究所动物房提供)。SPF环境饲养。接种后50、57、64 d处死动物，取瘤块，观察称重,制作组织标本。
, http://www.100md.com
1.5 细胞中间丝免疫组织化学染色：取单层培养于小载片条NACC细胞、SACC-83细胞(北京医科大学口腔学医院建系)及NACC细胞系裸鼠移植瘤块分别用多种抗细胞中间丝抗体作为一抗，SABC法常规免疫组化染色。
2 结 果
2.1NACC细胞系的形成：培养3周，组织块周围有圆形癌细胞游出。第4周末，圆形细胞开始长出突起，第9周，癌细胞融合形成大片状时开始传代。反复传代获纯净的上皮癌细胞。命名为人腭部小涎腺腺样囊性癌NACC细胞系。
2.2 NACC细胞形态学观察：细胞呈多角形镶嵌状排列，细胞质少、核大、不规则、核仁清晰，一般1～4个。细胞成分按形态可分为两种：一种细胞呈方块形、多个短突起。排列紧密呈镶嵌铺路石样，可重叠生长，接触抑制消失。重叠处细胞多呈圆形，堆积样生长，局部可呈筛孔状排列。另一种细胞呈星形、类梭形或有多突起，细胞突起较前者长，接触抑制消失的现象不明显。
, 百拇医药
透射电镜示：细胞核大、不规则。核仁多个、大、清晰、电子密度高。细胞质少，多数细胞细胞质内有丰富的糖原、大量变性的粗面内质网，见图2。
图2 NACC细胞系透射电镜 ×5000
扫描电镜：细胞相互间有较多的细胞突起、丝足、微绒毛。含两种形态细胞。方块形或类圆形细胞：突起短，微绒毛密集，遍及整个细胞。星形或类梭形细胞：突起长、大，微绒毛较前者少，胞突表面微绒毛分布少，见图3。
图3 NACC细胞系扫描电镜
2.3 NACC细胞生长特性：NACC细胞2，4，8，24 h贴壁率分别为47.5%，70%，73.8%，88.8%。生长曲线见图1。接种24 h后出现细胞分裂，分裂指数高峰在第3天，达 6.8%。染色体为非整倍体，以亚三倍体为主，各代均在90%以上。染色体维持于68～70条。
, http://www.100md.com
两种浓度的细胞接种裸鼠均可致瘤。瘤体外有薄层结缔组织包绕，瘤周及瘤内新生毛细血管丰富。瘤细胞增生活跃，核大、细胞质少，病理性核分裂象多见，瘤体周边癌细胞生长活跃，瘤组织团块样浸润包膜外肌层。
2.4 组织化学及免疫组织化学观察，见表1。
表1 各材料细胞中间丝表达 观察项目
NACC细胞裸
鼠移植瘤组织
NACC
SACC-83
keratin
-
+～++
, http://www.100md.com
++
vimentin
-
++
+
actin(smooth muscle)
++
++～+++
++
actin
-
-
+
, 百拇医药
GFAP
+
++
+++
EAM
++～+++
+++
+++
Lys
-
+++
+
S-100
, 百拇医药
+
+
++
3 讨 论
NACC细胞系供体来源明确，未经化疗、放疗。无细菌、真菌、支原体、衣原体等污染。符合建系要求。细胞呈上皮性癌的形态，贴壁率高，生长快，亚三倍体核型，传代100次以上仍保持旺盛的增殖。细胞异种移植可形成明显瘤块,瘤细胞呈恶性表现。
肿瘤的生长及转移有依赖新生血管形成[1]。NACC裸鼠移植瘤与其他恶性肿瘤一样,存在无血管的生长潜伏期和血管化期。瘤细胞具有诱导新生血管形成的特性,一旦有血管长入,瘤体生长加快。ACC诱导新生血管形成的机制及其与易沿血管、神经转移、扩散的特性的关系待探讨。Sobue[2]及Cheng等[3]均分别发现ACC细胞有较强的分泌及合成功能。在NACC细胞的电镜观察中未见明显的分泌性质的细胞器，但在培养观察中，可见到其可分泌粘液样的物质。
, 百拇医药
Chaudhry等[4]提出ACC源于多能干细胞由闰管细胞、分泌细胞、肌上皮细胞、多潜能干细胞组成。何荣根等[5]则认为ACC是由分化程度不一致和处在细胞个体发育周期不同阶段的细胞组成的非均质体。
免疫组化染色证实NACC细胞系符合腺样囊性癌细胞的特性。且与SACC-83细胞系的阳性表达相同，但在阳性程度上有所差别。培养细胞可表达细胞在体内生长时不表达的特性。keratin和vimentin的共同表达，在体内是罕见的，但对许多上皮性的细胞系来说是共同的特性。Levin等[6]对其建立的包括腺样囊性癌在内的19个良、恶性涎腺肿瘤细胞系的检测均显示两者的同时表达。vimentin可作为涎腺肿瘤中肌上皮细胞存在及分布的标志[7]。NACC及SACC-83均有较强的S-100蛋白、平滑肌特异性actin及vimentin的阳性表达，而普通actin表达弱或不表达。提示NACC，SACC-83细胞系均有肿瘤性肌上皮细胞。NACC细胞系亦为不同分化程度和发育周期的癌细胞所组成的细胞群体。方块形细胞可能为闰管细胞；星形及类梭形细胞为肌上皮细胞；核大，细胞质及细胞器少的可能为未分化多能干细胞。
, http://www.100md.com
*本课题由广西壮族自治区教育厅资助 编号 97095
参 考 文 献
1 Petruzzelli GJ.Tumor angiogenesis.Head Neck，1996,18(3):283～291
2 Sobue M,Taskeuchi J,Niwa M,et al.Establishment of a cell line producing basement membrane components from adenoid cystic carcinoma of the human salivary gland.Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol,1989,57(3):203～208
3 Cheng J,Irie T,Munakata R,et al.Biosynthesis of basement membrane molecules by salivary adenoid cystic carcinoma cells:an immunofluorescence and confocal microscopic study.Virchows Arch，1995,426(6):577～586
, http://www.100md.com
4 Chaudhry AP,Leifer C,Culter LS,et al.Histogenesis of adenoid cystic carcinoma of the salivary glands.Light and electron microscopic study.Cancer,1986,58(1):72～82
5 何荣根,张晓珊,周晓健,等.人涎腺腺样囊性癌Acc-2和Acc-3细胞系的建立及其形态学观察.华西口腔医学杂志,1988,6(1):1～3
6 Levin RJ,Bradley MK.Neuroectodermal antigens persist in benign and malignant salivary gland tumor cultures.Arch Otolaryngol Head Neck Surg,1996,122:551～557
7 de Araujo VC,Carvalho YR,de Araujo NS,et al.Actin versus vimentin in myoepithelial cells of salivary gland tumors.A comparative study.Oral Surg Oral Pathol,1994,77(4):387～391
收稿日期：1999-03-10, 百拇医药
单位：农晓琳 蒙 敏 周 诺(广西医科大学附属口腔医学院口腔颌面外科 南宁 530021); 李佳荃 广西医科大学第一附属医院外科
关键词：腺样囊性癌；细胞系；生物学特性
广西医科大学学报990601
摘要 目的：建立一个人类腭部涎腺腺样囊性癌细胞系并对其生物学特性作进一步探讨。方法：取人腭部小涎腺腺样囊性癌组织经原代培养并传代成系，命名为NACC细胞系。采用免疫组化法对NACC细胞系及另一涎腺腺样囊性癌细胞系SACC-83行多种细胞中间丝染色。结果：NACC细胞为亚三倍体核型、单层贴壁生长的上皮癌细胞系,异种接种可致瘤。NACC及SACC-83细胞均有抗keratin，GFAP,EMA,smooth muscle actin,vimentin,S-100蛋白不同程度阳性。结论：NACC细胞系生长稳定，为源自干细胞的不同分化程度和发育周期的癌细胞所组成的细胞群体，可能含有肿瘤性闰管细胞、 肌上皮细胞及未分化的多潜能干细胞等细胞成分，保持了腺样囊性癌的大部分特性。行体内、外试验时能较好地反映该类肿瘤的生物学特性。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R739.87
ESTABLISHMENT OF A NOOVEL HUMAN PALATAL SALIVARY GLAND CELL LINE OF ADENOID CYSTIC CARCINOMA AND A STUDY OF ITS BIOLOGICAL BEHAVIOR
Nong Xiaolin,Meng Ming,Li Jiaquan,et al
(The Affiliated Hospital of Stomatology,Guangxi Medical University.Nanning,530021)
Abstract Objective:To establish a salivary gland adenoid cystic carcinoma (ACC) cell line and analyze its biological behavior.Methods:Primary culture method was used to establish a cell line named NACC from tumor blocks of a patient with palate ACC.Biological behavior,cellular contents,chromosome of the cell line were analysed.Immunohistiochemical stains were performed to identify seveal kinds of intermediate filaments on NACC.Results:NACC is a monolayer anchorage dependence cells line with aneuploid triploidy.Nude mice transplantation created tumor mass.Positive stain of keratin,vimentin,smooth muscle actin,GFAP,EMA,Lys were demonstrated on NACC and SACC-83 cells respectively.Conclusion：NACC cell line keep majority characteristic of ACC,could be a good symbol of ACC in vitro.
, http://www.100md.com
Key words adenoid cystic carcinoma；cell line；biological behavior
腺样囊性癌(ACC)是难治、易复发及转移的涎腺恶性肿瘤之一。研究其生物学特性常要求有生活状态下或较新鲜的标本。 作者用癌组织块原代培养的方法建立了一个人类腭部小涎腺腺样囊性癌细胞系，命名为NACC。
1 材料与方法
1.1主要试剂及来源：鼠抗keratin、鼠抗GFAP、鼠抗EMA(军事医学科学院)。鼠抗smooth muscle actin、兔抗Lysozyme(DAKO公司)。兔抗actin、鼠抗vimentin(ZYMED公司)。兔抗S-100蛋白(迈新公司)。
1.2 NACC细胞系的建立：供体组织取自一例女性腭部腺样囊性癌患者(T1N0M0)。无菌取材。常规原代培养，反复传代去除非肿瘤成分而成系，命名为NACC细胞系。
, http://www.100md.com
1.3 NACC细胞形态学观察：取附在玻片上生长的细胞瑞氏-姬姆萨染色并常规制作透射电镜标本,光镜及日立JSM-T300扫描电镜下观察细胞形态。消化、收集细胞，制标本，JEOL JEM-1200EX透射电镜下观察。
1.4 NACC细胞生长特性：第100代细胞以2×105 cell/3 ml接种于25 ml培养瓶。接种后2，4，8，24 h计算各时间贴壁率。消化计数法观察5～6 d，制作细胞生长曲线见图1。以每瓶2× 105 cell/4 m1的浓度接种细胞，每隔24 h瑞氏染色镜下计数1000个细胞中的分裂细胞数。常法制作NACC细胞染色体片，选择100个染色体分散良好的细胞,油镜下行染色体计数。
图1 NACC细胞系生长曲线
将90代细胞制成5×106、5×107 cell/m1的细胞悬液。分别取0.2 ml注射于1月龄，体质量18～20.5 g的BALB/C/nu/nu裸鼠体侧皮下(动物由四川抗生素工业研究所动物房提供)。SPF环境饲养。接种后50、57、64 d处死动物，取瘤块，观察称重,制作组织标本。
, http://www.100md.com
1.5 细胞中间丝免疫组织化学染色：取单层培养于小载片条NACC细胞、SACC-83细胞(北京医科大学口腔学医院建系)及NACC细胞系裸鼠移植瘤块分别用多种抗细胞中间丝抗体作为一抗，SABC法常规免疫组化染色。
2 结 果
2.1NACC细胞系的形成：培养3周，组织块周围有圆形癌细胞游出。第4周末，圆形细胞开始长出突起，第9周，癌细胞融合形成大片状时开始传代。反复传代获纯净的上皮癌细胞。命名为人腭部小涎腺腺样囊性癌NACC细胞系。
2.2 NACC细胞形态学观察：细胞呈多角形镶嵌状排列，细胞质少、核大、不规则、核仁清晰，一般1～4个。细胞成分按形态可分为两种：一种细胞呈方块形、多个短突起。排列紧密呈镶嵌铺路石样，可重叠生长，接触抑制消失。重叠处细胞多呈圆形，堆积样生长，局部可呈筛孔状排列。另一种细胞呈星形、类梭形或有多突起，细胞突起较前者长，接触抑制消失的现象不明显。
, 百拇医药
透射电镜示：细胞核大、不规则。核仁多个、大、清晰、电子密度高。细胞质少，多数细胞细胞质内有丰富的糖原、大量变性的粗面内质网，见图2。
图2 NACC细胞系透射电镜 ×5000
扫描电镜：细胞相互间有较多的细胞突起、丝足、微绒毛。含两种形态细胞。方块形或类圆形细胞：突起短，微绒毛密集，遍及整个细胞。星形或类梭形细胞：突起长、大，微绒毛较前者少，胞突表面微绒毛分布少，见图3。
图3 NACC细胞系扫描电镜
2.3 NACC细胞生长特性：NACC细胞2，4，8，24 h贴壁率分别为47.5%，70%，73.8%，88.8%。生长曲线见图1。接种24 h后出现细胞分裂，分裂指数高峰在第3天，达 6.8%。染色体为非整倍体，以亚三倍体为主，各代均在90%以上。染色体维持于68～70条。
, http://www.100md.com
两种浓度的细胞接种裸鼠均可致瘤。瘤体外有薄层结缔组织包绕，瘤周及瘤内新生毛细血管丰富。瘤细胞增生活跃，核大、细胞质少，病理性核分裂象多见，瘤体周边癌细胞生长活跃，瘤组织团块样浸润包膜外肌层。
2.4 组织化学及免疫组织化学观察，见表1。
表1 各材料细胞中间丝表达 观察项目
NACC细胞裸
鼠移植瘤组织
NACC
SACC-83
keratin
-
+～++
, http://www.100md.com
++
vimentin
-
++
+
actin(smooth muscle)
++
++～+++
++
actin
-
-
+
, 百拇医药
GFAP
+
++
+++
EAM
++～+++
+++
+++
Lys
-
+++
+
S-100
, 百拇医药
+
+
++
3 讨 论
NACC细胞系供体来源明确，未经化疗、放疗。无细菌、真菌、支原体、衣原体等污染。符合建系要求。细胞呈上皮性癌的形态，贴壁率高，生长快，亚三倍体核型，传代100次以上仍保持旺盛的增殖。细胞异种移植可形成明显瘤块,瘤细胞呈恶性表现。
肿瘤的生长及转移有依赖新生血管形成[1]。NACC裸鼠移植瘤与其他恶性肿瘤一样,存在无血管的生长潜伏期和血管化期。瘤细胞具有诱导新生血管形成的特性,一旦有血管长入,瘤体生长加快。ACC诱导新生血管形成的机制及其与易沿血管、神经转移、扩散的特性的关系待探讨。Sobue[2]及Cheng等[3]均分别发现ACC细胞有较强的分泌及合成功能。在NACC细胞的电镜观察中未见明显的分泌性质的细胞器，但在培养观察中，可见到其可分泌粘液样的物质。
, 百拇医药
Chaudhry等[4]提出ACC源于多能干细胞由闰管细胞、分泌细胞、肌上皮细胞、多潜能干细胞组成。何荣根等[5]则认为ACC是由分化程度不一致和处在细胞个体发育周期不同阶段的细胞组成的非均质体。
免疫组化染色证实NACC细胞系符合腺样囊性癌细胞的特性。且与SACC-83细胞系的阳性表达相同，但在阳性程度上有所差别。培养细胞可表达细胞在体内生长时不表达的特性。keratin和vimentin的共同表达，在体内是罕见的，但对许多上皮性的细胞系来说是共同的特性。Levin等[6]对其建立的包括腺样囊性癌在内的19个良、恶性涎腺肿瘤细胞系的检测均显示两者的同时表达。vimentin可作为涎腺肿瘤中肌上皮细胞存在及分布的标志[7]。NACC及SACC-83均有较强的S-100蛋白、平滑肌特异性actin及vimentin的阳性表达，而普通actin表达弱或不表达。提示NACC，SACC-83细胞系均有肿瘤性肌上皮细胞。NACC细胞系亦为不同分化程度和发育周期的癌细胞所组成的细胞群体。方块形细胞可能为闰管细胞；星形及类梭形细胞为肌上皮细胞；核大，细胞质及细胞器少的可能为未分化多能干细胞。
, http://www.100md.com
*本课题由广西壮族自治区教育厅资助 编号 97095
参 考 文 献
1 Petruzzelli GJ.Tumor angiogenesis.Head Neck，1996,18(3):283～291
2 Sobue M,Taskeuchi J,Niwa M,et al.Establishment of a cell line producing basement membrane components from adenoid cystic carcinoma of the human salivary gland.Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol,1989,57(3):203～208
3 Cheng J,Irie T,Munakata R,et al.Biosynthesis of basement membrane molecules by salivary adenoid cystic carcinoma cells:an immunofluorescence and confocal microscopic study.Virchows Arch，1995,426(6):577～586
, http://www.100md.com
4 Chaudhry AP,Leifer C,Culter LS,et al.Histogenesis of adenoid cystic carcinoma of the salivary glands.Light and electron microscopic study.Cancer,1986,58(1):72～82
5 何荣根,张晓珊,周晓健,等.人涎腺腺样囊性癌Acc-2和Acc-3细胞系的建立及其形态学观察.华西口腔医学杂志,1988,6(1):1～3
6 Levin RJ,Bradley MK.Neuroectodermal antigens persist in benign and malignant salivary gland tumor cultures.Arch Otolaryngol Head Neck Surg,1996,122:551～557
7 de Araujo VC,Carvalho YR,de Araujo NS,et al.Actin versus vimentin in myoepithelial cells of salivary gland tumors.A comparative study.Oral Surg Oral Pathol,1994,77(4):387～391
收稿日期：1999-03-10, 百拇医药