葡萄球菌血浆凝固酶试验方法的探讨
作者：王露霞 徐德兴 石凌波 刘 刃 王春燕
单位：广州军区广州总医院检验科(510010)
关键词：血浆凝固酶；葡萄球菌；ROC曲线
广东医学990610摘要：目的 解决葡萄球菌凝固酶试验假阳性的问题，提高其检测的敏感性和特异性。方法 以试管法为金标准，对玻片法进行不同血浆稀释度试验和方法学的评价。结果 检测85株葡萄球菌凝固酶，其中检出金黄色葡萄球菌19株，溶血葡萄球菌40株，表皮葡萄球菌14株，其它葡萄球菌12株，对于玻片法不同的血浆稀释度，检出的诊断敏感性和特异性各有不同。结论 玻片法血浆浓度是否合适直接影响血浆凝固酶试验的诊断效率。通过ROC曲线显示，1∶16～1∶32为最佳稀释范围，该文选择1∶16为玻片法的血浆稀释度。
Plasma dilution in plasma coagulase test for staphycocci from clinical materials
, 百拇医药
Wang Luxia, Xu Dexing, Shi Lingbo, et al.
Guangzhou General Hospital of Guangzhou Command of PLA, Guangzhou 510010
Abstract Objective The false reaction remains one of the major factors that influence the specifity and sensitivity in detection of staphycocci from various clinical material with plasma coagulase testusing slide method.Methods The plasma concentration in standard slide method system was step-diluted up to 128 times. Eighty-five strains staphycocci isolated from clinical materials, including 19 strains S. Aureus, 40 strains S. Hemolysis, and 14 strains S. Epidermidis, were used to check the optimal concentration of the plasma in the slide method, with test tube method as standard reference in the present investigation. Results ROC plotting showed that dilution of the plasma could influence the specificity and sensitivity of the slide method. Conclusion Sixteen to 32-fold dilution of plasma is recommended as theoptimal concentration in the slide method in sight of specificity and sensitivity.
, 百拇医药
Key words Plasma coagulase test Staphycoccus ROC plotting
血浆凝固酶试验是鉴定金黄色葡萄球菌的主要试验。常用的方法有试管法血浆凝固酶试验(检测游离凝固酶)和玻片法血浆凝固酶试验(检测结合凝固酶)。许多医院的临床细菌室将玻片法血浆凝固酶试验作为常规检验方法，其优点是快速、简便，但易出现假阳性。试管法虽准确可靠，但繁琐、复杂、反应时间长，一般3 h出结果。为此，我们用临床分离的85株葡萄球菌进行不同血浆稀释度的玻片法凝固酶定性试验作方法学的评价，以试管法为金标准，并与其对照，探讨玻片法血浆凝固酶试验最佳稀释度，解决玻片法假阳性问题。
1 材料与方法
1.1 材料1.1.1 菌株来源 85株葡萄球菌从本院临床病人的血、前列腺、脑脊液、尿、脓及咽拭分离所得。
, 百拇医药
1.1.2 参考菌株 金黄色葡萄球菌ATCC25923，表皮葡萄球菌ATCC26069。
1.1.3 仪器及其它材料 Vitek-AMS自动微生物分析仪，由法国Bio Meriec公司制造。AMS：专用革兰阳性菌鉴定卡(GPI卡)。血浆：1%草酸钠抗凝人血浆，用0.9%氯化钠溶液作梯度稀释。医学试验评价系统软件，由本科提供。
1.2 方法
1.2.1 常规菌株鉴定 革兰染色镜检、触酶试验、葡萄糖O-F试验、菌落形态、溶血状态及生化反应。详见表1。
1.2.2 玻片法 分别用血浆原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64和1∶128稀释血浆1滴于清洁玻片上，各挑取1个葡萄球菌菌落与上述血浆研磨混合，然后摇匀，观察30 s，出现肉眼可见的粗大颗粒或小凝块为阳性，否则为阴性。以标准菌株金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌作阳性与阴性对照，并以同样的方法用生理盐水作空白对照。
, 百拇医药
1.2.3 试管法 取无菌试管7只，分别加入血浆原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64稀释血浆各0.5 mL，然后各管加待检的生理盐水菌悬液0.5 mL(菌液的浓度为一个麦氏单位)。实际的稀释度分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64和1∶128，混匀后放置37℃水浴中，每30 min观察一次结果。阳性者多数在30 min～2 h出现凝固。阴性者均在24 h内仍不出现凝固。同样以标准菌株金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌作阳性与阴性对照，并以同样的方法用理盐水作空白对照。
2 结果
2.1 菌种鉴定 85株葡萄球菌中有金黄色葡萄球菌19株，溶血葡萄球菌40株，表皮葡萄球菌14株，其它葡萄球菌12株，菌株的鉴定结果见表1。
表1 85株葡萄球菌菌种鉴定 菌名
, 百拇医药
例数
DNA
耐热
核酸酶
新生霉
素耐药
尿
素
磷酸
酶
精氨酸
水解
硝酸盐
水解
, 百拇医药
麦芽
糖
甘露
醇
金黄色葡萄球菌
19
+
+
-
+
+
+
+
+
, 百拇医药
溶血葡萄球菌
40
(-)
-
-
-
(-)
+
+
+
-
表皮葡萄球菌
14
v
, 百拇医药
-
-
+
(+)
+
(+)
v
-
华纳葡萄球菌
3
-
-
+
(-)
, http://www.100md.com
-
(-)
+
v
人葡萄球菌
3
-
+
-
-
腐生葡萄球菌
2
-
-
, 百拇医药
+
-
-
-
+
+
松鼠葡萄球菌
2
-
头状葡萄球菌
1
-
-
-
, 百拇医药
+
-
+
模仿葡萄球菌
1
-
-
+
-
-
+
+
注：(-)表示绝大多数为阴性 (+)表示绝大多数为阳性 v表示不定
, 百拇医药
2.2 85株葡萄球菌血浆梯度稀释结果 将85株葡萄球菌进行玻片法和试管法血浆不同稀释度凝固酶试验，血浆不同稀释度其敏感性和特异性各有差异，结果见表2。
表2 85株葡萄球菌玻片法血浆梯度稀释结果
玻 片 法
血浆原液
1∶2
1∶4
1∶8
1∶16
1∶32
1∶64
1∶128
, 百拇医药
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
, http://www.100md.com
+
-
试管法
有
19
0
19
0
19
0
19
0
19
0
, 百拇医药
18
1
17
2
16
3
无
44
22
44
22
33
33
19
, 百拇医药
47
3
63
0
66
0
66
0
66
敏感性(%)
100
100
100
100
, http://www.100md.com
100
95
89
84
特异性(%)
33
33
50
71
95
100
100
100
, 百拇医药 注：+表示阳性 -表示阴性
2.3 ROC曲线 根据表2的结果，我们以假阳性率为横坐标，真阳性率为纵坐标，绘制出ROC曲线(receiver operating charateristic curve)[1]，见图1，从ROC曲线可见1∶6～1∶32为最佳稀释范围。
图1 ROC曲线
3 讨论
随着葡萄球菌鉴定的临床意义日益受到重视，其鉴定技术得到不断发展，尽管目前开展了分子水平和细胞壁化学组成鉴定葡萄球菌、溶菌素(Lyso-staphin)溶菌试验等，但限于各种条件难以普及。常规工作需要选择一些方法快速、简便、重复性好、特异性强、敏感性高，并能在普通试验室中应用的检测方法。玻片法血浆凝固酶试验是鉴定金黄色葡萄菌球应用已久的方法，虽然此法快速、简便，但易出现假阳性。据资料介绍用未经稀释的血浆做玻片法凝固酶，蛋白A含量高的菌株会出现假阳性。本试验用玻片法按不同血浆浓度来检测凝固酶，并与试管法比较。从表2可见，对于血浆不同的稀释度，其敏感性和特异性各有差异。ROC结果显示：1∶16～1∶32为最佳稀释范围。其中1∶16的诊断敏感性高于1∶32(5%)，而特异性又小于1∶32(5%)，说明1∶16有5%假阳性率，1∶32的血浆又有5%假阴性率。从临床诊断试验选择看，可以将1∶16的血浆稀释度作为玻片法的稀释度。但如何选择一个最佳稀释度尚待进一步研究。
, 百拇医药
长期以来，临床细菌室鉴定金黄色葡萄球菌玻片法大多采用一滴盐水与1～2个菌落直接在玻片上混合，然后再加一滴血浆混匀的方法。据我们的观察，这样会使假阳性率增高(67%)。我们选择1∶16的血浆稀释度可较大地降低假阳性率(5%)，较好地解决玻片法假阳性的问题，获得了满意的效果，明显提高了检测的准确性。
本组检测85株葡萄球菌中金黄色葡萄球菌19株，玻片法与试管法的符合率为100%，此结果与文献报道一致[2]。66株其它葡萄球菌中有44株假阳性(66.7%)，其中溶血葡萄球菌37株，占84.1%(37/44)，提示溶血葡萄球菌更易出现假阳性。在1996年广东省第四季度质控中，我们曾检测一株编号为A1076的菌株，经鉴定为葡萄球菌时，我们做玻片法血浆凝固酶1∶8凝，1∶16不凝。同时做试管法及生化、Vitek等，试管法血浆凝固酶不凝，我们报溶血葡萄球菌，结果与室间质控回报一致。当时此菌株的全省鉴定完全符合率只有18%。室间质评分析中提到：本菌不少实验室鉴定为金黄色葡萄球菌，主要原因是凝固酶试验没做好，用玻片法做此试验时所用的血浆一定要稀释(约4倍)。据我们对此株菌做玻片法血浆凝固酶观察，血浆稀释4倍尚凝固，所以适当稀释血浆尤为重要。
, 百拇医药
试管法凝固酶血浆不同稀释度对于非金黄色葡萄球菌都表现出不凝固，对于金黄色葡萄球菌在1∶2～1∶64范围内都表现出凝固，为了减少试验不必要的繁琐，依据常规方法试管法血浆凝固酶试验血浆1∶4稀释。
文献报道临床上葡萄球菌感染以金黄色葡萄球菌占首位，其次是凝固酶阴性葡萄球菌中的表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌。本实验结果以溶血葡萄球菌占首位，与文献报道有差异[3]。分析原因可能与标本来源有关，本组85例标本中以前列腺液标本为主，而前列腺液分离出的葡萄球菌中又以溶血葡萄球菌占首位。与文献报道有一定的差异[4]。
*广州医学院检验系实习生
参考文献
1 林龙顺，温 畅，主编.实用医学检验计算.上海：上海科学技术文献出版社，1990.286～288
2 杨素贞，赵乃江，田湘青，等.临床292株葡萄球菌的实验研究.上海医学检验杂志，1994，(2)：85
3 王建升，张立志，曹月升，等.前列腺液细菌学培养及药敏分析.临床检验杂志，1996，14(16)：335
4 钟品玲，黄敏承.526例前列腺液细菌培养阳性结果分析.广西医学，1994，16(5)：327, http://www.100md.com
单位：广州军区广州总医院检验科(510010)
关键词：血浆凝固酶；葡萄球菌；ROC曲线
广东医学990610摘要：目的 解决葡萄球菌凝固酶试验假阳性的问题，提高其检测的敏感性和特异性。方法 以试管法为金标准，对玻片法进行不同血浆稀释度试验和方法学的评价。结果 检测85株葡萄球菌凝固酶，其中检出金黄色葡萄球菌19株，溶血葡萄球菌40株，表皮葡萄球菌14株，其它葡萄球菌12株，对于玻片法不同的血浆稀释度，检出的诊断敏感性和特异性各有不同。结论 玻片法血浆浓度是否合适直接影响血浆凝固酶试验的诊断效率。通过ROC曲线显示，1∶16～1∶32为最佳稀释范围，该文选择1∶16为玻片法的血浆稀释度。
Plasma dilution in plasma coagulase test for staphycocci from clinical materials
, 百拇医药
Wang Luxia, Xu Dexing, Shi Lingbo, et al.
Guangzhou General Hospital of Guangzhou Command of PLA, Guangzhou 510010
Abstract Objective The false reaction remains one of the major factors that influence the specifity and sensitivity in detection of staphycocci from various clinical material with plasma coagulase testusing slide method.Methods The plasma concentration in standard slide method system was step-diluted up to 128 times. Eighty-five strains staphycocci isolated from clinical materials, including 19 strains S. Aureus, 40 strains S. Hemolysis, and 14 strains S. Epidermidis, were used to check the optimal concentration of the plasma in the slide method, with test tube method as standard reference in the present investigation. Results ROC plotting showed that dilution of the plasma could influence the specificity and sensitivity of the slide method. Conclusion Sixteen to 32-fold dilution of plasma is recommended as theoptimal concentration in the slide method in sight of specificity and sensitivity.
, 百拇医药
Key words Plasma coagulase test Staphycoccus ROC plotting
血浆凝固酶试验是鉴定金黄色葡萄球菌的主要试验。常用的方法有试管法血浆凝固酶试验(检测游离凝固酶)和玻片法血浆凝固酶试验(检测结合凝固酶)。许多医院的临床细菌室将玻片法血浆凝固酶试验作为常规检验方法，其优点是快速、简便，但易出现假阳性。试管法虽准确可靠，但繁琐、复杂、反应时间长，一般3 h出结果。为此，我们用临床分离的85株葡萄球菌进行不同血浆稀释度的玻片法凝固酶定性试验作方法学的评价，以试管法为金标准，并与其对照，探讨玻片法血浆凝固酶试验最佳稀释度，解决玻片法假阳性问题。
1 材料与方法
1.1 材料1.1.1 菌株来源 85株葡萄球菌从本院临床病人的血、前列腺、脑脊液、尿、脓及咽拭分离所得。
, 百拇医药
1.1.2 参考菌株 金黄色葡萄球菌ATCC25923，表皮葡萄球菌ATCC26069。
1.1.3 仪器及其它材料 Vitek-AMS自动微生物分析仪，由法国Bio Meriec公司制造。AMS：专用革兰阳性菌鉴定卡(GPI卡)。血浆：1%草酸钠抗凝人血浆，用0.9%氯化钠溶液作梯度稀释。医学试验评价系统软件，由本科提供。
1.2 方法
1.2.1 常规菌株鉴定 革兰染色镜检、触酶试验、葡萄糖O-F试验、菌落形态、溶血状态及生化反应。详见表1。
1.2.2 玻片法 分别用血浆原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64和1∶128稀释血浆1滴于清洁玻片上，各挑取1个葡萄球菌菌落与上述血浆研磨混合，然后摇匀，观察30 s，出现肉眼可见的粗大颗粒或小凝块为阳性，否则为阴性。以标准菌株金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌作阳性与阴性对照，并以同样的方法用生理盐水作空白对照。
, 百拇医药
1.2.3 试管法 取无菌试管7只，分别加入血浆原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64稀释血浆各0.5 mL，然后各管加待检的生理盐水菌悬液0.5 mL(菌液的浓度为一个麦氏单位)。实际的稀释度分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64和1∶128，混匀后放置37℃水浴中，每30 min观察一次结果。阳性者多数在30 min～2 h出现凝固。阴性者均在24 h内仍不出现凝固。同样以标准菌株金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌作阳性与阴性对照，并以同样的方法用理盐水作空白对照。
2 结果
2.1 菌种鉴定 85株葡萄球菌中有金黄色葡萄球菌19株，溶血葡萄球菌40株，表皮葡萄球菌14株，其它葡萄球菌12株，菌株的鉴定结果见表1。
表1 85株葡萄球菌菌种鉴定 菌名
, 百拇医药
例数
DNA
耐热
核酸酶
新生霉
素耐药
尿
素
磷酸
酶
精氨酸
水解
硝酸盐
水解
, 百拇医药
麦芽
糖
甘露
醇
金黄色葡萄球菌
19
+
+
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, 百拇医药
溶血葡萄球菌
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表皮葡萄球菌
14
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华纳葡萄球菌
3
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人葡萄球菌
3
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腐生葡萄球菌
2
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, 百拇医药
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松鼠葡萄球菌
2
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头状葡萄球菌
1
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模仿葡萄球菌
1
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注：(-)表示绝大多数为阴性 (+)表示绝大多数为阳性 v表示不定
, 百拇医药
2.2 85株葡萄球菌血浆梯度稀释结果 将85株葡萄球菌进行玻片法和试管法血浆不同稀释度凝固酶试验，血浆不同稀释度其敏感性和特异性各有差异，结果见表2。
表2 85株葡萄球菌玻片法血浆梯度稀释结果
玻 片 法
血浆原液
1∶2
1∶4
1∶8
1∶16
1∶32
1∶64
1∶128
, 百拇医药
+
-
+
-
+
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+
-
+
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+
-
, http://www.100md.com
+
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试管法
有
19
0
19
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19
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, 百拇医药
18
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44
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, 百拇医药
47
3
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敏感性(%)
100
100
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, http://www.100md.com
100
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特异性(%)
33
33
50
71
95
100
100
100
, 百拇医药 注：+表示阳性 -表示阴性
2.3 ROC曲线 根据表2的结果，我们以假阳性率为横坐标，真阳性率为纵坐标，绘制出ROC曲线(receiver operating charateristic curve)[1]，见图1，从ROC曲线可见1∶6～1∶32为最佳稀释范围。
图1 ROC曲线
3 讨论
随着葡萄球菌鉴定的临床意义日益受到重视，其鉴定技术得到不断发展，尽管目前开展了分子水平和细胞壁化学组成鉴定葡萄球菌、溶菌素(Lyso-staphin)溶菌试验等，但限于各种条件难以普及。常规工作需要选择一些方法快速、简便、重复性好、特异性强、敏感性高，并能在普通试验室中应用的检测方法。玻片法血浆凝固酶试验是鉴定金黄色葡萄菌球应用已久的方法，虽然此法快速、简便，但易出现假阳性。据资料介绍用未经稀释的血浆做玻片法凝固酶，蛋白A含量高的菌株会出现假阳性。本试验用玻片法按不同血浆浓度来检测凝固酶，并与试管法比较。从表2可见，对于血浆不同的稀释度，其敏感性和特异性各有差异。ROC结果显示：1∶16～1∶32为最佳稀释范围。其中1∶16的诊断敏感性高于1∶32(5%)，而特异性又小于1∶32(5%)，说明1∶16有5%假阳性率，1∶32的血浆又有5%假阴性率。从临床诊断试验选择看，可以将1∶16的血浆稀释度作为玻片法的稀释度。但如何选择一个最佳稀释度尚待进一步研究。
, 百拇医药
长期以来，临床细菌室鉴定金黄色葡萄球菌玻片法大多采用一滴盐水与1～2个菌落直接在玻片上混合，然后再加一滴血浆混匀的方法。据我们的观察，这样会使假阳性率增高(67%)。我们选择1∶16的血浆稀释度可较大地降低假阳性率(5%)，较好地解决玻片法假阳性的问题，获得了满意的效果，明显提高了检测的准确性。
本组检测85株葡萄球菌中金黄色葡萄球菌19株，玻片法与试管法的符合率为100%，此结果与文献报道一致[2]。66株其它葡萄球菌中有44株假阳性(66.7%)，其中溶血葡萄球菌37株，占84.1%(37/44)，提示溶血葡萄球菌更易出现假阳性。在1996年广东省第四季度质控中，我们曾检测一株编号为A1076的菌株，经鉴定为葡萄球菌时，我们做玻片法血浆凝固酶1∶8凝，1∶16不凝。同时做试管法及生化、Vitek等，试管法血浆凝固酶不凝，我们报溶血葡萄球菌，结果与室间质控回报一致。当时此菌株的全省鉴定完全符合率只有18%。室间质评分析中提到：本菌不少实验室鉴定为金黄色葡萄球菌，主要原因是凝固酶试验没做好，用玻片法做此试验时所用的血浆一定要稀释(约4倍)。据我们对此株菌做玻片法血浆凝固酶观察，血浆稀释4倍尚凝固，所以适当稀释血浆尤为重要。
, 百拇医药
试管法凝固酶血浆不同稀释度对于非金黄色葡萄球菌都表现出不凝固，对于金黄色葡萄球菌在1∶2～1∶64范围内都表现出凝固，为了减少试验不必要的繁琐，依据常规方法试管法血浆凝固酶试验血浆1∶4稀释。
文献报道临床上葡萄球菌感染以金黄色葡萄球菌占首位，其次是凝固酶阴性葡萄球菌中的表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌。本实验结果以溶血葡萄球菌占首位，与文献报道有差异[3]。分析原因可能与标本来源有关，本组85例标本中以前列腺液标本为主，而前列腺液分离出的葡萄球菌中又以溶血葡萄球菌占首位。与文献报道有一定的差异[4]。
*广州医学院检验系实习生
参考文献
1 林龙顺，温 畅，主编.实用医学检验计算.上海：上海科学技术文献出版社，1990.286～288
2 杨素贞，赵乃江，田湘青，等.临床292株葡萄球菌的实验研究.上海医学检验杂志，1994，(2)：85
3 王建升，张立志，曹月升，等.前列腺液细菌学培养及药敏分析.临床检验杂志，1996，14(16)：335
4 钟品玲，黄敏承.526例前列腺液细菌培养阳性结果分析.广西医学，1994，16(5)：327, http://www.100md.com